红树林放线菌的分离及其抗菌和抗肿瘤细胞活性

从福建漳州红树林保护区采集土壤样品中分离到163株放线菌,用5种指示菌(Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans and Rhizoctonia solani)测定了它们的抗菌活性,结果表明,其中42.3%的放线菌发酵液具有单一或多种抗菌活性.同时测定了它们的发酵液对肝癌细胞BEL7402、肺癌细胞A549和白血病细胞HL60三种肿瘤细胞的毒性,其中37.4%的放线菌发酵液具有单一或多种抗肿瘤细胞毒活性.对这163株放线菌的16S rDNA序列分析表明,它们分属于链霉菌属(89%)、小单孢菌属(6.1%)、糖单孢菌属(0.6%)、马杜拉放线菌属(3.7%)和拟诺卡氏菌属(0.6%).其中, 3株链霉菌与其亲缘关系最近的菌种的16S rDNA相似性低于97%,可能是3个新种.     

链霉菌S227抗耐药性物质的分离及其活性研究

在抗耐药性活性筛选过程中,发现分离自四川峨嵋山森林土壤的一株链霉菌S227(Streptomyces sp.)的发酵液具有抗细菌抗生素耐药性生物活性.利用已建立的抗耐药性的活性检测方法(专利号:ZL01128969.4)[1]为跟踪手段,采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析以及薄层层析等方法,对该菌发酵液中抗耐药性活性物质进行分离纯化,得到了具有抗耐药性的活性单体S227-4,初步鉴定为四聚糖.利用MIC法对该样品的抗耐药活性进行研究:在证明该样品本身不具有抗菌活性的基础上,以临床分离的耐药菌株为指示菌,考察了该样品与抗生素联合使用时对耐药菌抗生素MIC(最小抑菌浓度)值的影响,结果表明,S227-4在不影响耐药菌生长的浓度下与不同的抗生素联合使用,可以明显提高不同耐药菌对不同抗生素的敏感性,如S227-4(200μg/mL)可以使S.aureus12334对红霉素的敏感性提高128倍.图2表2参8     

新疆罗布泊外围地区极端环境嗜碱放线菌生物学特性及活性物质筛选

2006～2007年从新疆罗布泊外嗣地区的泥土样品中分离了117株放线菌,初步筛选后对其中47株嗜碱放线菌进行了形态学鉴定,不同生长条件(pH值,盐NaCl、KCl、MgCl_2,碱性物质Na_2 CO_3、K_2CO_3、Mg_2CO_3、NaOH、KOH,温度)对菌株生长的影响,拮抗性、产酶活性检测及菌株LA4的分子进化鉴定等研究.结果发现,47株放线菌的15%属于诺卡氏菌属,70%属于链霉菌属,10%属于游动放线菌属,其中嗜碱链霉菌属占优势.在pH 7～11范围内,47株嗜碱放线菌均能生长.生长率为92%～95%.NaCl、KCl、MgCl,对嗜碱放线菌均具有抑制作用,NaCl、KCl的抑制作用高于MgCl_2,NaCl、KCl浓度超过10%时而MgCl_2 浓度超过15%时嗜碱放线菌完全停止生长.47株嗜碱放线菌对Na_2CO_3、K_2CO_3、MgCO_3、KOH、NaOH等碱性物质没有选择性,生长良好.47株嗜碱放线菌的最适生长温度为28～30℃.超过55℃后均不能生长.从47株嗜碱放线菌中筛选出了30株具有抗菌活性的菌株,其中对大肠杆菌有抑制作用的有11株,占36.7%,对金黄色葡萄球菌有抑制作用的有20株,占66.7%,对枯草杆菌有抑制作用的有16株,占53.3%;其中4株嗜碱放线菌LA4、LA24、LA33和LA19对3种指示菌均表现出抑制作用.在47株嗜碱放线菌中,74%具有淀粉酶活性,81%具有纤维素酶活性,43%具有蛋白酶活性,49%具有脂肪酶活性.通过分子鉴定,发现LA4为链霉菌中尚未报道的一个新亚种,其16S序列GenBank登录号为FJ182229.本研究结果表明新疆罗布泊外围地区存在大量的产纤维素酶、淀粉酶的嗜碱放线菌,并且潜藏着新的放线菌资源,为该地区嗜碱放线菌的种质资源开发和新药筛选有效菌源提供了参考.图5表4参20     

