钒钛磁铁废矿土壤中根瘤菌的捕获及其共生固氮效应

根瘤菌与豆科植物共生能提供植物氮营养、增强植株抗逆性、增加土壤氮积累因而被应用于重金属污染土壤的生物修复中,为筛选出重金属耐受性强的土著根瘤菌应用于钒钛磁铁废矿土壤的生物修复,以钒钛磁铁废矿土壤作为基质进行大豆和豇豆盆栽实验捕获根瘤内生细菌,并通过分子鉴定筛选出根瘤菌,再测试根瘤菌的共生固氮效应.大豆和豇豆的盆栽捕获实验分离获得43株根瘤内生菌,BOX-A1R PCR电泳图谱聚类分析在84%相似水平上聚类为13个群,从13个类群中选取大豆和豇豆根瘤内生代表菌株进行16SrDNA测序和系统发育树的构建,结果表明只有类群8上的两株代表菌株(ms12-11,syj1)是根瘤菌,属于慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium).在盆栽回接实验中,ms12-11和syj1均能在贫瘠且重金属含量高的废矿土壤中与大豆和豇豆共生结瘤固氮,但ms12-11的固氮效率明显高于syj1;由于重金属的胁迫压力,播种于废矿土中的大豆和豇豆固氮效率明显低于蛭石中的大豆和豇豆固氮效率.综上表明钒钛磁铁废矿土壤中含有丰富的根瘤菌资源,能在逆境环境下与豆科植物共生固氮,增强植物抗逆性.     

与黑龙江大豆主栽品种匹配的优良根瘤菌筛选与鉴定

根瘤菌剂在大豆上能否充分发挥共生固氮效应涉及到根瘤菌的结瘤固氮能力、与大豆品种的匹配性、土壤特性等多种因素.黑龙江省是我国大豆的主产区之一,为筛选得到适于在黑龙江推广应用的根瘤菌资源,从黑龙江、河北和湖南等地区采集土壤样品,采用大豆结瘤法,从10个土样中分离获得59株大豆根瘤菌株,再依据BTB显色反应和16S r DNA分析,鉴定出36个慢生型大豆根瘤菌.沙培结果表明,有34株根瘤菌能够在大豆品种黑农61上有效结瘤;再从中选出4株共生效应较好的菌株做进一步实验.匹配实验表明,这4株菌SN2-5、NW5-3、SN7-2和SN10-3同样能与黑龙江另外16个主栽大豆品种结瘤;与不接根瘤菌的对照组相比,SN2-5、NW5-3、SN7-2和SN10-3处理的大豆的根瘤固氮酶活和生物量显著提高,且整体表型优于HN01和USDA110.土壤盆栽实验结果表明,NW5-3、SN10-3、SN7-2在黑土中具有显著的接种效果,且在10 mmol/L NH_4NO_3高氮处理下,4个优良供试菌均能够与黑农61结瘤.与不加氮素的处理相比,其中NW5-3和SN10-3形成根瘤具有近50%的固氮酶活性.本研究筛选的4个慢生型大豆根瘤菌SN2-5、NW5-3、SN7-2、SN10-3与黑龙江的主栽大豆品种具有良好匹配性能,可进一步用于黑龙江大豆产区的田间实验.     

水稻内生粘着剑菌的分子系统发育分析

通过16S rRNA基因和看家基因recA、atpD、rpoB的序列测定与分析,及(G+C)mol%测定等技术,对分离自河北省滦南县水稻根内的两株细菌进行分子系统发育学研究.根据系统进化树构建及其同源性分析,可确定所分离的两株水稻内生细菌属于剑菌属(Ensifer)系统发育分支;供试菌株的各保守序列与粘着剑菌(E.adhaerens)模式菌种同源性最高,除recA为97.2%外,其他均为99%～100%,可以确定供试菌属于E.adhaerens;对所分离的菌株与大豆、菜豆、三叶草、苜蓿等4种豆科植物进行结瘤试验,结果显示其中一株J3-N55可与苜蓿结瘤.野生型的E.adhaerens菌株与豆科植物结瘤的报道尚为鲜见;本文首次报道从水稻植株内分离到E.adhaerens菌株.     

