西维因对雄性罗非鱼(GIFT Oreochromis niloticus)内分泌干扰效应的研究

在实验室条件下研究了西维因对罗非鱼的急性毒性以及在不同暴露浓度下的西维因(0.064,0.8和5mg·L-1)对雄性罗非鱼性腺系数、血清雌二醇、睾酮含量的影响以及对卵黄蛋白原的诱导效应,以期对其环境雌激素效应研究有所贡献。结果表明:西维因对罗非鱼的24、48、72和96h的LC50分别为30.21、25.16、19.76和17.86mg·L-1。长期暴露于低剂量的西维因中,会使雄性罗非鱼精巢系数降低;对其血清雌二醇的合成具有诱导作用,当浓度为0.8mg·L-1时,诱导作用最强,此时血清雌二醇的含量为218.83pg·mL-1;卵黄蛋白原的含量随着西维因浓度的升高,逐渐增多,当处理浓度为5mg·L-1时,达到最大为393.01μg·L-1;随着西维因浓度的升高,睾酮含量逐渐降低,西维因的浓度为5mg·L-1时,睾酮含量达到10.58mol·L-1,差异极显著(p<0.01),这可能是由于西维因对雄性罗非鱼具有雌激素效应。     

17α-甲基睾酮对稀有鮈鲫幼鱼性腺发育与血清卵黄蛋白原水平的影响

17α-甲基睾酮是一种人工合成雄激素,在水产养殖以及医药行业中广泛使用,其对鱼类的内分泌干扰效应研究工作相对较少.通过甲基睾酮对稀有鲫幼鱼的42天流水暴露,观察了其性腺发育和生物标记物变化.在500ng·L-1甲基睾酮暴露组中幼鱼生长受到抑制(p≤0.05),在50ng·L-1以上暴露组中性腺指数显著增加(p≤0.05),雄性个体比率明显升高.通过组织学观察发现,50ng·L-1以上浓度甲基睾酮暴露后卵巢组织切片中出现了精子细胞,且精子细胞数量随剂量的增加而增加.通过生物标记物卵黄蛋白原测定发现,在50ng·L-1以上浓度甲基睾酮暴露后,稀有鲫幼鱼血清中的卵黄蛋白原水平显著增加(p≤0.05).综合分析,17α-甲基睾酮主要表现出雄激素效应,而其在稀有鲫体内的代谢物则能够应激卵黄蛋白原,对稀有鲫幼鱼的最低可观察效应浓度(LOEC)为50ng·L-1.因此,仅依靠体内卵黄蛋白原应激单项指标不能准确判定化学品是否是环境类雌激素.     

苯并（a）芘对雄性罗非鱼肝脏Vtg mRNA表达的影响

卵黄蛋白原（Vitellogenin，Vtg）是检测环境雌激素的重要生物标志物，雄性鱼类VtgmRNA是检测环境雌激素的新兴生物标志物。为研究BaP是否具有环境雌激素效应，本试验对罗非鱼Oreochromis niloticus Vtg mRNA进行研究，用总RNA提取试剂盒提取得到雌鱼肝脏总RNA，以转录得到的cDNA为模板，以Primer设计得到的引物，得到422bp的罗非鱼卵黄蛋白原特异性eDNA扩增片段；采用荧光定量PCR法检测10、50Hg-L。的BaP暴露对罗非鱼肝脏Vtg基因表达的影响，结果发现4d、17d时雄性罗非鱼肝脏内VtgmRNA表达量与对照组无差异（P〉0．05），10d时10、50ug·L-1 2个剂量组VtgmRNA表达量显著高于对照组（P〈0．01），分别是对照组的113．18倍和121．79倍。结果意味着BaP可能具有环境雌激素效应。     

壬基酚和双酚A对雄性斑马鱼(Danio rerio)卵黄蛋白原mRNA的诱导效应

为了对野外环境中内分泌干扰物更快速有效地进行检测,运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了17β-雌二醇(E2)、壬基酚(NP)和双酚A(BPA)对雄性成体斑马鱼肝脏合成卵黄蛋白原(VTG)mRNA的诱导作用,并初步探讨了VTGmRNA体内代谢动力学模式.结果表明,随着暴露浓度的升高(E2:20、100、250、500ng·L-1;NP:20、100、250、500μg·L-1;BPA:50、100、250、500、1000μg·L-1),VTGmRNA表达量均显著增加,VTGmRNA表达量与暴露浓度具有明显的剂量-效应关系.在10d的暴露期内,随着暴露时间的延长,VTGmRNA表达量均显著增加,VTGmRNA表达量与暴露时间呈明显的时间-效应关系;停止暴露后,VTGmRNA表达量迅速下降,E2诱导的表达消失得最快(4d),而NP、BPA诱导的表达持续时间相对较长(6d).     

