茶树CSD1基因及其启动子克隆与低温胁迫下的表达

低温寒害严重影响茶树的生长发育状况及成品茶品质,Copper/zinc-superoxide dismutase(CSD)基因在植物抗胁迫响应中起着关键作用.为了解茶树CSD基因(CsCSD)响应低温胁迫的作用机制,以铁观音茶树叶片为供试材料,采用同源克隆结合RACE方法及染色体步移法,获得茶树CSD1基因的cDNA序列(GenBank登录号:KR078346)、gDNA序列及其启动子序列,并对其进行生物信息学分析,同时对低温胁迫处理下CsCSD1基因的表达模式也进行分析.结果显示,茶树CsCSD1基因cDNA全长860 bp,完整的开放阅读框(ORF)长度为459 bp,共编码152个氨基酸;gDNA基因结构分析发现CsCSD1基因由6个外显子和5个内含子构成;CpG岛预测发现启动子区域内存在1个CpG岛,CpG长度为219bp,GC含量为50.3%;CsCSD1启动子上还存在大量的顺式作用元件,包括光响应元件、激素响应元件、胁迫响应元件和其他响应元件;在低温胁迫下CsCSD1基因的表达模式显示,在低温胁迫前期,CsCSD1基因表达上调;随后CsCSD1基因的表达量不断下降.本研究表明,CsCSD1基因能够响应低温胁迫并在胁迫的不同时期发挥不同的作用,推测与低温胁迫密切相关.     

香菇生长发育过程中漆酶基因家族的转录表达

香菇可分泌胞外漆酶降解木质素作为自身营养物质.为探究不同漆酶基因在香菇生长发育过程中的不同作用,采用RT-q PCR方法分析10个漆酶基因在香菇4个不同发育阶段(菌丝体、原基、幼小子实体和成熟子实体)的转录表达情况.结果显示,5个漆酶基因(Lelac1、Lelac3、Lelac5、Lelac8和Lelac9)的转录表达表现出差异性和发育阶段特异性,另外5个漆酶基因(Lelac2、Lelac4、Lelac7、Lelac10和Lelac11)只表现出差异性.Lelac2和Lelac3随着香菇的生长,其转录表达量持续上升,可能与成菇过程有关;Lelac1和Lelac7在菌丝体阶段大量表达,可能参与菌丝体的生长代谢;Lelac8在原基时期表达量显著高于其他时期,与原基分化有关.本研究表明漆酶基因在香菇不同发育阶段的转录表达存在差异,结果可为进一步阐明漆酶在香菇生长发育阶段的作用奠定基础.     

野生蕉miR395a前体克隆与进化特性及启动子分析

植物miR395参与硫代谢调控,并在应答逆境胁迫等方面起重要调控作用.为了解香蕉miR395的分子特性和进化规律,在参考香蕉基因组信息的基础上,结合RT-PCR技术,从三明野生蕉(Musa itinerans)叶片中获得81 nt miR395a前体序列,包含21 nt miR395a成熟体序列.进化特性分析表明,植物miR395a前体存在于27个物种中,野生蕉pre-miR395a序列与双子叶耧斗菜(Aquilegia viridiflora Pall.)最为接近,与单子叶的水稻、玉米、高粱最远,表明野生蕉pre-miR395a的起源比较特殊;前体序列长度差异较大(57-226 nt);miR395a成熟体序列分析发现,来自5p臂上的miR395a序列特异性较大.野生蕉miR395a前体能形成典型的发卡结构,miR395a成熟体位于前体的3p臂上.转录起始位点分析表明,野生蕉pri-miR395a转录起始区域位于-87 bp--38 bp,A为转录起始位点.启动子顺式作用元件预测分析表明,野生蕉miR395a启动子包含多个激素、胁迫、生物钟及光响应元件,可能与响应胁迫密切相关.qPCR检测结果也发现miR395a的表达量在低温胁迫下极显著下调,表明响应低温胁迫.综上表明三明野生蕉在响应低温胁迫过程中miR395a起着重要调控作用,这对于进一步研究野生蕉miR395a在低温胁迫中的作用机制具有参考价值.     