紫云英根瘤菌的系统发育多样性

在筛选根瘤菌与不同紫云英品种高效结瘤的基础上,通过16S rRNA基因序列分析,对13株共生结瘤效果好的菌种进行了系统发育研究.结果表明,13株菌属于3个主要聚类群,分别与Mesorhizobium、Agrobacterium和Stenotrophomonas亲缘关系最为接近,种类多样性较为丰富;其中编号为ACCC13065株的菌株与S.rhizophila16S rDNA序列相似性为100%,位于γ-变形菌纲,这是除α-变形亚纲、β-变形亚纲外所发现的一类新的根瘤菌类型.     

根瘤菌的遗传多样性与系统发育研究进展

根瘤菌 (ｒｈｉｚｏｂｉａ)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌。它可以侵染豆科植物根部或茎部形成根瘤和少数茎瘤 ,固定空气中的分子态氮形成氨 ,为植物提供氮素营养 .据估计 ,全球每年生物固氮量达 1.75× 10 8ｔ,为世界工业氮肥产量的4 .37倍[1] .根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用是生物固氮中固氮效率最高的体系 .因此 ,根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用是实现农业可持续发展的重大研究课题之一 .研究根瘤菌的遗传多样性 ,对于发掘新的根瘤菌种质资源 ,保藏并合理利用根瘤菌基因资源库 ,选育高效菌株直接应用于农业生产有重要意义 .…     

豆科植物对根际土壤微生物种群及代谢的影响

自然界中很多种类的植物与固氮微生物共生,故其自身可进行氮同化,尤以豆科植物为甚。豆科植物由于与固氮微生物共生,所以豆科植物根际土壤的氮素较高于非固氮类植物种类。由于氮素是微生物代谢必需的营养元素之一,所以,豆科植物与非豆科植物的根际微环境存在一定的差异,自然而然两者根际土壤微生物的种群数量及其代谢活性也应存在一定的差异。基于此,本研究拟选取两种豆科植物(合欢Albizia julibrissin和豌豆Pisum sativum)及两种非豆科植物(樱花Prunus serrulata和艾蒿Artemisia argyi)的根际土壤微生物为研究对象,以平板梯度稀释法测定其种群数量,并通过测定纤维素酶、转化酶、脲酶、硝酸还原酶和酸性磷酸酶的活性为切入点分析其代谢活性,进而分析豆科植物对根际土壤微生物种群数量及其代谢的影响。本研究结果显示豆科植物的根际土壤细菌和真菌数量显著低于非豆科植物的。木本非豆植物和木本豆科植物根际土壤放线菌数量无显著差异,但是草本豆科植物根际土壤放线菌数量却显著高于草本非豆科植物的。另外,豆科植物根际土壤纤维素酶、转化酶、硝酸还原酶和酸性磷酸酶活性均显著大于非豆科植物的,而豆科植物根际土壤脲酶活性却显著低于非豆科植物的。另外,转化酶和脲酶活性与真菌数量呈显著相关。     