烷基酚类化合物的联合雌激素效应

利用鲫鱼卵黄蛋白原诱导作用的雌激素效应研究烷基酚类化合物的联合雌激素效应,通过对鲫鱼血浆卵黄蛋白原含量的相对变化和化合物暴露浓度的非线性回归分析得出17β-雌二醇(E2)、辛基苯酚(PP)、壬基苯酚(p353-NP)及其等毒性同定比例混合物雌激素效应的剂量-反应关系,应用相加作用数学模型根据单个化合物的剂量反应关系可预测混合物效应,各化合物非线性回归分析结果均以Weibull函数拟合效果最好,决定系数R2分别为0.93,0.94,0.96和0.81,半效应浓度值EC50及其95%置信区间分别为0.092(0.080-0.107),63.89(53.90-71.26),152.61(140.11-168.38),11.11(8.54-14.00)μg·l-1;在各个浓度范围内,得出的混合物效应与通过浓度相加或反应相加模型计算得出的混合物效应有很好的一致性,而简单效应相加法得出的结果误差较大;表明了3种雌激素化合物呈现相加作用方式,在低于单个化合物的有效作用浓度下也会产生显著的混合物效应,效应大小取决于化合物的作用性质、暴露量和质量比例.     

2，4’-DDT对斑马鱼生长、繁殖力及卵黄蛋白原的影响

以斑马鱼体内卵黄蛋白原（Vtg）作为雌激素污染物的生物标志物，比较研究了不同浓度2，4。DDT对成年斑马鱼生长、发育、繁殖以及体内Vtg含量的影响。结果表明，当水环境中p（2，4。DDT）为2和10μg·L-1时，斑马鱼产卵量和受精率与空白和溶剂对照组相比均显著下降（P〈0．05）。当水环境中P（2，4。DDT）为0．2、2和10μg·L-1时，斑马鱼肝脏指数与空白和溶剂对照组相比显著升高（P〈0．05）；10μg·L。2，4。DDT处理组雄性斑马鱼体内Vtg含量显著高于空白和溶剂对照组（P〈0．05），而0．2、2和10μg·L～2，4。DDT处理组雌性斑马鱼体内Vtg含量均显著高于空白和溶剂对照组（P〈0．05），且随暴露浓度的增加而增大。SDS—PAGE检测及免疫印迹分析均显示雄鱼血液内出现Vtg特异条带，表明2，4。DDT对斑马鱼具有雌激素效应。     

多氯联苯对孔雀鱼卵黄蛋白原的诱导及检测

为探讨利用孔雀鱼(Poecilia reticulata)卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)作为生物标志物检测环境雌激素的可行性,采用浸浴法分别使用17β-雌二醇(E2)和多氯联苯(PCBs)对雄性孔雀鱼成鱼进行染毒,30d后测定其性腺系数(GSI)和肝指数(LSI),并将鱼体整体匀浆进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及磷、脂和糖蛋白特异染色分析.结果表明,PCBs对雄性孔雀鱼具有雌激素效应,和E2均可以诱导雄性孔雀鱼体内产生Vtg,但诱导组雄鱼GSI及LSI与对照组比较均无显著性差异(p>0.05).Native-PAGE及磷、脂、糖蛋白特异性分析表明,孔雀鱼Vtg是一种富含磷、脂、糖的蛋白,具有VtgⅠ、VtgⅡ和VtgⅢ等3种形式,其分子量分别为642kDa、541kDa和441kDa.雄性孔雀鱼Vtg可作为环境雌激素监测的有效生物标记物.     

双酚AF对雄性斑马鱼卵黄蛋白原水平与芳香化酶基因表达的影响

双酚AF(4,4'-六氟-2-二酚,BPAF)对生物有机体具有内分泌干扰作用。为研究低剂量BPAF对水生生物的效应,本研究选择成年雄性斑马鱼为研究对象,考察了0.005、0.05和0.5 mg·L~(-1)3种浓度BAPF暴露30 d对血浆中卵黄蛋白原(VTG)含量、2种卵黄蛋白原基因(vtg~(-1)和vtg-3)表达和2种芳香酶基因(cyp 19a与cyp 19b)表达的影响。结果表明:在0.005 mg·L~(-1)浓度暴露30 d后,血浆中VTG含量显著升高,随着暴露浓度的升高,促进作用不显著;BPAF暴露对不同组织中的4种基因存在不同的影响,0.005 mg·L~(-1)BPAF暴露可诱导脑部cyp19b、肝脏中cyp19a和性腺中vtg~(-1)、vtg-3和cyp19b基因表达;0.5 mg·L~(-1)BPAF暴露可导致肝脏中vtg~(-1)、vtg-3、性腺中cyp19a等基因显著上调。实验结果表明,BPAF具有雌性激素样效应,可诱导雄性斑马鱼体内部分组织卵黄蛋白原基因和芳香酶基因的表达。BPAF可引起斑马鱼血浆中的VTG含量的上升,从而干扰由VTG所参与的下丘脑-垂体-性腺轴与免疫系统的正常生理过程。     