盐生杜氏藻烯醇酶基因启动子的克隆分析及胁迫转录应答

为了解盐生杜氏藻(Dunaliella salina)烯醇酶(Enolase)在渗透耐受中的具体功能,利用基因组步行方法和巢式PCR,从D.salina中克隆了烯醇酶基因DsENO 5’上游约2 000 bp的调控序列,并对其进行序列分析.分析表明,它包含多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box,TATA-box),富含光﹑干旱及其它胁迫应答元件.利用实时荧光定量PCR的方法,研究了高渗﹑高温以及低温外界胁迫条件下DsENO的转录情况,发现其受高渗强烈抑制,高温显著诱导而低温微弱诱导.     

茶树RING-finger型E3泛素连接酶基因CsSDIR的克隆与表达

蛋白质泛素化修饰广泛参与植物的生长发育及逆境胁迫响应,其中RING-finger型E3泛素连接酶基因salt and drought induced ring finger1(SDIR1)在植物抗逆中具有重要的作用.为了解茶树SDIR1(CsSDIR1)在抗逆应答中的作用机制,采用RT-PCR技术从茶树中克隆CsSDIR1的全长cDNA序列及启动子序列,对其生物信息学特征进行分析,并采用qRT-PCR技术检测该基因的组织表达特异性及在不同逆境胁迫下的表达模式.结果显示,CsSDIR1基因的开放阅读框(ORF)长831 bp,编码276个氨基酸,蛋白质分子量(Mr)为30.085×103,理论等电点为6.54;氨基酸序列分析表明,CsSDIR1属于疏水性蛋白、定位在胞内膜上,与其他植物中的SDIR1相似性较高,在其N-端和C-端分别含有2个保守的跨膜结构域和C3H2C3 RING finger功能域;CsSDIR1与猕猴桃关系最近. CsSDIR1上游启动子含多个与干旱胁迫和盐胁迫响应相关的元件.表达分析显示,CsSDIR1在茎中的表达量显著高于根、叶和花;ABA、干旱和高盐诱导其表达,低温抑制CsSDIR1的表达.根据上述结果推测CsSDIR1基因可能参与了茶树的抗逆响应.     

藜麦Hsf家族的进化与多胁迫条件下的转录应答

Hsf转录因子参与调控植物在生物和非生物胁迫下的防御应答机制.基于系统的生物信息学分析方法,对藜麦Hsf家族成员进行序列特征、进化和多种生物和非生物逆境胁迫下的基因表达水平分析.在藜麦基因组中共鉴定得到31个Hsf转录因子,主要分布在7号染色体.系统进化树将藜麦31个Hsf成员划分到A1-A9、B1-B5和C组中;但藜麦Hsf成员在A6、A8、B5亚组中出现了缺失.藜麦Hsf成员的HR-A/B区域蛋白序列比对结果进一步支持了进化树中藜麦Hsf成员的聚类结果.藜麦Hsf成员蛋白序列中保守区域的分布呈现出组别特异性.A组Hsf成员的蛋白序列包括HSF domain、HR-A/B、NLS、NES和CTAD在内的保守区域;B组和C组的Hsf成员则缺失了CTAD.在干旱、高温、盐、低磷胁迫和GCFSV病毒侵染下,31个藜麦Hsf基因的表达模式被阐明;其中大量Hsf基因的表达水平被显著地诱导表达,推测其参与了藜麦在生物和非生物胁迫下的防御应答反应.本研究结果可为藜麦抗逆品种的遗传育种提供大量优良候选Hsf基因.(图6表1参28)     

