1,2,4-三氯苯降解菌的分离及其降解质粒的研究

 以1,2,4-三氯苯为唯一碳源,从天津化工厂氯苯生产车间的土壤中分离到1株1,2,4-三氯苯的降解菌THSL-1.通过形态观察和16SrDNA序列测定,该菌株被初步鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri).经质粒检测,在菌株THSL-1中发现1条质粒条带,将所获得质粒转化到E.coli.JM109中,转化子能以1,2,4-三氯苯为唯一碳源生长,且对1,2,4-三氯苯有降解作用.因此,可以认为该质粒携带降解1,2,4-三氯苯的基因.选用HindIII、BamHI、XholI3种限制性内切酶分别对质粒pTHSL-1进行单酶切、双酶切,最终确定质粒平均大小为40.2kb.     

1,2,4-三氯苯双加氧酶和脱氢酶基因克隆与序列分析

通过PseudomonasnitroreducensJ5-1对不同氯苯类底物的降解实验,发现其降解能力大小顺序为:1,2,4-三氯苯,1,3-二氯苯,1,2-=氯苯,氯苯,与已报道的1,2,4-三氯苯降解菌株在底物利用的特性方面存在差异.采用PCR技术从J5-1中扩增获得氯苯降解过程中的关键酶--氯苯双加氧酶和脱氢酶的基因序列,分别命名为tcbA和tcbB,序列比对发现其与Burkholderia sp-PS12的氯苯双加氧酶和脱氢酶的基因序列同源性最高.通过J5-1的氯苯双加氧酶.亚基(TcbAa)与PS12的氯苯双加氧酶a亚基(TecAl)的氨基酸序列比对发现,在307-310位置有连续4个氨基酸残基的差异(1307L、M308T、1309V、Q310E),这可能是造成2株菌对1,2,4,5-四氯苯降解偏好性差异的原因.此外,通过催化芳香化合物降解的双力D氧酶a亚基的系统进化分析,认为TcbAa属于甲苯/联苯亚科,且与多取代氯苯双加氧酶e亚基的同源性最大.     

Pseudomonas sp.JM2菲降解酶基因解析

Pseudomonas sp.JM2是一株新发现的菲好氧高效降解菌,文章通过对该菌株菲降解基因簇的解析,发现降解关键酶基因均处于质粒上。获得了该菌菲双加氧酶、顺-3,4-二氢二羟基菲脱氢酶、3,4-双羟基菲双加氧酶、2-羟基-2H-苯芘[h]色原烯-2-羧酸盐异构酶、水合-醛缩酶、1-羟基-2-萘甲醛脱氢酶、1-羟基-2-萘甲酸双加氧酶、反式-2'-羧基苄基丙酮酸水合-醛缩酶、2-羧基苯甲醛脱氢酶的基因序列。通过与14种多环芳烃降解菌的基因序列比对,发现JM2降解关键酶的基因序列与产碱杆菌AFK2有96%的同源性,而与同种属的假单胞菌的同源性仅有约55%。进一步用同源模建的方法获得了JM2菲双加氧酶α亚基的关键氨基酸,并结合已知的代谢产物分析,推测该菌株通过邻苯二甲酸途径降解菲,该降解途径与目前已知的假单胞菌菲降解途径不同。实验结果对于评价JM2菲降解物的环境影响、进一步通过基因调控和改造提高JM2的降解能力奠定了基础。     

假单胞菌的氯儿茶酚1,2-双加氧酶基因的克隆和表达

 从土壤中分离得到1株降解2,4-二氯酚(2,4-DCP)能力较强的细菌菌株GT241-1,克隆了该菌株的3,5-二氯儿茶酚1,2-双加氧酶基因(dcpB),采用的克隆策略为:用Southern杂交对dcpB进行定位后,构建重组质粒,再用斑点杂交从重组质粒中筛选目的转化子.经序列测定得知dcpB亚克隆片段全长4303bp,其中dcpB基因编码区765bp.核苷酸和推测的氨基酸序列分析表明,dcpB与已在GenBank登记的相关基因有一定的差异.dcpB基因能够在大肠杆菌转化子中成功地表达有生物活性的酶.     