芘污染土壤的根瘤菌-植物修复效应研究

土壤多环芳烃(PAHs)的污染已经成为了全球性的热点问题,微生物-植物联合修复技术是解决土壤有机污染的一种低耗高效的新型修复技术。以往作为目标污染物,绿豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum),紫花苜宿根瘤菌(Rhizobium meliloti)为供试微生物,选用绿豆(Vigna radiata L.)、紫花苜蓿(Medicago sativa L.),黑麦草(Lolium perenne L.)和花生(Arachis hypogaea L.)作为修复植物。采用盆栽实验,研究在100 mg·kg-1污染条件下,接种根瘤菌对植物修复法污染土壤效果的影响。结果表明:培养60d后,4种植物均提高了芘污染土壤的pH,并提高了土壤脱氢酶的活性,其中种植绿豆的效果最好,其次为花生。此外,4种植物均提高了土壤中芘的去除率,提高幅度依次为绿豆(33.70%)花生(21.63%)黑麦草(10.55%)苜蓿(7.72%)。接种根瘤菌后发现,绿豆和花生根瘤数显著高于对照组,苜蓿与根瘤菌没有结合,而黑麦草则不和根瘤菌共生。根瘤菌对土壤中pH有一定的提高作用,但效果不显著。此外,根瘤菌提高了绿豆、花生和紫花苜蓿的生物量以及绿豆和花生处理组土壤的脱氢酶活性。并提高了绿豆和花生对土壤中芘的去除率,分别为4.10%和2.02%。研究表明:种植绿豆对土壤芘的去除率最高(94.63%),根瘤菌能与其根系结合良好,强化了绿豆修复芘污染土壤的能力,结果可为微生物-植物修复芘污染土壤提供新的参考。     

应用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记技术验证含羞草根瘤菌的结瘤能力

对云南省热带及亚热带地区的含羞草根瘤菌进行了分离,选择其中40株菌为接种菌株,通过结瘤试验并采用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记方法研究了其结瘤能力.经过结瘤试验,发现除菌株SWF66075和SWF66093没有结瘤外,其它38株菌株均与含羞草植物结瘤.结瘤率为95%.从结瘤试验所获根瘤中,分离得到结瘤菌株,采用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记对结瘤菌株与接种菌株进行了比较研究.蛋白图谱及聚类分析显示,26株接种菌株与其结瘤菌株的全细胞蛋白分子图谱完全相同,在100%的相似水平上与其结瘤菌株聚在一起,说明宿主植物所形成的根瘤确系接种菌株侵入所致,因而可将这些菌株确认为根瘤菌菌株;而SWF66012、SWF66029、SWF66044和SWF66058等12株菌株的结瘤菌株与其各自接种菌株的全细胞蛋白图谱存在较大差异,推测这12株接种菌株与其结瘤菌株可能不是同一菌株,尚不能确定它们与含羞草植物的结瘤能力,这些菌株是否为根瘤菌菌株仍需进一步验证.研究结果表明,全细胞蛋向SDS-PAGE分子标记技术是一种快速、准确地验证根瘤菌结瘤能力的方法.该方法进一步完善了结瘤试验,并初步揭示了根瘤菌的竞争结瘤能力,适用于对大量根瘤内分离菌株进行根瘤菌的证实研究.图2参28     

氢气对刺槐根际土壤微生物种群和土壤酶活性的影响

模拟豆科植物根瘤在固氮过程中释放氢气,分析其对根际土壤产生的影响.从黄土高原人工刺槐林采集有根瘤的刺槐根际土壤样品,采用电解水产生氢气分次处理,对处理后与未处理的土壤样品内微生物种群数量、微生物代谢强度及土壤脱氢酶、过氧化氢酶、脲酶、转化酶等指标进行比较分析.氢气处理后的两批土样中,氢氧化细菌数量均显著增多,分别占9月、5月土壤微生物总量的34.9%和32.4%;微生物在土壤中代谢强度分别增加了140.2%和57.6%;土壤脱氢酶、过氧化氢酶、脲酶和转化酶含量均表现增加,其中9月处理土壤分别增加36.6%、57.1%、26.6%和147.0%,5月处理土壤分别增加37.2%、6.6%、108.8%和147.0%.研究结果为根瘤固氮过程中产生氢气对根际土壤微环境的影响及促生机制提供了实验资料.图2表3参14     