播娘蒿耐寒基因DsKIN1的克隆、序列分析及冷诱导表达分析

播娘蒿是极端耐寒的冷诱导植物,研究其低温胁迫下的冷响应基因对于揭示其抗寒性具有重要意义.根据拟南芥At KIN1和At KIN2同源比对,设计同源引物进行播娘蒿KIN基因克隆,通过RACE技术克隆得到Ds KIN1基因,利用Vector NTI11.5软件对其进行序列分析,采用Realtime-PCR测定Ds CBF1、Ds CBF2、Ds COR和Ds KIN1基因在不同处理方式[整株低温处理、同一植株局部低温处理和局部未受低温处理(两部分植株)]下各时间段(0.2 h、0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h)的表达,采用String数据库预测分析与Ds KIN1相互作用的蛋白.结果显示,Ds KIN1基因序列全长为462 bp,开放阅读框ORF长度为198 bp,编码66个氨基酸,分子量(Mr)为6.61×10~3,理论等电点为9.10,亲水性好.播娘蒿Ds CBF1和Ds CBF2在0.2 h开始表达,在2 h达到最大,随后下降.在冷诱导0.2 h后,Ds CBF调控的耐寒基因Ds COR和Ds KIN1基因开始表达,均呈现上调的趋势.整株、局部冷诱导植株与同一植株上未受低温胁迫部位的耐寒基因Ds COR和Ds KIN1表达模式类似.此外发现与Ds KIN1相互作用的蛋白大部分为低温诱导蛋白、盐和渗透压胁迫响应的信号蛋白、与渗透调节有关的家族蛋白、RING-H2锌指蛋白2B以及未知蛋白等.本研究说明播娘蒿局部冷诱导时,冷信号可进行传递,使未受冷诱导部位获得耐寒性能.     

两个非洲菊4CL基因的克隆及表达

香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是苯丙烷类代谢的一个关键酶,在植物生长发育和抗逆防御反应中发挥着重要作用.为了解非洲菊4CL基因的序列特征和表达特性,使用反转录PCR克隆两个非洲菊4CL基因,利用生物信息学分析软件分析它们的序列特性,同时利用qRT-PCR研究它们在不同组织部位和低温、干旱、盐胁迫和水杨酸(SA)处理下的表达情况.结果显示,两个非洲菊4CL基因(Gj4CL-like7和Gj4CL-like1)CDS长度分别为1 617 bp和1 623 bp,它们编码的蛋白均为疏水蛋白,其中Gj4CL-like7拥有跨膜结构.Gj4CL含有木质素代谢相关4CL特有保守序列SSGTTGLPKGV和GEICIRG.定量结果显示,它们在不同组织部位中的表达情况相同均为根叶柄叶;低温处理下Gj4CL-like7的表达先升高,在处理8 h时达到最大值,之后显著下调并显著低于对照,而Gj4CL-like1的表达呈"升—降—升—降"的趋势,低温处理前12 h的表达量均高于对照且在12 h时最高,之后显著低于对照;盐胁迫下,Gj4CL-like7的表达受到显著抑制,而Gj4CL-like1的表达早期呈下调趋势,处理24h后的表达量显著高于对照;干旱胁迫和SA处理下这两个基因的表达均受到显著抑制,且Gj4CL-like7受抑制程度更高.本研究表明Gj4CL-like1主要参与木质素代谢,在非洲菊逆境胁迫应答中发挥着重要作用;Gj4CL-like7编码蛋白具有4CL保守序列相似序列,可能参与类黄酮代谢.(图6表1参36)     

非生物胁迫对盐生杜氏藻DsMPK转录、翻译和磷酸化修饰的影响

促有丝分裂活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK或MPK)途径是在真核生物中广泛存在的调控多种生理过程的信号途径,在细胞增殖、分化、凋亡、生物和非生物胁迫等生理过程的调控中起着关键的作用.盐生杜氏藻(Dunaliella salina,盐藻)是目前世界上最耐盐的真核光合生物之一.在前期实验中,已发现盐藻MAPK(DsMPK)的表达受到低温和高盐胁迫的抑制.分析DsMPK在高温、低盐、氧化、紫外胁迫中的表达变化,发现DsMPK还受到氧化胁迫的抑制.进而分析DsMPK在高温、低盐、氧化、低温、高盐和紫外胁迫中翻译和磷酸化修饰的变化,发现除低盐胁迫外,在磷酸化修饰水平DsMPK同样受到各种非生物胁迫的抑制.在对不同生长阶段盐藻DsMPK磷酸化变化的分析中还发现,DsMPK的磷酸化水平与生长速率有一致性.各方面DsMPK的变化趋势说明其为一调控生长相关的MAPK.     

