一种改进的SON-PCR基因扩增方法

单侧寡聚核苷酸嵌套PCR(single oligonucleotide nested PCR,SON-PCR)是一种简便易行的由已知序列克隆其侧翼序列的方法,但该法的第二轮PCR反应引发效率低,而且得到的产物两端含相同的引物序列,不可直接测序.针对该问题,将第二轮PCR改进为两段式扩增,即先以单侧嵌套引物引发5′端做选择性线性扩增,然后再加入第一轮引物特异引发3′端,使特异性和效率都得到很大提高,并可用PCR产物直接测序.分别用已报道的和改进的SON-PCR法克隆Botrytis cinerea羟甲基戊二酰CoA还原酶基因侧翼序列,后者获得期望结果,证明改进的SON-PCR方法行之有效.国内外尚未见同类报道.图4参7     

松材线虫PCR标准化阳性对照构建及检测体系的建立

建立了松材线虫PCR检测标准化阳性对照及特异性强的PCR检测体系.根据松材线虫rDNA-ITS区和BxPe12基因的特异基因序列设计引物,并从中筛选出一对特异引物cqubs01/cquba01,该引物能从松材线虫特异性扩增出196 bp片段,而不能对其他种类线虫进行扩增.基于优化PCR反应体系和反应程序,稳定的检测体系得以建立,检测灵敏度为100 ps/μL.以松材线虫基因组DNA为模板,以上述特异引物进行PCR扩增,将纯化后的PCR产物与PMD18-T载体连接之后转入大肠杆菌中,筛选出阳性克隆进行测序验证,最终获得了松材线虫的无害化阳性对照,建立了松材线虫标准化阳性对照的PCR检测体系.对来自于不同地区的12批次近100个样品进行了实际检测验证,其结果与实际发生情况一致,说明本检测体系稳定可靠.图3表2参8     

肠道细菌乳糖酶基因多样性分析通用引物

为深入研究肠道细菌乳糖酶基因多样性,根据NCBI公布的细菌乳糖酶基因[Beta-galactosidase(lac Z)]序列,利用软件Primer Premier 5.0前后设计合成7对通用引物,经过PCR扩增、宏基因组测序和生物信息学分析进行引物筛选.PCR扩增电泳中,436R、375R、217R和406R四对引物没有扩增出目的片段,436、324和194三对引物均有目的条带扩出.内容物样品扩增,436引物条带最清晰,灵敏性高,324和194引物条带质量相差不大;粘膜样品扩增,324引物均扩增出目的条带,条带清晰明亮.436引物只扩增出一个样品的目的条带,灵敏度较差;194引物扩增杂带多,特异性差.样品序列统计方面,删除宿主序列信息后,内容物样品中,194、324和436三对引物最终序列比例均达98%以上;粘膜样品中,194引物特异性最差,436引物最好,324引物居中.OTU聚类和注释方面,内容物样品中,324引物扩增物种也较436引物多;粘膜样品中,324引物能聚类最多的物种.Alpha多样性方面,内容物样品中,324引物的Chao1、ACE、Simpson、Shannon指数较436引物大,436引物的Simpson、Shannon指数较194引物大;粘膜样品中,324引物的Chao1、ACE、Simpson、Shannon指数均较436引物大.综合分析,对肠道内容物和肠道粘膜细菌乳糖酶基因多样性研究选用324通用引物最佳.     

3株紫花苜蓿根瘤菌sinR基因的克隆、序列测定及系统发育分析

为从与紫花苜蓿共生的3株不同根瘤菌(CCBAU 30085、 USDA 1002和CCBAU QH180)中扩增参与根瘤菌群体感应调控的转录激活蛋白基因(sinR基因)并比较它们的不同,根据文献[1],设计了一对引物,通过PCR扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T-easy载体上,转化大肠杆菌DH5α,经蓝白斑和氨苄青霉素筛选得到阳性转化子.用通用引物测序后将序列与已报道的sinR基因(GenBank登录号为AL591788)进行了同源性比较和系统发育分析.本试验成功克隆到了sinR基因.经同源性及系统发育分析后,结果表明,CCBAU 30085、 USDA 1002和CCBAU QH180这3株菌的sinR基因序列相似性高达99%;它们与已知的Sinorhizobium meliloti 1021中的sinR基因序列相似性到达99 7%～100%,与具有相同功能的豌豆根瘤菌及埃氏菜豆根瘤菌中的raiR基因之间的相似性低于45%.这说明与紫花苜蓿共生的根瘤菌虽然经历了长期的进化,但其sinR基因在长期的进化过程中,却是一个非常保守的基因.     

拟南芥基因组中注释为(S)-去甲乌药碱合成酶的分子克隆与异源表达(英文)

至今在拟南芥中尚未发现复杂生物碱,但是其基因组测序则表明有35个以上基因可编码(S)-去甲乌药碱合成酶(NCS).本研究首先以经过生化表征、机理清楚的来自罂粟、日本黄连、黄唐松草和花菱草的NCS为参考,与拟南芥中注释的NCS进行了广泛的生物信息学分析与比对,从中选择5个AtNCS为目的基因,设计特异性引物;从拟南芥中提取总RNA,一步法RT-PCR克隆得到上述基因;通过TA克隆将上述基因转入pGM-T载体,筛选、酶切及PCR鉴定,DNA测序验证它们的核酸序列;将测序验证的AtNCS基因经过PCR扩增、质粒构建、转入Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达和蛋白纯化;在整体细胞、细胞裂解液、细胞裂解液上清和纯化蛋白共4个层次进行了AtNCS酶功能表征,未发现目标产物或新产物的生成;上述基因的具体功能还有待进一步研究.     