基于根瘤菌来源的ACC脱氨酶基因提高大豆和紫云英根瘤菌的竞争结瘤能力

根瘤菌的竞争结瘤能力提高对提高接种剂的应用效果至关重要.为提高根瘤菌的共生固氮和竞争结瘤能力,从大豆慢生型根瘤菌USDA110中扩增1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶)基因和其上游调控序列,通过两亲本接合转移导入华癸中慢生根瘤菌7653R、大豆快生型根瘤菌HH103和SMH12,构建含有ACC脱氨酶的重组根瘤菌.结果显示:在土壤盆栽条件下,接种导入ACC脱氨酶的重组菌7653R,宿主植物地上鲜重、瘤数、瘤重和固氮酶活均显著增加,竞争结瘤能力提高22.6%;接种重组菌HH103,植物地上鲜重、瘤重和酶活显著增加,瘤数增加,竞争结瘤能力提高28.9%;接种重组菌SMH12,植物地上鲜重、瘤数、瘤重和酶活增加,未到达显著性,但竞争结瘤能力提高25.4%.本研究表明构建的3个重组根瘤菌具有良好的共生固氮和竞争结瘤能力,可作为有潜力的优良菌株应用到田间试验.(图10表2参32)     

不同根瘤菌中突变cysDN基因对硫酸盐同化途径的影响

硫是生物体必须的元素,根瘤菌结瘤因子的硫化修饰与其宿主范围和识别效率有着重要关系,实验室前期研究中突变费氏中华根瘤菌的cys DN基因后,突变体不能利用硫酸盐生长,这与Sinorhizobium sp.BR816的cys D基因突变后的现象不同,两株菌的硫酸盐同化途径中可能存在差异.为探讨不同根瘤菌cys DN基因对硫酸盐同化途径的影响,本研究利用同源交换的方法构建费氏中华根瘤菌WGF03、费氏中华根瘤菌HN01、苜蓿中华根瘤菌14500及大豆慢生根瘤菌15606的cys DN突变体,Δcys DN-WGF03、Δcys DN-HN01、Δcys DN-14500和cys NR-15606,对突变体的硫源利用情况和植株结瘤情况进行研究.结果发现,Δcys DN-WGF03和Δcys DN-HN01失去利用硫酸盐的能力;Δcys DN-14500能微弱地利用硫酸盐生长,生长量约为野生菌株的1/3左右;cys NR-15606对硫酸盐的利用与野生菌株相比无明显差别.植株实验结果显示,Δcys DN-WGF03、Δcys DN-HN01和Δcys DN-14500在平均瘤数、平均瘤重、平均植株干重和固氮酶活性方面均表现出显著降低,而突变体的回补体能够恢复硫酸盐的利用能力及与植株的共生固氮能力.这说明cys DN基因在费氏中华根瘤菌WGF03、费氏中华根瘤菌HN01和苜蓿中华根瘤菌14500硫酸盐同化途径中起着关键影响,而该基因在大豆慢生根瘤菌15606的影响并不明显.本研究表明,cys DN基因在不同根瘤菌中所起的作用不同,不同根瘤菌的硫酸盐同化方式也存在差异.     

我国蚕豆根瘤菌的多样性和系统发育研究

采用数值分类、16S rDNA PCR-RFLP、IGS PCR-RFLP等方法对分离自我国11个省的50株蚕豆根瘤菌及11株参比菌株进行了表型测定和遗传型研究,同时对5株蚕豆根瘤菌的代表菌株进行了16S rDNA全序列测定.表型测定的结果表明,在80%的相似水平上供试菌株分为4个群,各群间存在地区交叉;16S rDNA PCR-RFLP的聚类结果与数值分类的聚类结果有很好的一致性;IGSRFLP反映的多样性更明显,形成的遗传群较多,可用于菌株间的鉴别.实验结果表明我国蚕豆根瘤菌具有极大的表型多样性和遗传多样性.系统发育研究结果表明,蚕豆根瘤菌的代表菌株均位于快生根瘤菌属(Rhizobium)系统发育分支,与R.leguminosarum USDA2370的全序列相似性达99.9%,说明蚕豆根瘤菌属于Rhizobium,系豌豆根瘤菌的一个生物型.图4表3参12     