不同野生居群石蒜表型变异及物候期差异

石蒜是我国具有重要药用和园林应用价值的野生植物.以不同居群野生石蒜为材料,通过周年观察、切割繁殖、常规调查研究了其种质资源的基础特性.结果表明,不同野生居群石蒜单个鳞茎叶片数量多数为6片,叶长、叶宽、叶面积和叶绿素总量在18.36～21.56cm、0.50～0.70cm、9.22～12.95cm2和57.68～64.73SPAD之间比例最高.环境气候与表型性状相关性分析发现,热量及降雨量变化制约着叶宽、叶面积和叶片数量的变化,叶绿素总量与日照时数略微相关.方差分析发现,叶片数量呈显著水平差异(P0.05),而叶长、叶宽、叶面积和叶绿素总量均表现出极显著水平差异(P0.01).来自亚热带南部的居群物候期明显早于来自中北部的居群,南部居群的繁殖系数、子鳞茎质量也均优于中北部居群,所有居群繁殖系数均值为5.81,子鳞茎质量均值为1.64g.不同居群石蒜的子鳞茎5个生物学性状相比,根系数量差异最大(3.42～7.98根),其次是高度差异(1.27～2.01cm),再次是质量差异(1.33～1.94g),最后是直径差异(1.03～1.23cm).     

Gene expression profiles of the swimming crab <Emphasis Type="Italic">Portunus trituberculatus</Emphasis> exposed to salinity stress

The swimming crab, Portunus trituberculatus, is an important marine fishery and aquaculture species. Although P. trituberculatus is a euryhaline species, water salinity condition influenced its distribution, migration route, and artificial propagations. To investigate gene expression in the P. trituberculatus exposed to different salinity stresses, 2426 expressed sequence tags (ESTs) from gill cDNA library were selected to spot on a cDNA microarray chip. In total, 417 differentially expressed genes were identified and grouped into eight clusters by hierarchical clustering analysis. Approximately 71.5% of grouped genes belonged to three independent expression patterns, indicating that these three expression patterns may represent three important stress tolerance pathways or networks in P. trituberculatus. Moreover, our cDNA microarray data suggested that there were differences in gene expression patterns of P. trituberculatus for low salinity and high salinity acclimation, suggesting that two salinity challenges resulted in a wide variation of gene expression in P. trituberculatus. In addition, a series of genes such as CCAAT/enhancer-binding protein, Na/K ATPase β-subunit, and heat shock proteins (HSPs) genes were suggested to be key elements during salinity acclimation process. Overall, this work represented an important step toward understanding the molecular processes and mechanisms involved in salinity acclimation of the swimming crab.     

Cloning and expression analysis of ScBAK1 gene and its alternative spliceosome in sugarcane北大核心CSCD

Alternative splicing (AS) is an important part of regulation of eukaryotic gene expression. BAK1 (Brassinosteroid insensitive1-associated receptor kinase 1) is a specific type of plant serine/threonine protein kinases, and can regulate growth and development and natural immunization. To reveal the responses of sugarcane BAK1 gene to the adverse environment, a ScBAK1 gene and its alternative spliceosome, termed ScBAK1 (GenBank accession number: KP032226) and ScBAK1 S1 (GenBank accession number: KP032227), were cloned from leaf cDNA of Yacheng 05-179 utilizing the methods of electronic cloning and RT-PCR. The open reading frame (ORF) length of ScBAK1/ScBAK1 S1 gene was 1 860bp/1 770bp, encoding 619/589 amino acids residues. The predicted molecular weight of the protein was 69.28 kDa/ 65.76 kDa. Both proteins were located in plasma membrane, estimated as acid, hydrophikic and secretive proteins. Random coil and alpha helix gave priority to extended strand in their secondary structure without beta turn. The most important protein function was cell envelope, secondly biosynthesis of amino acids and cofactors. Real-time quantitative PCR analysis revealed that the expression of sugarcane ScBAK1 S1 gene exhibited the reduced expression trend under smut fungus stress and various abiotic exogenous stresses, including SA, CuCl2, PEG, ABA, NaCl and JA, while the expression of ScBAK1 gene was induced by SA, CuCl2, PEG, NaCl and smut fungus stresses. The phenomenon showed that the absent sequences or amounts of ScBAK1 S1 gene plays a key role in the response of ScBAK1 to the stress of sugarcane smut fungus, osmotic stress and cell growth. The differential expression of ScBAK1 and ScBAK1 S1 lays a foundation for further research on the function of ScBAK1 gene under biotic and abiotic stress.     