具有微囊藻毒素清除能力的乳酸菌的分离筛选及其影响因素

微囊藻毒素是由蓝藻产生的环状多肽物质,可引发人类肝中毒等健康问题,因此微囊藻毒素的清除对食品安全和环境保护有着深远的意义.本研究从泡菜、腊肠等传统发酵食品中分离筛选获得33株乳酸菌,通过对其微囊藻毒素清除能力的测定,获得一株具有高效微囊藻毒素清除能力的乳酸菌菌株干酪乳杆菌BBE10-212.实验发现菌体浓度、藻毒素浓度、菌体活性等因素对实验菌株清除藻毒素的效能具有显著影响,此外,外源添加5%的葡萄糖可使藻毒素清除率提高至52%,远高于未添加时的19%.而外源添加替代藻毒素的微生物发酵氮源以及作为部分代谢关键酶辅酶的金属离子则会抑制菌体对藻毒素的清除效率.研究结果为深入分析实验菌株清除微囊藻毒素的作用机制,实现微囊藻毒素的生物干预策略,并基于对菌株的代谢调控促进微囊藻毒素的高效降解提供了数据和资料.     

河南省不同类型土壤可培养放线菌多样性及拮抗活性菌株筛选

分别从河南省濮阳、南阳、信阳、三门峡和商丘等地区采集潮土、黄棕壤、水稻土、褐土、盐碱土等土壤样品45份,采用8种不同的分离培养基对土壤放线菌进行分离和培养;通过16S rRNA基因序列分析对可培养放线菌进行分类鉴定;以7种植物病原菌为靶标,通过对峙培养筛选拮抗活性菌株,并对具有拮抗活性菌株的次级代谢产物合成相关基因进行初步筛查.结果表明,从5种类型土壤中分离得到放线菌分离物955株,分布于放线菌门的10个目12个科17个属,包含626个物种,其中9个分离物为潜在的新种;分离物中链霉菌属菌株751株,占分离菌株的78.64%,为最主要的优势菌属,稀有放线菌204株,占21.36%;不同类型土壤放线菌的分离频率存在一定的差异,其中褐土分离的放线菌数量最多,水稻土的分离数量最少,但是各类型土壤分离的可培养放线菌在属水平上差异不大;筛选获得对植物病原菌有拮抗活性的菌株392株,占总分离物的41%,其中链霉菌332株,占总拮抗活性菌株的84.7%,稀有放线菌60株,占总拮抗活性菌株的15.3%,且多数活性菌株含有多种生物活性物质合成相关的功能基因.由此可见,河南省土壤放线菌多样性丰富,并蕴藏丰富的稀有放线菌和拮抗活性放线菌资源,具有发掘放线菌新物种和新活性化合物的潜力.(图4表6参33附表1)     

金鸡菊(Coreopsis drummondii)的抗TMV活性物质

采用活性跟踪法从金鸡菊根中分离获得抗病毒活性物质,经质谱和核磁共振分析,鉴定该物质为1-苯基-1,3,5-三庚炔.采用半叶枯斑法、叶圆盘法测定了该物质对烟草花叶病毒的抑制效果,结果表明,0.2 mg/mL的该化合物对TMV表现出较好的体外抑制侵染和增殖活性,其对TMV侵染和复制的抑制率分别为73.5%和84.3%.实时荧光定量PCR测定结果表明,该化合物对TMV外壳蛋白基因的表达有明显的抑制作用,0.2 mg/mL的该化合物对TMV外壳蛋白基因表达的抑制率为79.8%.图6表1参19     