氨氮胁迫下罗非鱼（GIFT Oreochromis niloticus）机体免疫力的变化及其对海豚链球菌易感性的影响

研究了不同作用时间（0、24、48、96和120 h）下不同质量浓度氨氮（对照组、1、3、5和10 mg·L-1）对罗非鱼（GIFT Oreochromis niloticus）血清SOD、AKP、溶菌酶和补体C3活性的影响,以及不同质量浓度氨氮（对照组、1、3、5和10 mg·L-1）胁迫下罗非鱼对海豚链球菌的易感性。结果显示：在1.0 mg·L-1氨氮质量浓度下,罗非鱼血清SOD活性在24 h受到诱导;在3.0、5.0和10.0 mg·L-1氨氮质量浓度下,罗非鱼血清SOD活性均受到抑制,最大抑制率分别达18.85%、23.47%和38.46%。在1.0 mg·L-1氨氮质量浓度下,罗非鱼血清AKP活性在0-96 h呈先降低后恢复的趋势;5.0和10.0 mg·L-1实验组的血清AKP活性在24-120 h则一直受到抑制。1.0 mg·L-1实验组的罗非鱼血清溶菌酶活性在24-120 h一直无显著变化,3.0、5.0和10.0 mg·L-1实验组的血清溶菌酶活性随着氨氮质量浓度的升高而降低。1.0 mg·L-1实验组的罗非鱼血清补体C3活性在各个采样时间下均大于对照组,而5.0和10.0 mg·L-1实验组补体C3活性始终受到抑制。罗非鱼对海豚链球菌的易感性实验研究显示,置于3.0、5.0和10.0 mg·L-1的罗非鱼的累积死亡率分别为43.33%、46.67%和63.33%,显著高于对照组和1.0 mg·L-1实验组,表明氨氮质量浓度超过3.0 mg·L-1能够增加罗非鱼对海豚链球菌的易感性。本实验认为,超过3 mg·L-1的氨氮质量浓度胁迫能够显著降低罗非鱼的免疫力,增加对海豚链球菌的易感性。因此在罗非鱼健康养殖中,调控并降低氨氮质量浓度非常重要。     

弱阴离子交换-超滤两级纯化浓缩真鲷卵黄蛋白原

利用弱阴离子交换色谱,从雌激素17β-雌二醇诱导的真鲷鱼血清中分离纯化出卵黄蛋白原粗组分,以超滤法进一步除去杂质蛋白,并脱盐浓缩,获得纯度较高的卵黄蛋白原(Vtg),两级纯化得到的Vtg经常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)分析,证实真鲷鱼Vtg有三种形式,分子量分别为665kDa,635kDa和355kDa;变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,它们由185kDa左右的蛋白亚基组成.     

Seasonal cycle of gonadal development and serum levels of vitellogenin of the red porgy, Pagrus pagrus (Teleostei: Sparidae)

Histological examination of gonads of female and male red porgy, Pagrus pagrus, reared in captivity, was carried out in order to describe the main gonadal changes related to gametogenesis and the seasonal changes of environmental factors. The gonadosomatic index (GSI) and the concentration of serum vitellogenin (VTG) were also determined. The frequency distribution of gonad development stages and the GSI and vitellogenin concentration during the annual cycle indicated the separation of the female and male reproductive cycles into three main periods. The autumn period when gametogenesis begins (October-November), the period of exogenous vitellogenesis (December-March) or spermiation (December-March), and the spawning season (March-May). The spawning period coincided with an increase in temperature (15-19°C) and daylength. Serum levels of vitellogenin rose significantly in January, reached a peak at the beginning of the spawning period (March, 405.5 µg ml^-1) and remained high until the end of the spawning period (May).     