四川盆地大豆根瘤内生细菌的分离鉴定及促生效果

以四川盆地大豆根瘤为材料,采用划线法分离内生细菌、16S rDNA PCR-RFLP分析其遗传多样性,并结合菌株促生特性和盆栽试验筛选优良促生菌.从分离获得的130株内生细菌中选取了40株细菌作为供试菌株,16S rDNA序列表明分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium).以大豆为供试作物筛选出了12株具有促生能力的细菌,所有菌株均能分泌吲哚-3-乙酸(IAA),浓度达到0.353-32.404μg/mL;7株能产铁载体,活性单位为7.35%-34.31%;有11株具有溶磷能力,溶磷量达到4.26-10.6μg/mL;6株具有固氮能力.接种12株供试菌株后,玉米的农艺性状、植株全氮和全磷含量均优于单施化肥处理,其中菌株DA16-5效果最好,表现出良好的促生潜力.综上,四川盆地大豆根瘤内生菌遗传多样性丰富并且普遍具有促生能力,是重要的生物资源.     

慢生根瘤菌DG的分离、鉴定及其与降香黄檀的共生关系

从大果紫檀根瘤中分离到一株慢生型根瘤菌DG,通过其形态特征观察、保守基因序列分析以及生物学特性研究等方面进行种类鉴定,通过结瘤试验了解DG与降香黄檀的共生关系,并探讨其共生固氮能力.16S rRNA、nifH和dnaK系统发育结果表明,该菌株与Bradyrhizobium elkanii同源性最高.菌株DG与B,elkanii USDA76T在碳源利用、抗生素抗性、耐受NaCl等生物学特性上基本一致,而且还能在pH 10.0下良好生长.结瘤试验显示,菌株DG能在降香黄檀根部结瘤;接种DG的降香黄檀幼苗植株的株高、干重以及全氮含量(P<0.05)显著高于对照处理,表明DG能与降香黄檀形成良好的共生关系,且具有高效的固氮能力.图4表2参27     

兰坪铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌的多样性及抗性研究

对兰坪铅锌尾矿区自然发生的植物进行调查,共发现18种植物,分属于10科。对野豇豆（Vigna vexiauata（Linn.）Bench.）、长波叶山蚂蝗（Desmodium sequax Wall.）、三叶草（Trifolium pratense Linn.）、白刺花（Sophora davii（franch.）Skeels）、密花序黄芪（Astragalus forrestii Simpson.）、美丽胡枝子（Lespedeza Formosa（Vog.）Koehne.）6种8株豆科植物根瘤进行根瘤菌的分离纯化,共得到419株细菌,经镜检初步确定有94株为根瘤菌。对其中31株根瘤菌的淀粉水解、糖发酵等12项生理生化指标进行测定,并以平均连锁法进行聚类分析。结果表明,兰坪铅锌尾矿区31株根瘤菌在50%的相似水平上可分为6个类群,其表型特性存在明显差异,同一种植物中可能存在不同代谢类型的根瘤菌,同一种代谢类型的根瘤菌也可与不同植物共生。抗逆性测定结果表明,菌株（4G.7、5.4.3、7.4.3）对温度、（4A.12、4G.7、4G.10、5.4.3）对pH、（3.7.9、5.4.3）对盐、（3.7.19、4A.12、6.1.2、6.1.13）对抗生素有较强耐受性或抗性,大多数菌株能在较宽的温度、盐度和pH范围内生长。     

山西根瘤菌资源多样性与特异性研究

从山西不同生态条件下,采集豆科植物根瘤,经分离、纯化、回接原寄主,获得来自３１属７１种豆科植物寄主的纯根瘤菌株２１２株．对１５４株进行了ＢＴＢ反应和生长速度测定,在ＹＭＡ培养基上产酸快生型占９７．４％．选用了其中５０株,以快生型苜蓿根瘤菌（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）和豌豆根瘤菌（Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）各３株为ＣＫ,进行了其它生理生化鉴定．结果表明,５６株参试菌株均不产生３－酮基乳糖．山西分离的菌株能在蛋白胨肉汤上生长的１３株;能利用柠檬酸盐的７株;石蕊牛奶反应,产酸的１２株,其中酸凝的８株,产碱的３０株,其中胨化的１１株,石蕊还原的７株．唯一碳源和氮源利用比ＣＫ更广泛．对温度的适应范围宽．比ＣＫ有更强的耐盐、耐碱和对抗菌素的耐受能力     