降解1,2,4-三氯苯的硝基还原假单胞菌J5-1的分离鉴定和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因的克隆

从受氯苯污染的土壤中分离到1株以1,2,4-三氯苯为唯一碳源生长的细菌,命名为J5-1.根据其生理生化特征和16S rDNA(GenBank Accession No.EF107515)序列相似性分析,将该菌株初步鉴定为硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens).当1,2,4-三氯苯初始浓度为400 mg/L时,J5-1对其最大降解率接近90%;当1,2,4-三氯苯浓度初始为20 mg/L时,降解效果最好.J5-1对1,2,4-TCB的降解服从一级反应动力学.从J5-1的基因组DNA中克隆到CC120的全长序列.     

1,2,4-三氯苯矿化菌的鉴定与功能分析

采用同位素示踪法从氯苯污染土壤中筛选到能高效降解1,2,4-三氯苯(1,2,4-TCB)为CO₂的细菌E3和F2,根据其表型特征、16S rDNA序列和荧光原位杂交(FISH)分析,鉴定E3和F2为博德特氏菌（Bordetella sp.）.E3和F2的16S rDNA序列相似性为100%;它们与菌株Bordetella sp. QJ2-5同源性最高,与Bordetella petrii(GDH030510)最接近,同源性分别为100%和99.4%.E3和F2能在含1,2,4-TCB的无机盐培养基中彻底降解1,2,4-TCB生成CO₂,30 d降解率达到90%以上,其中58%和46%矿化为CO₂,同时形成一定量的微生物生物量.     

针铁矿、磁铁矿和石膏对2,4-二氯苯酚厌氧降解的影响

2,4-二氯苯酚(2,4-dichlorophenol,2,4-DCP)常用于农药生产,在水体和土壤中广泛分布,具有难降解、高毒性的特点.通过模拟自然过程,在厌氧反应体系中投加铁氧化物和硫酸盐矿物,重点考察了不同矿物对2,4-DCP降解的影响.结果发现,厌氧体系中针铁矿、磁铁矿和石膏对2,4-DCP均没有明显的吸附作用;质量衡算结果表明所有反应体系中仅发生2,4-DCP向4-氯苯酚(4-chlorophenol,4-CP)的转化;与无外加碳源组相比,乙酸钠的加入使得2,4-DCP的还原脱氯反应速率增大一倍.分析表明针铁矿和磁铁矿加入可刺激脱氯功能菌的生长或活性,进而提高微生物的电子传递能力和2,4-DCP的降解速率;石膏加入强烈抑制脱氯功能菌的生长或活性,进而抑制2,4-DCP的降解.研究结果对认识难生化降解卤代酚在厌氧环境中的迁移转化及环境工程中此类物质的处理具有潜在意义.     

氯苯类化合物的生物降解

经过2个月的驯化,从某染料厂和某毛纺厂活性污泥中分离出能够生长于1,4-二氯苯、1,2,4-三氯苯和六氯苯的4种微生物.通过测定该混合菌降解氯苯类化合物过程中的累积好氧量、微生物生长曲线及降解产物Cl^-的释放,证明在好氧条件下该混合菌能够以1,4二氯苯和1,2,4-三氯苯为唯一碳源和能源,降解产物Cl^-浓度的变化与微生物生长周期有关.通过好氧振荡瓶培养法测得3种氯苯的生物降解顺序为:1,4-二氯苯[356.7μg/(L·d)]>1,2,4-三氯苯[110.4μg/(L·d)]>六氯苯[～6μg/(L·d)],说明氯取代数越多,氯苯类化合物越难被好氧降解.     

