稻田土壤反硝化厌氧甲烷氧化菌的时空分布与群落结构分析

由"Candidatus Methylomirabilis oxyfera"主导发生的以甲烷和亚硝酸盐为底物的反硝化厌氧甲烷氧化反应(nitrite-dependent anaerobic methane-oxidizing,n-damo)的发现,将生物地球化学碳循环和氮循环以新的方式结合起来.本研究以夏季和冬季江阴稻田土壤柱状样品为研究对象,对稻田土壤M.oxyfera-like菌的时空分布和群落结构进行了考察.M.oxyfera-like菌16S rRNA基因的定量PCR结果显示M.oxyfera-like菌的丰度随着土壤深度的增加而增加,且无明显季节性差异,60~200 cm深度的稻田土壤是M.oxyfera-like菌的高丰度区域.M.oxyfera-like菌pmo A基因的系统发育分析和生物多样性分析显示M.oxyfera-like菌的群落结构具有一定的时空异质性,且生物多样性随着土壤深度的增加而增加.这些结果都说明江阴稻田深层土壤(60~200 cm)是适宜M.oxyfera-like菌生存的生态环境.     

旱地土壤反硝化厌氧甲烷氧化菌的垂向分布特性与活性分析

在厌氧条件下,以亚硝酸盐作为电子受体将甲烷氧化的反硝化厌氧甲烷氧化反应(nitrite-dependent anaerobic methane-oxidizing,n-damo)的发现,彻底颠覆了人们对甲烷循环的传统理解.通过分子生物学方法及13C和15N稳定同位素示踪技术,对河北省北澧河附近的旱地农田土壤(0~1 m)中n-damo菌的群落结构、丰度和活性进行了研究,深入探究了n-damo菌的亚硝酸盐底物来源.结果显示,n-damo菌更多存在于旱地浅层土壤中,并且随季节变化分布在不同深度的土壤中.针对其pmo A基因的系统发育分析显示,旱地土壤中n-damo菌的群落结构具有明显的空间异质性,来自土壤0~20 cm和40~60 cm土层的序列完全分开,处于系统发育树不同分枝.针对其16S rRNA基因的实时荧光定量PCR结果显示,n-damo菌丰度随土壤深度的增加而降低,夏季丰度(1.44×10~4~1.02×10~5copies·g~(-1))低于冬季(3.66×104~2.67×105copies·g-1).在浅层土壤(0~20 cm)中,硝化反应和反硝化反应共同为n-damo菌提供亚硝酸盐底物来源;而在深层土壤(60~80 cm)中,亚硝酸盐底物主要来源于硝化反应.n-damo菌的活性(0.18 nmol·g~(-1)·d~(-1),以CO_2计)只能在夏季表层土壤(0~20 cm)中检测到,其余深度均未检测到其活性.在旱地农田土壤中,反硝化厌氧甲烷氧化菌对农田碳循环的影响可能不大.     

西湖底泥中的反硝化型甲烷厌氧氧化菌的分子生物学检测

反硝化型甲烷厌氧氧化反应(Denitrifying anaerobic methane oxidation,DAMO)是一种最新发现的生物反应,该反应能够偶联反硝化和甲烷的厌氧氧化.催化DAMO反应的微生物是NC10门中一种被命名为“Candidatus Methylomirabilis oxyfera”的细菌.本研究采用基因克隆文库技术考察了西湖淡水底泥中DAMO微生物的分布与种群多样性状况.16S rRNA基因系统发育分析表明,西湖底泥中存在NC10门细菌,与已知的M.oxyfera的16S rRNA基因相似度为93％～98％.DAMO微生物功能基因(pmoA)的系统发育分析进一步证实了西湖底泥中分布有此类微生物,与已知的Moxyfera的pmoA基因相似度为86％ ～ 95％.实时定量PCR结果表明,西湖底泥中DAMO微生物的16S rRNA基因的拷贝数为2.15 ×105 copies·g-1(以干重计).     