不同光照时间对杏鲍菇生长发育的影响

为探究光照时间对杏鲍菇生长发育的影响,设置蓝、白两种光质,每种光质下设置5种不同光照时间处理进行栽培试验,并测定每个处理下杏鲍菇原基形成与分化速度、菇蕾与子实体形态、产量及可溶性蛋白质与总糖含量.结果显示,原基形成速度随光照时间增加呈现先增加后降低的趋势,蓝光下以15 min光照15 min黑暗时间处理下原基形成速度最快,白光下以10 min光照20 min黑暗时间处理下原基形成速度最快;原基分化速度随光照时间增加而增加,蓝、白光下均以30 min光照1 s黑暗时间处理下原基分化速度最快;菇蕾与子实体菌盖直径随光照时间增加有逐渐增大的趋势;子实体菌柄长度随光照时间增加有逐渐缩短的趋势;子实体产量以1 min光照29 min黑暗与5 min光照25 min时间处理下较高;可溶性蛋白质含量以1 min光照29 min黑暗、5 min光照25 min黑暗时间处理下含量较高;总糖含量在不同光照时间处理间差异较小.本研究表明工厂化杏鲍菇栽培过程中,在原基形成与分化阶段宜选用较长时间光照以加速原基形成与分化从而缩短生产周期;子实体生长阶段采用较少光照时间即1 min光照29 min黑暗有利于增加产量;同时可根据子实体生长状态来适当调控光照时间,以生产出适应于市场需求的产品.(图4表9参25)     

不同强度冷刺激对大鼠心脏、大脑、睾丸和肺脏中CIRP表达的影响

采用Western blot和实时荧光定量RT-PCR方法,研究不同强度不同时间冷刺激后大鼠心脏、大脑、睾丸和肺脏中冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)的表达情况.结果表明:常温(20℃±1℃)下大鼠4种组织中均存在一定的CIRP的表达;急性冷刺激组(-10℃±1℃、-4℃±1℃、0℃±1℃、4℃±1℃)心脏、大脑和睾丸中CIRP mRNA表达在冷刺激0～6 h呈上升趋势,6 h时达到最高值,随后呈下降趋势,肺脏中CIRP mRNA表达在0～6 h呈下降趋势,在6 h时达到最低值,随后呈上升趋势;慢性冷应激组(10℃±1℃)大鼠心脏、大脑和睾丸3种组织中CIRP mRNA在不同时间点(1周、2周、3 W周)的表达均高于正常对照组(P>0.05),肺脏CIRP mRNA表达均低于对照组(P>0.05),并且同一组织不同时间点之间差异不显著(P>0.05).可见冷刺激后CIRP的表达存在一定规律并且表现出组织特异性,可能与组织保护特异性有关.     

铅暴露U251细胞差异表达基因及相关通路(The Interrelated Pathways in Brain Human U251 Glioma Cells by Lead Exposure)

为探讨铅对体外培养的人神经胶质瘤U251细胞(human U251glioma cells,U251)暴露后基因表达的变化以及相关基因通路,选用乙酸铅暴露U251细胞.细胞在乙酸铅中暴露8h和24h后提取RNA,使用cDNA芯片分析基因表达情况,芯片扫描结果经归一化处理,设定Ratio值<0.5或≥2.0为表达有差异基因.结果表明,铅暴露U251细胞导致2840条基因差异表达,使用KEGG和BioCarta数据库分析代表性基因网络.结果发现,铅暴露U251细胞导致大量基因差异表达,涉及多个代谢及信号通路,与神经组织相关的主要信号通路有Ca2+信号通路、Jak-STAT信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路等,还涉及配体-受体、细胞因子相互作用等.这些通路相互联结,构成复杂的网络系统,调控细胞的生物学功能.     