BHC降解性质粒的研究

分离获得了一株对β-及γ-BHC均具有一定降解效果的Ⅱ_5-A菌株,该菌在好气条件下以BHC为唯一碳源。检测发现。它携带一个质粒。用丝裂霉素C进行的质粒消除试验表明,凡是消除了质粒的菌株,均丧失在以BHC为唯一碳源的无机盐培养基上的生长能力。该质粒经提取和纯化后,通过转化,成功地转移到大肠杆菌(Escherichia coli C600),使该转化子获得降解BHC的能力,并在转化子中检测出与原菌株电泳泳动度相同的质粒。因此,认为Ⅱ_5-A菌株降解BHC的基因是位于它所携带的质粒上。作者暂将此降解性质粒命名为BHC质粒,并编号为pWE1。     

Isolation of a Pseudomonas Stutzeri strain that degrades 1,2,4-trichlorobenzene and characterization of its degradative plasmid

The genetic information encoding metabolic pathways for xenobiotic compounds in bacteria often resides on catabolic plasmids. The aim of the present work was to know the location of the genes for degrading 1,2,4-trichlorobenzen. In this paper a 1,2,4-trichlorobenzene-degrading strain THSL-1 was isolated from the soil of Tianjin Chemical Plant using 1,2,4-trichlorobenzene as the sole carbon source. The strain was identified as Pseudomonas stutzeri through morphologic survey and 16S rDNA sequence determination. A plasmid was discovered from strain THSL-1 by using the alkali lysis method. When the plasmid was transformed into E. coli. JM109 by the CaCl₂ method, the transformant could grow using 1,2,4-trichlorobenzene as the sole carbon source and had the degradation function of 1,2,4-trichlorobenzene. Therefore, it could be deemed that the plasmid carried the degradative genes of 1,2,4-trichlorobenzene. The average size of the plasmid was finally determined to be 40.2 Kb using selectively three kinds of restricted inscribed enzymes (HindIII, BamHI, and XholI) for single cutting and double cutting the plasmid pTHSL-1, respectively. __________ Translated from China Environmental Science, 2005, 25(4): 385–388 [译自: 中国环境科学]     

基因工程菌强化芳香化合物的处理工艺

分别固定克隆有甲苯加双氧酶基因的工程菌和筛选出的野生菌株,串联两种固定化细胞反应器,研究以基因工程菌突破关键步骤的限制,筛选菌株辅助完成彻底降解芳香类污染物复合工艺可行性和强化效果.克隆有苯降解过程中的关键基因——甲苯加双氧酶的基因工程菌E. coli. JM109(pKST11)对苯具有较高的降解效率和降解速度,应用于固定化细胞反应器中效果突出.在较短的水力停留时间内,可以将1500mg/L苯降解70%,降解速度为1.11mg/(Ls),延长水力停留时间,可以使去除率达到95%以上.该反应器对高浓度的苯具有突出的处理效果.同时所得到的产物为环己二烯双醇,可以被野生非高效菌W3快速利用.     

采用巯基捕收剂稳定化处理垃圾焚烧飞灰中的重金属

研究了3种巯基捕收剂,二乙基二硫代氨基甲酸钠（乙硫氮）、乙基黄原酸钾（乙基黄药）和二丁基二硫代磷酰铵（丁铵黑药）,对垃圾焚烧飞灰中重金属的稳定化效果.3种巯基捕收剂的用量均为62.5　μmol·g^-1飞灰.扫描电镜观察发现,飞灰经稳定化处理后,巯基捕收剂均匀地覆盖于飞灰晶体表面,使矿物晶体棱角变得模糊.利用酸浸提程序（TCLP法）和水浸提程序（水平振荡法）评价飞灰中重金属Cu、Pb、Cd、Cr和Zn的浸出毒性.在0.1 mol·L^-1醋酸浸提条件下,与Na₂S相比,巯基捕收剂对Cu和Pb的稳定化效果较好,其中乙硫氮对Cu的稳定化比率接近100%,丁铵黑药对Pb的稳定化比率达到69.2%;在水浸提条件下,乙硫氮、乙基黄药和丁铵黑药对5种重金属的稳定化比率分别为72.6%、73.5%和76.8%,显著高于Na₂S处理（52.4%）. 3种巯基捕收剂对5种重金属亲和力的强弱顺序大致为Cu＞Pb＞Cr＞Cd＞Zn,并且超过60%的巯基捕收剂与酸可浸提重金属离子发生了螯合沉淀反应.重金属-巯基捕收剂絮凝物在中性和碱性条件下（pH>6）比较稳定,在酸性条件下（pH<6）可发生部分溶解.为获得较好的重金属稳定化效果,维持稳定化飞灰的高酸缓冲容量十分重要.     