高通量测序技术研究典型湖泊岸边陆向深层土壤中厌氧氨氧化细菌的群落结构

为研究具有富营养化特征的白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤中厌氧氨氧化细菌的群落结构组成,针对厌氧氨氧化的功能基因hzs B(联氨合成酶关键基因)进行高通量测序.结果显示,白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤共8个样品处理后共得到77082条序列,在相似度90%下聚类得到40个OTUs.多样性分析(OTUs水平)表明,在白洋淀湖泊岸边近湖岸交界处,上层土壤中厌氧氨氧化细菌的群落多样性要高于下层,而在远湖岸交界处则相反,下层土壤中厌氧氨氧化细菌的群落多样性要高于上层土壤.PCo A分析(OTUs水平)表明,近湖岸交界处采样点各不同深度土壤层之间的厌氧氨氧化细菌的群落结构更相似,而远湖岸界面处采样点各不同深度之间的厌氧氨氧化细菌的群落结构差异较大.群落结构分析表明,在白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤中,序列隶属于Candidatus‘Brocadia anammoxidans’(34.07%)、Candidatus‘Brocadia fulgida’(24.66%)、Candidatus‘Jettenia sp.’(3.00%)、Candidatus‘Kuenenia sp.’(0.22%)、Candidatus‘Scalindua sp.’(0.08%)及与Genbank中已探明的厌氧氨氧化细菌亲缘关系较远的Anammox-like cluster(37.98%).相关性分析(p0.10)表明,在白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤中,厌氧氨氧化细菌α-多样性指数中丰富度Chao指数与含水率(MC)呈负相关,多样性Shannon指数与氨氮(NH+4)呈负相关,优势度Simpson指数与NH+4呈正相关;但厌氧氨氧化细菌群落组成中Candidatus‘Brocadia anammoxidans’的富集与总碳(TC)及总硫(TS)含量呈正相关.综上,本文针对厌氧氨氧化功能基因hzs B扩增进行高通量测序,一定程度上揭示了具有富营养化特征的白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤中厌氧氨氧化细菌的多样性、群落组成及其与土壤环境因子的关系.     

宛山荡农田土壤氮迁移过程反硝化与厌氧氨氧化

为探究中国南方农田土壤氮迁移过程的反硝化与厌氧氨氧化(anaerobic ammonia oxidation,ANAMMOX)速率变化和脱氮贡献本研究采集宛山荡麦稻轮作区农田不同层深土壤及农田、沟道、河岸带和湖泊沉积物等不同土地利用类型土壤样品,分析其理化性质采用Illumina MiSeq测序和实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)技术探究土壤样品的微生物群落组成和功能基因丰度应用同位素培养实验测定各样品的潜在反硝化与厌氧氨氧化速率(以N_2计,下同).结果表明,土壤反硝化速率与TOC、NH_4~+-N和NO_3~--N含量均显著正相关(P0.05),与nirS、nirK及nosZ等功能基因丰度亦呈显著正相关(P 0.05).农田表层土壤反硝化速率为(11.51±1.04) nmol·(g·h)~(-1),显著高于农田其他土壤层以及其他土地利用类型(P 0.05),而农田土壤中厌氧氨氧化速率在20～30 cm层最高,达到(0.48±0.07) nmol·(g·h)~(-1).此外,反硝化作用是农田表层土壤氮损失的主要原因,占91.9%～99.7%,而厌氧氨氧化在深层土壤N_2的产生过程中占有重要地位.     

亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化过程影响因素研究

亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化(Nitrite-dependent denitrifying anaerobic methane oxidation,n-damo)是指微生物在厌氧条件下利用甲烷还原亚硝酸盐的过程,该过程的研究可为污水脱氮减排提供技术支持.采用n-damo富集培养物(荧光原位杂交实验结果表明n-damo功能菌丰度可达73%)为研究对象,着重探讨温度(25,35,45℃)、p H值(5.5~9.5)、甲烷分压(0~98 k Pa)和亚硝酸盐初始浓度(0~6.0 mmol·L-1)对n-damo反硝化速率的影响,以获得最优条件,为n-damo过程在污水处理中的应用提供理论依据.结果表明,在本实验条件下n-damo过程进行的最适温度为35℃,最适p H值为7.5,最适甲烷分压为49 k Pa,最适亚硝酸盐初始浓度为2.4~3.42 mmol·L~(-1).     