新型阻燃剂TCPP对斑马鱼的毒性研究

为了明确新型阻燃剂磷酸三(2-氯丙基)酯(TCPP)的生态风险,本研究采用斑马鱼为模式生物,评价了TCPP对成鱼和胚胎的毒性效应。急性毒性研究结果表明,TCPP对斑马鱼成鱼的96 h致死中浓度(LC50)为47.06 mg·L~(-1),而对胚胎96 h-LC50为26.01 mg·L~(-1),且会影响胚胎的正常发育,导致孵化出的仔鱼产生畸形。成鱼14 d延长毒性试验结果表明,TCPP对斑马鱼成鱼的无可观察效应浓度(NOEC)为1.00 mg·L~(-1),染毒暴露后肝脏和性腺指数随TCPP浓度增加轻微下降,但肝脏中卵黄蛋白原(VTG)的含量和性腺中芳香化酶的活性随TCPP浓度增加普遍升高。此外,TCPP的暴露还会导致斑马鱼脑垂体中合成促性腺激素的相关基因表达量增加。因此,TCPP对斑马鱼成鱼和胚胎的急性毒性均为低毒级,但长期暴露会干扰内分泌系统的调控功能,影响斑马鱼的正常发育。     

微纳尺度SiO2对雄性大鼠生殖功能损伤的实验研究

为了探讨纳米与微米尺度SiO2对雄性大鼠的生殖毒性作用,选择不同剂量的纳米SiO2(20～40nm)与微米SiO2(1～10μm)采用气管滴注方式对雄性Wistar大鼠分组染毒.于染毒5周后处死大鼠,检查附睾精子形态,并检测睾丸组织和血清中睾丸功能标志酶活性变化以及性激素含量的变化.结果表明:1)高、低剂量的纳米和微米SiO2染毒均可使大鼠发生程度不同的精子数量减少、精子活动率降低、精子畸形率升高;2)纳米SiO2染毒可使大鼠睾丸组织SDH、LDH和血清中ACP活性显著降低,而微米SiO2染毒对这些指标的影响不显著;3)纳米SiO2和高剂量微米SiO2染毒可使大鼠血清T和睾丸匀浆T浓度显著降低,而对血清LH没有显著影响;4)与微米SiO2相比,纳米SiO2对大鼠生殖功能的损伤有更严重的趋势,但相同剂量下,纳米SiO2和微米SiO2相比,各指标均无显著性差异.以上结果表明,微米和纳米尺度SiO2染毒均可使大鼠生殖功能产生损伤,使部分生殖功能指标发生显著变化;与微米SiO2相比,纳米SiO2对大鼠生殖功能的损伤有更严重的趋势.     

VALIDATION OF AN ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) FOR CYPRINUS CARPIO L. VITELLOGENIN, AS A BIOMARKER OF REPRODUCTIVE DISORDERS

Vitellogenin is a female sex-specific protein, and a validated and suitable method for its assay can be applied as a biomarker of reproductive disorders in male and female aquatic animals. Therefore, the present study was designed to validate an ELISA for measuring plasma vitellogenin in wild carp ( Cyprinus carpio L.) living in the Lake of Trasimeno (Umbria, Italy); plasma samples were taken during pre-spawning, spawning, and post-spawning periods; in addition to vitellogenin, in both male and female carps, plasma changes of estradiol-17 βwere monitored together with those of estrogen receptor density in the liver.

In females, VTG showed high seasonality, reaching the highest levels in March during the pre-spawning period; the VTG levels correlated with those of estradiol-17 β( E 2 ), and with the changes of gonadosomatic index (GSI), while a non parallel trend was found in the liver estrogen receptor (ER) density. In forty percent of males, VTG was found to be present in the plasma and changes of ER density in the liver were observed.

The data here reported suggest that the common carp can be a useful sentinel species for biomonitoring studies of environmental estrogens, and of their effects on its reproductive biology.     

Validation of an enzyme linked immunosorbent assay (elisa) for cyprinus carpio l. vitellogenin,as a biomarker of reproductive disorders

Vitellogenin is a female sex-specific protein, and a validated and suitable method for its assay can be applied as a biomarker of reproductive disorders in male and female aquatic animals. Therefore, the present study was designed to validate an ELISA for measuring plasma vitellogenin in wild carp ( Cyprinus carpio L.) living in the Lake of Trasimeno (Umbria, Italy); plasma samples were taken during pre-spawning, spawning, and post-spawning periods; in addition to vitellogenin, in both male and female carps, plasma changes of estradiol-17 g were monitored together with those of estrogen receptor density in the liver. In females, VTG showed high seasonality, reaching the highest levels in March during the pre-spawning period; the VTG levels correlated with those of estradiol-17 g ( E 2 ), and with the changes of gonadosomatic index (GSI), while a non parallel trend was found in the liver estrogen receptor (ER) density. In forty percent of males, VTG was found to be present in the plasma and changes of ER density in the liver were observed. The data here reported suggest that the common carp can be a useful sentinel species for biomonitoring studies of environmental estrogens, and of their effects on its reproductive biology.