固定化工程菌对偶氮染料脱色及强化作用

利用聚亚胺酯大孔泡沫吸附固定基因工程菌Escherichia coli JM109 (pGEX-AZR),研究其对偶氮染料的脱色动力学及生物强化作用.实验表明,固定的E.coli JM109(pGEX-AZR) 对酸性大红GR的脱色动力学符合Andrews方程,动力学常数为μ_max,c、K_c、K_ic分别为49 .2 mg·(g·h)^-1、710 .43 mg·L^-1和681 .62　mg·L^-1,R²为0 .995.将固定的E.coli JM109(pGEX-AZR)按10%的比例投加到厌氧序批式活性污泥反应器中连续运行32 d,含有固定化工程菌的强化体系耐浓度冲击的能力和脱色率均高于对照体系,脱色率可以稳定在90%以上.利用RISA对其微生物群落结构进行分析,E.coli JM109(pGEX-AZR)及降解酸性大红GR的优势菌群可以在污泥体系中稳定存在.     

MWNTs/TiO2对典型氯苯类化合物的光催化降解研究

研究复合光催化剂MWNTs/TiO2对典型氯苯类有机化合物光催化降解动力学及主要光降解路径.结果表明,同一初始浓度和相同光催化降解实验条件下,60min时典型氯苯类有机化合物的光降解率均达到90%以上.其中六氯苯和五氯苯的光催化降解速率常数分别为0.0664h-1和0.0670h-1,其大小明显高于其它氯苯类化合物.1,二氯苯的光催化降解反应速率常数仅为0.0430h4--1,在典型氯苯类化合物中最小.三氯苯的3种同分异构体——1,3-三氯苯、24-三氯苯和1,5-三氯苯的光催化降解速率常数分别为0.0547h2,1,,3,-1、0445h0.-1和0.0439h-1.六氯苯的主要光催化降解路径为:HCB→PeCB→1,2,3,5-TeCB→1,2,4-TCB→1,4-DCB.     

1,2,4-三氯苯对斑马鱼生殖和胚胎发育毒性效应

采用斑马鱼胚胎早期发育技术研究了1,2,4-三氯苯(1,2,4-TCB)对成年斑马鱼(Danio retio)和斑马鱼受精卵染毒后胚胎生命早期阶段生长发育的影响.结果发现,大于5mg/L 剂量的1,2,4-TCB有明显发育毒性,会导致胚胎致畸,引起胚胎凝集或死亡.1,2,4-TCB对成年斑马鱼和斑马鱼受精卵染毒后,胚胎的致死率均与1,2,4-TCB处理之间呈现时间-效应和剂量-效应关系.高浓度的(15 mg/L) 1,2,4-TCB对成年斑马鱼的染毒,其平均产卵量和受精率均降低.成年斑马鱼或者受精卵接触1,2,4-TCB后,胚胎发育中典型的非致死效应—心包囊水肿和脊柱畸形的比例均随着1,2,4-TCB的浓度升高而逐渐升高.同浓度1,2,4-TCB处理后,斑马鱼胚胎直接染毒造成的非致死毒性效应更强.结果表明,水体中残留的1,2,4-TCB对于鱼类的生殖和发育具有潜在的危害.     

附着剑菌对三氯联苯的吸附及降解机制研究

实验研究附着剑菌(Ensifer adhaerens.R2)对持久性有机污染物三氯联苯(2,4,4′-TCB,PCB28)的去除机制,探究菌株对2,4,4′-TCB的生物吸附和生物降解作用,以及其随时间、pH值、温度、菌体密度、金属离子(Ca2+、Mg2+)的变化.灭活菌体对PCBs的去除机制为生物吸附,吸附率在2h基本达到平衡,为85.97%;活体菌株可以通过生物吸附及生物降解作用去除2,4,4′-TCB,在本次实验周期内主要以吸附作用为主,2h吸附率为60.59%,明显高于降解率的12.90%.单因素条件下,pH值为6.0、35℃、OD为0.8、添加1mol/L的Ca2+、Mg2+处理可使活菌对2,4,4′-TCB的吸附达到最优;pH值为7.5,30℃,添加0.05mol/L的Ca2+、Mg2+处理可使活菌对2,4,4′-TCB的降解达到最优.