长江口邻近海域沉积物中厌氧氨氧化细菌分布特征研究

海洋生态系统氮素循环对维持海洋生态收支平衡具有重要意义,由厌氧氨氧化细菌(anaerobic ammonia-oxidizing bacteria,ANAMMOX Bacteria)推动的厌氧氨氧化过程是海洋氮素移除的重要途径.本研究采用荧光定量PCR(q PCR)技术,并结合环境理化因子,分析了2011年夏季长江口邻近海域沉积物中厌氧氨氧化细菌的种群丰度分布特征.结果表明,厌氧氨氧化细菌的种群丰度在长江口邻近海域的空间分布与环境因子密切相关,总有机碳含量、盐度、铵盐浓度对长江口邻近海域沉积物中厌氧氨氧化细菌的种群丰度具有重要调控作用.厌氧氨氧化细菌的丰度分布与总有机碳含量呈显著正相关关系(P0.01,r=0.69),同时又随亚硝酸盐浓度、溶解氧浓度的升高而降低,而盐度对厌氧氨氧化细菌丰度分布的影响较为复杂.     

不同接种物对富集反硝化型甲烷厌氧氧化微生物的影响

在厌氧条件下,反硝化型甲烷厌氧氧化过程(Denitrifying anaerobic methane oxidation,DAMO)以CH_4为电子供体,以NO_3~-或NO_2~-作为电子受体,可同时实现甲烷氧化和废水中脱氮.本文利用两种电子受体(NO_3~-、NO_2~-)及不同接种污泥成功富集了4种DAMO培养物,研究了不同接种物对富集DAMO微生物的影响.结果表明,NO_3~-对富集DAMO古菌具有重要作用,而NO_2~-则对DAMO细菌的富集过程有较大影响.其次,在富集培养过程中,NH_4~+的存在会获得厌氧氨氧化(Anaerobic ammonium oxidation,Anammox)细菌与DAMO古菌的混培物,并形成协同关系,而DAMO细菌却因与Anammox细菌竞争而被淘汰.当NH_4~+不再加入,NO_3~-成为唯一氮源时,DAMO细菌重新出现并与DAMO古菌形成一种新的协同关系.此外,以淡水河道底泥、淡水湖泊底泥及水稻田土壤的混合物作为接种污泥而得到的DAMO富集培养物,其脱氮速率比以淡水河道底泥、活性污泥及厌氧消化污泥的混合物作为接种污泥的富集培养物高出3.3倍,但后者在驯化时间上缩短了36%.     

西湖底泥中厌氧氨氧化菌的分子生物学检测

厌氧氨氧化（anaerobic ammonium oxidation,anammox）在海洋氮素循环中起了重要作用,而有关天然淡水生态系统中anammox的研究报道并不多.本研究采用16SrRNA基因克隆文库技术首次考察了西湖淡水底泥中anammox菌的分布与种群多样性水平.16SrRNA系统发育分析表明,西湖底泥中的...     

厌氧氨氧化细菌在生物膜系统中起主要脱氮作用的模拟预测

废水有机物对亚硝化 厌氧氨氧化(ANAMMOX)生物膜系统的影响借助已建立的自养生物膜模型(CANON)与活性污泥3号模型结合进行了理论模拟.被结合的数学模型可以模拟生物膜中自养菌与异养菌活性以及所涉及的全部内在反应(碳氧化、硝化、反硝化、厌氧氨氧化).模拟显示,废水有机物对亚硝化 厌氧氨氧化生物膜系统影响不大;生长稳定的生物膜系统中异养菌反硝化不是脱氮的主反应(最大脱氮作用20%);厌氧氨氧化左右着脱氮功能.除废水中有机物可被全部去除外,当溶解氧最佳时,系统总氮去除率亦可高达90%.     