薄荷化感物质的作用及其初步分离

以小麦(Triticum aestivum)、青菜(Brassica chinensis)和萝卜(Raphanus sativus)3种作物为受体，对薄荷(Mentha Haplocalyx)化感物质的作用进行了研究．结果表明：薄荷根分泌物显著促进小麦幼苗和幼根的生长，显著抑制青菜幼苗和幼根生长，显著促进萝卜幼苗而抑制其幼根生长．薄荷地上部分水浸液显著抑制青菜、萝卜的种子萌发和幼苗、幼根的生长；萝卜比青菜更敏感，幼根比幼苗更敏感；随着化感物质浓度的降低，抑制作用逐渐减弱、消失，甚至转变为促进作用．水浸液经氯仿、石油醚萃取后，剩余水相浓度变小、水势升高，但其抑制作用反而更加强烈．这说明，这种极其强烈的抑制作用不是低水势而是化感物质造成的；而且，剩余水相的抑制作用被同样具有抑制作用的石油醚相和氯仿相组分所削弱。即化感组分之间存在拮抗作用．剩余水相经大孔树脂进一步分离得到的3个组分都极显著地促进青菜幼苗的生长．这表明，水相强烈的抑制作用是由起极显著促进作用的3个组分的混合物产生的，且排除了水势降低的影响．但组分2显著抑制青菜、萝卜种子的萌发和幼根的生长．图2表4参26     

一株抗青枯假单胞菌放线菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

从河南中牟土壤中筛选出一株对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)有较强拮抗作用的放线菌ZM-16,它对几种常见病原细菌和真菌都有较强的抑制效果,其发酵液抗菌谱较广.通过菌株形态特征、培养特性、生理生化特性、化学特征研究以及16SrRNA序列分析,初步确定菌株ZM-16为链霉菌属的抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus).通过发酵优化实验,确定该菌株的最佳发酵配方为:蔗糖8%、大豆粉5%、NaNO31%、NaCl0.2%、CaCO30.4%、K2HPO40.08%;最佳发酵条件为:发酵培养基初始pH值7.0,30℃,恒温摇床200r/min,培养6d,抑菌效果最好.     

海绵体上具有抗肿瘤活性的细菌B2817的分离与鉴定

建立了镰刀菌-细胞毒组合筛选模型,并运用该模型对232株从海绵体上分离出的细菌进行筛选,得到4株抗肿瘤活性较好的细菌.经活性检测,发现菌株B2817的发酵液在稀释100倍时对人肝癌细胞SMMC-7721、人鼻咽癌细胞CNE和小鼠肉瘤细胞S180的抑制率分别为92%、90%和95%,而对正常的人肝细胞的抑制率仅为8%.经多相分类学鉴定,发现B2817是弧菌属中一个种,与弧菌属中的产气弧菌Vibriogazogenes亲缘关系最近,但两者在形态、生理生化特征、分子遗传等方面存在很大差异,故认为B2817可能是弧菌属的一株未被认识的新种.图1表3参9     

中国红豆杉内生放线菌En-1的分离、鉴定及其次生代谢物的研究

采用选择性分离方法对药用植物红豆杉Taxus chinensis嫩枝和叶进行内生菌分离,得到一株放线菌En-1,经鉴定为链霉菌Streptomyces sp.;并对该菌进行液体培养条件优化、次生代谢物初筛及其抗菌活性的研究。通过添加宿主植物浸出物至En-1液体培养中以考察宿主对后者生长的影响,结果表明红豆杉叶浸出物能促进En-1的体外生长;而且En-1次生代谢物对5株供试菌中的黑曲霉具有抑制活性。通过En-1菌培养基优化并联合波谱法检测其发酵产物,显示8#配方（淀粉25 g.L-1,KNO3 1 g.L-1,K2HPO4.3H2O 0.5 g.L-1,NaCl 0.5 g.L-1,FeSO4.7H2O 0.01 g.L-1,MgSO4.7H2O 0.5 g.L-1）培养液中,En-1所产的次生代谢物最具结构多样性;同时8#配方也有利于该菌产生抗菌活性产物。本研究提示红豆杉内生放线菌可作为寻求药物先导化合物的资源菌。     

尾矿固氮菌的分离筛选及其植物促生效应研究

尾矿是一种寡营养环境,含有大量重金属元素,然而营养元素的缺乏,尤其是氮素的缺乏严重阻碍了尾矿生物修复策略的发展。固氮菌可为植物提供可利用性氮,促进尾矿生态修复。然而,目前关于栖息在尾矿中固氮菌的分离研究较少。采用无氮培养基和稀释涂布平板分离法,从湖南怀化溆浦县黄家尾矿分离出7株具有固氮功能的菌株,结果表明,PC-3的固氮酶活性最高(7 133.71μmol·h^-1·mL^-1)。IAA、金属抗性和铁载体定性测定结果表明,G6、L31和PC-3同时具备有IAA特性、铁载体和金属抗性的能力。同时研究了菌株的最适生长pH,结果表明大部分菌株在pH偏中性下生长较好,但G6、L2+2在pH=9的条件下生长趋势最好。16S r RNA测序结果表明,上述7株菌分别为Brevundimonas(G15、G18),Xanthobacter(L31),Sphingobium(L2+2),Pseudomonas(PC-3),Mycobacterium(G6),Rhodococcus(L45)。为了进一步探究尾矿固氮菌的植物促生潜力,进行了盆栽试验。与对照组相比,接种...     