小麦高分子量谷蛋白亚基基因的PCR及AS-PCR标记

选用高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)在Glu-D1位点已知的 26个普通小麦品种,包括 15个 (TriticumaestivumL. )川育系列品种及其 11个亲本,根据其亚基Dx5和Dy10基因的特异序列设计引物.通过对Dx5基因的PCR扩增及对Dy10基因的AS-PCR扩增,结果表明,所设计的引物对Dx5和Dy10都能扩增出特异条带,而携有Dx5基因的材料同时也携有Dy10基因.说明用所设计的引物可快速有效的鉴定出普通小麦中是否带有优质的 5 10亚基.图 4参 15     

苏云金芽孢杆菌新基因cry1Ab17的克隆和生物信息学

利用高效克隆PCR产物的专用载体pMD18T,直接从苏云金芽孢杆菌WB9的PCR产物中克隆了cry1Ab17新基因.测序结果表明,该基因(GenBank登录号为AY646166)由3471个碱基组成,其编码的蛋白质含有1156个氨基酸残基,其中亲水性氨基酸占30.8%,疏水性氨基酸占45.2%,酸性氨基酸占12.9%,碱性氨基酸占11.1%.氨基酸序列的同源性分析结果表明,Cry1Ab17蛋白与已报道的Cry1Ab蛋白同源性为95.4%～99.7%,该蛋白的4个氨基酸残基———Pro170、Gly449、Gly796和Gly863与其它已报道Cry1Ab蛋白相应位置的氨基酸残基均不同.在核苷酸序列和氨基酸序列多重比较的基础上,应用PAUP4.0构建了Cry1A蛋白家族的系统发育树.SignalP分析结果显示,Cry1Ab17蛋白中不含信号肽序列.此外,对Cry1Ab17蛋白的二级结构和3个结构域也进行了预测和分析.图4表2参15     

染色体步行PCR技术

染色体步行是一种常用的克隆已知基因旁侧序列的技术.本文综述了现有的染色体步行PCR技术,如反向PCR、锅柄PCR、连接介导PCR、热不对称PCR、SON PCR等,并在此基础上提出了一种新的染色体步行PCR技术的构思.它运用特异引物与随机引物的搭配,在普通PCR程序下扩增目的序列.实验中设置相应随机引物的RAPD对照,识别非目的扩增产物.文中介绍了新方法的原理,分析了这种方法的优缺点.这种方法可能是一种新的有效进行染色体步行的PCR技术,国内外尚未见相关报道.图2参26     

石油烃厌氧降解关键基因masD和bamA的实时荧光定量PCR检测方法与应用

masD和bamA是控制石油烃厌氧降解的关键基因,利用实时荧光定量PCR技术检测masD和bamA基因具有简便快速和易操作等优点.但目前所用方法存在扩增效率低,方法灵敏度较差的问题.本文根据引物设计原则,利用Allele ID6软件重新设计了扩增masD和bamA的实时荧光定量PCR引物,将质粒DNA进行8次10倍梯度稀释后构建实时荧光定量PCR标准曲线.优化后的体系（20μL）为：FastStart Essential DNA Green Master 10.0μL,上下游引物各0.4μL,RNase-Free Water 4.2μL,5.0μL DNA模板.利用新设计的引物扩增masD和bamA基因的最适退火温度分别为61℃和57℃.优化后的检测方法扩增效率提高至97.5%和71.2%,比文献报道的方法提高了7.6%—44.5%,具有更高的重复性和灵敏度.利用设计的引物对陕北5个地区石油污染土壤中的masD和bamA基因进行定量检测结果表明,石油污染土壤中普遍存在着控制石油烃厌氧降解的关键基因,所测定的土壤中bamA降解基因的拷贝数远高于masD降解基因.     

林木外生菌根真菌彩色豆马勃巢式PCR检测

为探讨林木外生菌根真菌的分子检测方法,利用真菌通用引物ITS1-F/ITS4-B扩增了外生菌根真菌彩色豆马勃的核糖体DNA内转录间隔区并进行了序列测定.通过序列比较,设计了一对彩色豆马勃特异性引物PtF/PtR.利用该对特异性引物与ITS1-F/ITS4-B组合进行巢式PCR,能从供试的彩色豆马勃10个菌株中特异性地扩增出1条347 bp的条带,而供试的其他6个参比菌株未出现扩增产物.经分析,该巢式PCR检测技术的灵敏度可达到10 fg的DNA,是常规PCR检测的1 000倍.利用该技术从马尾松苗木菌根中检测到目的外生菌根真菌.这表明采用本研究设计的特异性引物,利用巢式PCR技术可以灵敏、准确地从林木外生菌根中检测出彩色豆马勃.