厌氧氨氧化微生物在有机碳源条件下的代谢特性

通过多系列血清瓶实验并结合吉布斯自由能量分析探讨了厌氧氨氧化微生物在有机碳源条件下的代谢特性.实验结果表明：在葡萄糖作为有机碳源的条件下,低浓度的葡萄糖 (0.5 mmol·L-1) 能够促进厌氧氨氧化反应的速率,高浓度的葡萄糖 (≥1 mmol·L-1) 抑制了厌氧氨氧化活性;厌氧氨氧化微生物不仅具有厌氧氨氧化的代谢特性,还具有反硝化和硫酸盐还原的代谢能力.吉布斯自由能量分析表明： 在低浓度葡萄糖条件下,尽管最初厌氧氨氧化途径具有优势,但随后与反硝化途径展开竞争并处于劣势;在高浓度葡萄糖条件下,与厌氧氨氧化途径相比,反硝化途径完全占据优势;硫酸盐还原途径与厌氧氨氧化和反硝化途径相比不具有能量优势,只能发生在这两个途径之后.     

Correlation of anaerobic ammonium oxidation and denitrification

The feasibility of the nitrous organic wastewater treated was studied in seven anaerobic sequencing batch reactors（ASBRs） （0^#-6^#） which had been run under stable anaerobic ammonium oxidation （Anammox）. By means of monitoring and data analysis of COD, NH4^#-N, NO2^--N, NO3^--N and pH, and of microbial test, the results revealed that the optimal Anammox performance was achieved from 2^# reactor in which COD/NH4^＋ -N was 1.65, Anammox bacteria and denitrification bacteria could coexist, and Anammox reaction and denitrification reaction could occur simultaneously in the reactors. The ratio of NH4^＋-N consumed ： NO2^- -N consumed ： NO3^- -N produced was 1：1.38：0.19 in 0^# reactor which was not added glucose in the wastewater. When different ratio of COD and NH4^＋-N was fed for the reactors, the ratio of NO2^- -N consumed： NH4^＋-N consumed was in the range of 1.51-2.29 and the ratio of NO;-N produced： NH4^＋ -N consumed in the range of 0 -0.05.     

厌氧氨氧化耦合脱氮系统中反硝化细菌研究

采用聚合酶链式反应、分子克隆等分子生物学方法,通过构建nirS克隆文库研究了厌氧氨氧化耦合异养反硝化脱氮系统中的反硝化微生物.进行同源性分析和系统发育树构建,结果表明,从nirS克隆文库中随机挑选的100个克隆子中有51个阳性克隆子,共分为12个操作单元.经比对发现这些微生物主要为变形菌门细菌和未知菌类,其中β-proteobacteria占据绝对优势且有较多种类,少部分属于 γ-proteobacteria.     

包埋厌氧氨氧化的脱氮特性及其微生物群落结构

采用聚乙二醇二丙烯酸酯作为载体,分别以N,N,N,‘N’-四甲基乙二胺（TEMED）,过硫酸钾（KPS）作为促进剂和引发剂,对厌氧氨氧化菌进行包埋固定化.采用正交试验优化包埋条件,得到的最佳条件为：10% PEGDA单体,0.25% KPS,0.5% TEMED,最佳的操作条件为：聚合温度20℃,聚合时间控制在5min左右,菌胶比选取1：1.包埋颗粒的连续流实验表明,颗粒经过短暂的活性恢复后,脱氮效果不断提升,并且对水力负荷的提高有一定的抗冲击能力.扫描电镜（SEM）表明本实验包埋材料具有很好的生物相容性,且具有良好的传质性能.高通量测序显示,稳定运行一段时间后,颗粒内微生物多样性略有减小,厌氧氨氧化功能菌Candidatus Kuenenia占整个微生物体系比例由6.58%上升至9.8%,微生物种群的变化说明了包埋后厌氧氨氧化性能能够得到更大的提升.     

Quantification of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria in enrichment cultures by quantitative competitive PCR

The anaerobic ammonium-oxidizing (ANAMMOX) bacteria were enriched from a sequencing batch biofilm reactor (SBBR). A quantitative competitive polymerase chain reaction (QC-PCR) system was successfully developed to detect and quantify ANAMMOX bacteria in environmental samples. For QC-PCR system, PCR primer sets targeting 16S ribosomal RNA genes of ANAMMOX bacteria were designed and used. The quantification range of this system was 4 orders of magnitude, from 103 to 106 copies per PCR, corresponding to the detection limit of 300 target copies per mL. A 312-bp internal standard was constructed, which showed very similar amplification e ciency with the target amxC fragment (349 bp) over 4 orders of magnitude (103–106). The linear regressions were obtained with R2 of 0.9824 for 103 copies, 0.9882 for 104 copies, 0.9857 for 105 copies and 0.9899 for 106 copies, respectively. Using this method, ANAMMOX bacteria were quantified in a shortcut nitrification/denitrification-anammox system which was set for piggery wastewater treatment.     