BALB／C鼠睾丸组织中冷诱导RNA结合蛋白的cDNA克隆与序列分析

冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)在多种冷应激细胞(包括重组中国仓鼠卵巢细胞)中被发现.迄今为止,冷应激对活体生物基凶表达的影响还未见报道.和细胞相比,生物体具有更加复杂的冷应激调节机制.本研究以冷处理的BALB/C鼠为实验动物,从其睾丸组织巾克隆出了CIRP的cDNA.结果表明,CIRP在生物体中能够被低温诱导,可能防止生物体遭受冷损伤.根据克隆的cDNA所推测的氨基酸序列与GenBank上公布的小鼠、大鼠、人类、牛蛙、美西螈、非洲爪蟾胚胎细胞和卵母细胞的CIRP氨基酸序列同源性分别为100%、99.40%、95.5%、67.4%、58.4%、76.9%和79.1%.这表明CIRP在生物进化过程中是高度保守的,可能具有多种生理功能.因此,这一研究将为探索人类和动物冷应激分子机制创立系统试验模型和奠定新的实践基础.图5参14     

Copper sulphate (CuSO4) toxicity on tissue phosphatases activity and carbohydrates turnover in Achatina fulica

A time course study on the sublethal toxicity of CuSO4 on tissue carbohydrate metabolites level and their phosphatases activity in Achatina fulica revealed differential response. The levels of total carbohydrates and glycogen in the body mass muscle, foot muscle and hemolymph revealed their involvement in the endogenous derivation of energy during stress. The same metabolites in digestive gland revealed its importance to reproduction and development. The lactate accumulated in all the tissues implied the mechanism of CuSO4 toxicosis in the metabolic acidosis. The decrease of pyruvate in foot muscle, body mass muscle and hemolymph inferred the preponderance of glycolysis in energy derivation. In contrast, the pyruvate concentration in digestive gland revealed its differential response in the stress metabolic sequence of changes, as a unique tissue. The lactate/pyruvate ratio and the calcium content in tissues constitute direct evidences for the snails adaptation to toxic stress.     

Linkages between phenology, pollination, photosynthesis, and reproduction in deciduous forest understory plants

Light availability in the understory of deciduous forests changes drastically within the growing season due to the foliage dynamics of canopy trees. Because flowering phenology, photosynthetic characteristics, and fruiting success respond to such strong seasonality in light availability, we hypothesized that understory plants in such ecosystems should describe distinct phenological groups or syndromes where "syndrome" is defined only as a set of characteristics that co-occur. To identify these phenological syndromes, we studied the flowering phenology, fruit or seed set, and photosynthetic characteristics for 18 perennial understory herbaceous species that differed in reproductive strategy over eight years in a deciduous forest in northern Japan. Three phenological groups emerged from this study: (1) spring bloomers, flowering and fruiting before the completion of canopy closure; (2) early-summer bloomers, flowering during the progress of canopy closure and fruiting after canopy closure; and (3) late-summer bloomers, flowering and fruiting after canopy closure. The spring bloomers had high photosynthetic rates and high fruiting abilities, but the flowering time varied considerably among years due to yearly fluctuations of snowmelt date. Bumble bee-pollinated species of spring bloomers showed variable seed-set success, while fly-pollinated species showed relatively stable seed sets over the years. The early-summer bloomers showed low fruiting abilities irrespective of pollination success, reflecting severe resource limitation with decelerating light availability during fruit development. Although the late-summer bloomers showed low photosynthetic rates under low-light conditions, high fruit-set success was attained if pollination was sufficient. These results support our hypothesis that phenological syndromes may be found in deciduous forest understory plants. Given that reproductive success of bee-pollinated spring bloomers is highly susceptible to seasonal fluctuation, climate change may have its strongest impacts on this group.     

褐牙鲆白化相关基因zfp123的组织表达谱与蛋白结构分析

C2H2锌指是真核细胞中最常见的DNA结合模体.对通过mRNA差异显示技术和克隆测序.在褐牙鲆中获得的一条白化相关锌指蛋白基因zfp123,进行了电子表达谱与实验验证表达谱的比较分析及该蛋白序列的一、二级和三级结构分析.电子表达谱分析分别对与ZFP123有较高同源性的斑马鱼、家鼠和猪的zfnd5a(zfp123)摹因各个组织表达情况进行了比较分析;一、二级结构分析发现其具有多个保守的基序和结构域;同源建模显示其具有一个"C-X(2-4)-CX11-C-X2-C"结构的锌指样三级结构.ZFP可以介导靶基因的转录调控,抑制或激活特定基因的表达;对DNA进行修饰,如人造限制性内切酶、重组酶、抗病毒感染等.锌指蛋白应用前景广阔.研究价值显著,是未来基因治疗的革命性的工具.