一株放线菌对铜绿微囊藻的溶藻活性

从庐山土样中分离得到一株放线菌JXJ 0071,研究了该菌的孢子、菌丝体和代谢产物对铜绿微囊藻(Micro-cystis aeruginosa)的溶藻活性以及溶藻活性成分的稳定性,并对其分类地位进行鉴定。结果表明,放线菌JXJ 0071的孢子和菌丝体均能使铜绿微囊藻细胞密度显著降低。该菌代谢产物对铜绿微囊藻具有很强的溶藻活性,在藻密度为1.0×107 mL-1的藻液中加入体积分数φ为2%的该菌发酵上清液3,d后溶藻效率达98%。溶藻活性成分主要来自水溶性胞外产物,其对高温、pH和紫外线处理均具有较好的稳定性。以60℃以下的温度处理发酵液2h,溶藻活性成分的溶藻效率基本不变,保持在95%以上;pH 7.0～9.0条件下,其溶藻效率仍很高,在93.8%以上;经波长为254 nm的紫外线照射2 h,其溶藻效率仍达85.7%。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,该菌株属链霉菌属,与Streptomyces rectiviolaceus的序列相似性达99%,但JXJ0071与S.rectiviolaceus的部分生理生化特性有所不同,需要进一步的实验数据确定其种一级分类学单元。     

对甘薯茎线虫具有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌筛选及特性鉴定

为筛选对甘薯茎线虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株,提取12株供试Bt菌株的晶体蛋白,溶解后加入到甘薯茎线虫悬浮液中,统计3 d和7 d后甘薯茎线虫的死亡率.经初筛和复筛后得到一株对甘薯茎线虫具有高毒力的Bt菌株YBT-008,其对甘薯茎线虫的LC50值为203.76μg/mL.研究了YBT-008的生物学特性,结果表明,YBT-008在LB培养基上培养约12 h后进入稳定期,并且伴随芽胞的形成产生卵圆形的伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明YBT-008可产生多种待鉴定的晶体蛋白类型,质粒检测显示该菌株有5条质粒条带.YBT-008的获得为利用Bt防治甘薯茎线虫提供了新型菌株和基因资源.     

城市污水中有色物质的分离鉴定

本研究采用二氯甲烷分步萃取,硅胶柱净化和预分离、高效液相色谱结合薄层色谱的定性方法,从不同时期采集的城市污水处理厂二级出水中分离鉴定出七种染料,并对鉴定出的染料进行了定量分析。     

产蛋白酶北极海洋耐冷菌ArcB82306的筛选及其蛋白酶性质

从北极加拿大海盆海水中分离到一株产蛋白酶耐冷菌株ArcB82306.16S rDNA基因序列的同源性分析表明,该菌株属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas).蛋白酶酶谱显示该菌株分泌多种胞外蛋白酶.胞外蛋白酶的最适作用温度和最适pH分别为45℃和9.菌株ArcB82306所产蛋白酶受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制,金属蛋白酶抑制剂EDTA以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64对蛋白酶活性无影响,结果提示该蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶.金属离子Ni2+、Zn2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Ca2+和Mg2+可部分抑制酶的活性,而DTT和巯基乙醇等还原剂及Triton X-100和吐温-80等表面活性剂对酶活性无显著影响.     

