新疆罗布泊外围地区极端环境嗜碱放线菌生物学特性及活性物质筛选

2006～2007年从新疆罗布泊外嗣地区的泥土样品中分离了117株放线菌,初步筛选后对其中47株嗜碱放线菌进行了形态学鉴定,不同生长条件(pH值,盐NaCl、KCl、MgCl_2,碱性物质Na_2 CO_3、K_2CO_3、Mg_2CO_3、NaOH、KOH,温度)对菌株生长的影响,拮抗性、产酶活性检测及菌株LA4的分子进化鉴定等研究.结果发现,47株放线菌的15%属于诺卡氏菌属,70%属于链霉菌属,10%属于游动放线菌属,其中嗜碱链霉菌属占优势.在pH 7～11范围内,47株嗜碱放线菌均能生长.生长率为92%～95%.NaCl、KCl、MgCl,对嗜碱放线菌均具有抑制作用,NaCl、KCl的抑制作用高于MgCl_2,NaCl、KCl浓度超过10%时而MgCl_2 浓度超过15%时嗜碱放线菌完全停止生长.47株嗜碱放线菌对Na_2CO_3、K_2CO_3、MgCO_3、KOH、NaOH等碱性物质没有选择性,生长良好.47株嗜碱放线菌的最适生长温度为28～30℃.超过55℃后均不能生长.从47株嗜碱放线菌中筛选出了30株具有抗菌活性的菌株,其中对大肠杆菌有抑制作用的有11株,占36.7%,对金黄色葡萄球菌有抑制作用的有20株,占66.7%,对枯草杆菌有抑制作用的有16株,占53.3%;其中4株嗜碱放线菌LA4、LA24、LA33和LA19对3种指示菌均表现出抑制作用.在47株嗜碱放线菌中,74%具有淀粉酶活性,81%具有纤维素酶活性,43%具有蛋白酶活性,49%具有脂肪酶活性.通过分子鉴定,发现LA4为链霉菌中尚未报道的一个新亚种,其16S序列GenBank登录号为FJ182229.本研究结果表明新疆罗布泊外围地区存在大量的产纤维素酶、淀粉酶的嗜碱放线菌,并且潜藏着新的放线菌资源,为该地区嗜碱放线菌的种质资源开发和新药筛选有效菌源提供了参考.图5表4参20     

四川盐边植烟土壤放线菌的遗传多样性及抗菌活性

从四川省盐边县代表性烟草种植区域的植烟土壤样品中分离出52株放线菌菌株,采用16S rDNA限制性片段长度多态性(16S rDNA-RFLP)和16S rDNA序列分析研究了其遗传多样性及系统发育地位,并初步探索了其抗菌活性.16S rDNA-RFLP分析结果表明,在非加权组平均法(UPGMA)聚类图中,所有菌株在75%的相似水平上聚为一类,而在88%的相似水平上分为8个遗传类型.在主成分分析聚类图中,供试菌株可分为5个类群,揭示了植烟土壤放线菌菌株具有一定的遗传多样性.代表菌株系统发育分析显示,供试菌株均属于链霉菌属(Streptomyces),链霉菌是植烟土壤中的绝对优势放线菌.初筛结果显示,共有13株菌株表现出了一定的抗菌活性,而在复筛中仅有3株表现较好.根据初筛和复筛结果选择菌株SAUAS3-2进行玉米盆栽试验,结果表明,该菌株具有一定抗菌活性的同时还具有促生作用.本研究揭示了盐边县植烟土壤具有丰富的放线菌资源.     

一株放线菌对铜绿微囊藻的溶藻活性

从庐山土样中分离得到一株放线菌JXJ 0071,研究了该菌的孢子、菌丝体和代谢产物对铜绿微囊藻(Micro-cystis aeruginosa)的溶藻活性以及溶藻活性成分的稳定性,并对其分类地位进行鉴定。结果表明,放线菌JXJ 0071的孢子和菌丝体均能使铜绿微囊藻细胞密度显著降低。该菌代谢产物对铜绿微囊藻具有很强的溶藻活性,在藻密度为1.0×107 mL-1的藻液中加入体积分数φ为2%的该菌发酵上清液3,d后溶藻效率达98%。溶藻活性成分主要来自水溶性胞外产物,其对高温、pH和紫外线处理均具有较好的稳定性。以60℃以下的温度处理发酵液2h,溶藻活性成分的溶藻效率基本不变,保持在95%以上;pH 7.0～9.0条件下,其溶藻效率仍很高,在93.8%以上;经波长为254 nm的紫外线照射2 h,其溶藻效率仍达85.7%。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,该菌株属链霉菌属,与Streptomyces rectiviolaceus的序列相似性达99%,但JXJ0071与S.rectiviolaceus的部分生理生化特性有所不同,需要进一步的实验数据确定其种一级分类学单元。     