青藏高原不同海拔梯度厌氧氨氧化细菌丰度及其生物多样性空间分布

厌氧氨氧化作为新型微生物氮循环过程,已经成为国内外研究热点.目前对厌氧氨氧化细菌的研究主要集中在海洋生态系统中,而在陆地生态系统外源氮污染物较少的地区是否存在厌氧氨氧化过程且其在氮循环中发挥的作用,还很少有相关报道.本研究应用分子生物学技术研究了氮污染负荷较低的青藏高原地区不同海拔湿地和旱地土壤样品中厌氧氨氧化细菌的丰度及其生物多样性.结果表明,在青藏高原地区,普遍存在厌氧氨氧化细菌.使用厌氧氨氧化细菌特异性引物HSBeta396f/HSBeta742r进行定量发现,厌氧氨氧化细菌丰度随着海拔的升高而降低.垂向尺度上,海拔较低地区表层样品厌氧氨氧化细菌丰度高于底层样品,海拔较高地区则相反.通过构建厌氧氨氧化细菌系统发育分析发现,青藏高原地区厌氧氨氧化细菌的生物多样性较高,且多数可能属于新型厌氧氨氧化细菌.该区域湿地沉积物样品厌氧氨氧化细菌生物多样性明显低于旱地土壤样品.湿地沉积物样品厌氧氨氧化细菌生物多样性与海拔无明显关系,但旱地土壤样品厌氧氨氧化细菌生物多样性随着海拔的增高有上升趋势.     

氨氮对反硝化型甲烷厌氧氧化细菌的影响机理研究

反硝化型甲烷厌氧氧化(Denitrifying Anaerobic Methane Oxidation,DAMO)是以甲烷为电子供体和唯一碳源,以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体的一种氧化还原反应,可用于废水脱氮,而氨氮是含氮废水中存在的主要形式.目前的研究认为主导DAMO过程的微生物主要有DAMO细菌和DAMO古菌.本文以DAMO细菌为优势菌种的系统为研究对象,通过短期和长期试验,从宏观和微观上研究了氨氮对该系统短期和长期的影响,并比较了不同pH体系下影响效果差异,揭示了相关影响机理.短期试验研究表明,氨氮对该系统的安全浓度为250 mg·L~(-1).当氨氮浓度为500 mg·L~(-1)时,对该系统的脱氮效率造成明显的抑制作用,并且随着浓度、时间的增加,氨氮对其的抑制效果增强;不同pH条件下抑制效果的差异对比发现,在碱性条件下,真正起抑制作用的是氨氮的质子化形式FA(Free Ammonia),在中性及酸性条件下,真正起抑制作用的抑制因子是离子化的NH_4~+.通过扫描电镜对系统中絮状污泥分析发现,在氨氮的短期抑制后,系统内的微生物出现了明显皱缩,丝状菌的数量增加;采用高通量测序技术分析了长期氨氮抑制后的系统,结果显示,系统内菌群结构发生较大改变,物种的多样性和丰度都大大降低.通过菌属分析认为,系统脱氮效率的降低是由于Methylomonas(甲基单胞菌属)数量的减少引起的.     

Effect of inorganic carbon on anaerobic ammonium oxidation enriched in sequencing batch reactor

The present lab-scale research reveals the enrichment of anaerobic ammonium oxidation microorganism from methanogenic anaerobic granular sludge and the effect of inorganic carbon(sodium bicarbonate)on anaerobic ammonium oxidation.The enrichment of anammox bacteria was carried out in a 7.0-L sequencing batch reactor(SBR)and the effect of bicarbonate on anammox was conducted in a 3.0-L SBR.Research results,especially the biomass,showed first signs of anammox activity after 54 d cultivation with synthetic w...