四川盐边植烟土壤放线菌的遗传多样性及抗菌活性

从四川省盐边县代表性烟草种植区域的植烟土壤样品中分离出52株放线菌菌株,采用16S rDNA限制性片段长度多态性(16S rDNA-RFLP)和16S rDNA序列分析研究了其遗传多样性及系统发育地位,并初步探索了其抗菌活性.16S rDNA-RFLP分析结果表明,在非加权组平均法(UPGMA)聚类图中,所有菌株在75%的相似水平上聚为一类,而在88%的相似水平上分为8个遗传类型.在主成分分析聚类图中,供试菌株可分为5个类群,揭示了植烟土壤放线菌菌株具有一定的遗传多样性.代表菌株系统发育分析显示,供试菌株均属于链霉菌属(Streptomyces),链霉菌是植烟土壤中的绝对优势放线菌.初筛结果显示,共有13株菌株表现出了一定的抗菌活性,而在复筛中仅有3株表现较好.根据初筛和复筛结果选择菌株SAUAS3-2进行玉米盆栽试验,结果表明,该菌株具有一定抗菌活性的同时还具有促生作用.本研究揭示了盐边县植烟土壤具有丰富的放线菌资源.     

海洋石油降解菌的筛选与降解特性

用采自山东胜利油田的石油污染水体,以原油为唯一碳源,经人工海水培养基富集培养,得到lO株细菌.通过降解率的测定,发现其中一株细菌HB-1具有较强的石油降解能力,200 r/min振荡培养6 d,其原油的降解率达54.74%.根据菌落特征、菌体形态、生理生化特性和16S rDNA序列分析,确定HB-1为不动杆菌属(Acinetobacter sp.).进一步实验表明,该菌株最适宜牛长和降解石油的条件为:温度25～32℃,初始pH值6.5～7.5,盐度3%,此条件符合实际海洋环境的要求.图6表2参22     

有效微生物群(EM)中抑藻酵母及其活性物质特性

采用选择性培养基从有效微生物群(EM)中富集出酵母菌,通过向对数增长期的混合藻液中加入酵母菌、葡萄糖、酵母菌+葡萄糖、经酵母菌发酵除菌后的葡萄糖溶液分别考察了其对水华藻的抑制效应.结果表明,混合酵母菌自身对于水华藻没有抑制作用,单独添加葡萄糖的水华藻甚至出现快速增殖;而在添加葡萄糖+酵母菌或酵母菌发酵液的实验中水华藻近似被完全抑制,最大抑制率达97%.据此可知,抑制水华藻增殖的并非酵母菌自身,而是具有高热稳定性的胞外分泌物.HPLC-SEC与三维荧光光谱分析表明,酵母菌发酵液中含有明显的芳环类羧酸及蛋白质物质,但由于其在高温灭菌后仍有良好的抑藻活性,因而进一步确定其抑藻活性物质为含苯环的有机酸.此外,依据对实验中水华藻细胞形态的显微镜观察,该酸性胞外物可能是通过破坏藻细胞的叶绿体结构来达到抑藻效果的.     

具有抑菌促生作用的植物内生细菌的筛选

从168株分离自茄科作物体内的对黄瓜枯萎病菌或番茄青枯病菌有拮抗作用的细菌中，筛选出19株对辣椒疫病菌有较好拮抗作用的菌株，其中2号、13号、20号、TL6、TMS2、TB2和QEL17个菌株对以上3种病原菌都有一定的拮抗作用．从拮抗辣椒疫病菌的菌株中筛选出20号、22号、TL6、TB1、TB2和EPL8共6株对番茄有较好促生作用，对辣椒采后果实疫病有一定控制效果，且能进入番茄和辣椒体内的菌株．试验结果表明，防病作用最佳的TB2菌株菌液喷雾处理后接种病菌，4～10d防治辣椒采后果实疫病的效果达55．56％～100％；促生作用最佳的TB1菌株可使番茄苗鲜重增长105．84％，干重增长66．25％．经鉴定，6株有抑菌、促生的内生细菌均为芽孢杆菌(Bacillus sp．)，其中EPL8和22号菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(B．subtilis)．表5参8     

海洋苯酚降解菌Candida sp.P5的分离鉴定及其降解特性

从海洋沉积物中分离、筛选到一株能以苯酚作为唯一碳源和能源的酵母菌P5．根据菌落特征、菌体形态、生理生化特性和18SrDNA序列分析，确定菌株P5为假丝酵母菌属（Candicla　sp．）．该菌株最适宜生长和降解苯酚的条件为：温度25℃，pH6．0～7．0，摇床转速100r／min，需氧；菌株P5能在较高浓度的苯酚条件下生长，在72h内可以降解95％以上的苯酚．对苯酚代谢途径和相关酶的研究发现，菌株P5主要在邻苯二酚1，2-双加氧酶作用下通过邻位途径进行苯酚代谢．图7表2参24