花生根瘤菌的生长特性和脂肪酸组成研究(英文)

用73株慢生根瘤菌B．Japonicum、B．elkanii和B．"intermedium"为对照．对22株花生根瘤菌的生长速度、产碱能力和细胞脂肪酸组成进行了测定．结果表明：花生根瘤菌属于慢生根瘤菌属（Bradyrhizobiumsp．arachis）；除花生根瘤菌含有比大豆根瘤菌（B．japonicum）较高的脂肪酸16：1w5c（16个碳原子1个双键的脂肪酸）而外，花生根瘤菌与大豆根疚菌相似，表明了他们在系统发育及进化方向上的一致性．细胞脂肪酸分析法是根瘤菌系统发育研究中一种简便而可信的方法．     

紫云英根瘤菌共生基因分布及其共生效应的多样性

从同一植株不同根瘤分离40株紫云英根瘤菌，所有菌株对10种抗生素的抗药性测定表明，该群体分为22个抗药类群，质粒检测显示所有公离株都含有质粒，质粒数1～4条，用快生型大豆根瘤菌USDA205质粒作参考，估测质粒Mr分布范围为83～226MU．根据图谱分析表明，该菌群可分为6个不同质粒型．各类型质粒通过与Dig-nodABC和Dig-nifHDK杂交，结果显示带有1条质粒的菌株其共生基因定位在染色体上．带有2条或2条以上质粒的菌株各拥有1条共生质粒，共生质粒Mr范围有差异，大约为117～220MU．研究结果也显示，不同质粒型的菌株其共生效应存在明显差异，其中第6质粒型的菌株共生固氮率最强，第1质粒型菌株共生固氮率较低．共生固氮能力最强的第6质粒型菌株，只占总菌数7．5％．     

干旱地区几种豆科植物根瘤菌的数值分类和SDS-PAGE全细胞蛋白电泳分析

从新疆、内蒙干旱地区苜蓿属、草木樨属、锦鸡儿属植物的根瘤中分离出５４株根瘤菌，对其中４８株根瘤菌和２２株参比菌一起进行了数值分类研究，在８５％的相似性水平上，未知菌分为３个不同于已知种的新群．另加入６株分离自锦鸡儿属植物的根瘤菌，共７６株菌进行了全细胞蛋白ＳＤＳＰＡＧＥ分析，在８０％的相似性水平上，已知菌相应成群，未知菌除ＸＪ９６３４２在６８％的相似性水平上和群５、６、７、８、Ｒ．ｇａｌｅｇａ聚群外，其余未知菌则分布在４、５、６、７、８、９、１０七个群中．群４中所有菌株属于数值分类的群１；群６中有３株菌属于数值分类的群３；群９中有８株菌为数值分类群２的菌株．反映了两种方法在分类上得到的结果比较近似．     

慢生型大豆根瘤菌的遗传多样性研究

采用选择性扩增片断长度多态性 (简称AFLP)DNA指纹技术对来自泰国北部的 2 45株慢生型大豆根瘤菌进行遗传多样性的研究 .通过AFLP图谱揭示出该地区的慢生型大豆根瘤菌有较显著的遗传多样性 .从 2 45株中选择出 92个代表株用计算机进行的树状图分析结果表明 ,所分析的菌株在 82 %的相似性水平上聚类成 8个群 .对这 92个代表株的部分菌株和慢生型大豆根瘤菌的参比菌株进行多聚酶链反应 (PCR)扩增的 16SrDNA的 4种限制性内切酶长度多态 (简称 16SrDNAPCR RFLP)分析 ,得出 2个不同的 16SrDNAPCR RFLP类型的菌株 ,分别与慢生型大豆根瘤菌的参比菌株Bradyrhizobiumjaponicum和Bradyrhizobiumelkanii相同 .图 1表 2参 14