一株抗肿瘤放线菌的鉴定及生物活性

为开发青藏高原沙地生态系统放线菌资源,首次从位于青藏高原东北部的青海湖沙岛土壤样品中选择性分离培养出一株具明显抑菌及抗肿瘤活性放线菌Sd-31.通过生理生化特性、化学分类学以及16S rRNA序列分析鉴定,菌株为砖红链霉菌,命名为Streptomyces lateritius Sd-31;双层琼脂法检测菌株抑菌活性,表明菌株对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)有显著抑制作用;通过Hoechst染色荧光显微镜观察及MTT法细胞毒性试验,确定菌株发酵液有明显的诱导肿瘤细胞凋亡活性且与处理浓度成正相关;纸片法研究菌株发酵液活性稳定性,结果表明,20~80℃处理后发酵液抑菌活性稳定,100℃条件处理后发酵液抑菌活性降低;在酸性及中性条件下发酵液活性稳定,碱性条件下随着pH值的增加发酵液抑菌活性降低.以上结果为抗肿瘤药物的研究提供了理论数据.     

青藏高原东部几种自然土壤放线菌的生态分布

采用常规方法研究了青藏高原东部几种自然土壤中放线菌区系及与土壤养分的关系.结果表明①供试土壤有机质、全氮、速效氮、速效钾及速效磷含量变异很大,其变异系数分别为71.9%,60.8 %,65.8%,53.5 %及130.6%.pH差异很小,平均值为8.16,变异系数为6.5 %.②供试土壤放线菌数量n(cfu)=(8.2～1 472.7)×104 g-1.放线菌组成以链霉菌为主,其次为小单孢菌,二者分别占土壤放线菌总数的41.7%～90.9%及 0～53.6%,其平均值和变异系数分别为82.2%和18.0%及10.3%和154. 2 %.沼泽土中小单孢菌占放线菌总数的53.6%,盐化土中无小单孢菌.高山草甸土、森林棕褐土、黑钙土及灰钙土中分别出现链孢囊菌属与马杜拉菌属、间孢囊菌属、诺卡氏菌属及链孢囊菌属.③在链霉菌属中,可划分10个类群,其中白孢类群、灰褐类群、金色类群、粉红孢类群为优势类群,分别占链霉菌总数的23.3 %～57.0%, 2.7%～32.8 %,5.8%～63.7 及2.3% ～24.6%,其次为淡紫灰类群和灰红紫类群,6个类群共占链霉菌总数的70.3%～100%.盐化土和黑钙土分别为链霉菌数量与类群最少和最多的土壤生态体系.④供试土壤按植被、土壤形成条件及土壤性质分为高山草甸土、森林棕褐土、黑钙土、灰钙土、栗钙土、盐化土、风沙土及沼泽土8种生态类型、盐化土、风沙土和沼泽土3种生态型中放线菌的生物多样性较其余5种生态型差. 表5 参16     

中国红豆杉内生放线菌En-1的分离、鉴定及其次生代谢物的研究

采用选择性分离方法对药用植物红豆杉Taxus chinensis嫩枝和叶进行内生菌分离,得到一株放线菌En-1,经鉴定为链霉菌Streptomyces sp.;并对该菌进行液体培养条件优化、次生代谢物初筛及其抗菌活性的研究。通过添加宿主植物浸出物至En-1液体培养中以考察宿主对后者生长的影响,结果表明红豆杉叶浸出物能促进En-1的体外生长;而且En-1次生代谢物对5株供试菌中的黑曲霉具有抑制活性。通过En-1菌培养基优化并联合波谱法检测其发酵产物,显示8#配方（淀粉25 g.L-1,KNO3 1 g.L-1,K2HPO4.3H2O 0.5 g.L-1,NaCl 0.5 g.L-1,FeSO4.7H2O 0.01 g.L-1,MgSO4.7H2O 0.5 g.L-1）培养液中,En-1所产的次生代谢物最具结构多样性;同时8#配方也有利于该菌产生抗菌活性产物。本研究提示红豆杉内生放线菌可作为寻求药物先导化合物的资源菌。     

青海省保护地辣椒根际土壤和根表放线菌研究

采用常规方法研究了青海省大棚和温室中辣椒健株、病株根际土壤和根表的微生物数量、放线菌组成及拮抗性放线菌的分布。结果表明：（1）青海保护地辣椒根际土壤和根表微生物以细菌为主，放线菌次之，真菌最少，三者数量之比为10^5：1：1(根表）；（20根际微生物数量和土壤速效N、P、K含量密切相关，速效养分含量高的土壤中微生物数量大。辣椒病株根际土坟和根表细菌、放线菌及真菌三大类微生物数量显著高于健株。（3）保护地辣椒根际土壤和根表放线菌组成较复杂，共分离到了7个属的放线菌，但仍以链霉菌为主，其次为小单孢菌和马杜拉放线菌。链霉菌可分为10个类群，金色类群占优势。健株根际土壤和根表放线菌组成较病株复杂，而链霉菌组成较病株简单。（4）供试放线菌菌株中9.0%对G^ 细菌有拮抗活性，6.7%对真菌有拮抗活性，对G^-细菌均无拮抗作用，健株根际土壤拮抗性放线放菌数量及其占放线菌总数的比例均高于病株，健株根表拮抗笥放线菌占放线菌总数的比例亦高于病株，表明根际土壤中拮抗性放线菌的数量及根际和根表拮抗性放线菌占放线菌总数的比例是决定辣椒是否染病的关键因素之一。表4参11。^^^^^^^^^     

河南省不同类型土壤可培养放线菌多样性及拮抗活性菌株筛选

分别从河南省濮阳、南阳、信阳、三门峡和商丘等地区采集潮土、黄棕壤、水稻土、褐土、盐碱土等土壤样品45份,采用8种不同的分离培养基对土壤放线菌进行分离和培养;通过16S rRNA基因序列分析对可培养放线菌进行分类鉴定;以7种植物病原菌为靶标,通过对峙培养筛选拮抗活性菌株,并对具有拮抗活性菌株的次级代谢产物合成相关基因进行初步筛查.结果表明,从5种类型土壤中分离得到放线菌分离物955株,分布于放线菌门的10个目12个科17个属,包含626个物种,其中9个分离物为潜在的新种;分离物中链霉菌属菌株751株,占分离菌株的78.64%,为最主要的优势菌属,稀有放线菌204株,占21.36%;不同类型土壤放线菌的分离频率存在一定的差异,其中褐土分离的放线菌数量最多,水稻土的分离数量最少,但是各类型土壤分离的可培养放线菌在属水平上差异不大;筛选获得对植物病原菌有拮抗活性的菌株392株,占总分离物的41%,其中链霉菌332株,占总拮抗活性菌株的84.7%,稀有放线菌60株,占总拮抗活性菌株的15.3%,且多数活性菌株含有多种生物活性物质合成相关的功能基因.由此可见,河南省土壤放线菌多样性丰富,并蕴藏丰富的稀有放线菌和拮抗活性放线菌资源,具有发掘放线菌新物种和新活性化合物的潜力.(图4表6参33附表1)     

生防放线菌剂对魔芋根域微生物区系的影响

为从微生态角度探索接种生防放线菌剂对魔芋根域微生物区系的影响,以生防放线菌娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)、濑里予链霉菌(S.senoensis)和M(肉质链霉菌S.carnosus和密旋链霉菌S.pctum按质量比1:1的固态发酵混合制剂)为接种剂,采用基质拌菌法接种生防菌剂进行盆栽试验,通过稀释平板法测定魔芋根区、根表土壤和根内放线菌、细菌及真菌数量并采用分子生物学技术对优势真菌和细菌进行分类鉴定.结果显示:(1)3种菌剂接种164 d,魔芋根域检出的接入放线菌活菌数量高达106 CFU g-1以上,根表土壤中放线菌数量较对照增加24.6%-263.1%;(2)供试3种菌剂接种164 d后,魔芋根域真菌数量减少18.9%-100.0%,且接种处理魔芋根域有害优势真菌腐皮镰孢菌(Fusarium solani)和红球丛赤壳菌(Nectria haematococca)较未接种对照大幅度降低;(3)不同菌剂接种处理,魔芋根区土壤和根内细菌数量较对照减少21.5%-73.3%,但根内芽孢杆菌(Bacillus sp.)数量增加414.0%-1015.0%.本研究表明供试生防菌具有较稳定的定殖能力,亦能改善魔芋根域土壤微生物区系.     

一株抗青枯假单胞菌放线菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

从河南中牟土壤中筛选出一株对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)有较强拮抗作用的放线菌ZM-16,它对几种常见病原细菌和真菌都有较强的抑制效果,其发酵液抗菌谱较广.通过菌株形态特征、培养特性、生理生化特性、化学特征研究以及16SrRNA序列分析,初步确定菌株ZM-16为链霉菌属的抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus).通过发酵优化实验,确定该菌株的最佳发酵配方为:蔗糖8%、大豆粉5%、NaNO31%、NaCl0.2%、CaCO30.4%、K2HPO40.08%;最佳发酵条件为:发酵培养基初始pH值7.0,30℃,恒温摇床200r/min,培养6d,抑菌效果最好.