17α-甲基睾酮对稀有鮈鲫幼鱼性腺发育与血清卵黄蛋白原水平的影响

17α-甲基睾酮是一种人工合成雄激素,在水产养殖以及医药行业中广泛使用,其对鱼类的内分泌干扰效应研究工作相对较少.通过甲基睾酮对稀有鲫幼鱼的42天流水暴露,观察了其性腺发育和生物标记物变化.在500ng·L-1甲基睾酮暴露组中幼鱼生长受到抑制(p≤0.05),在50ng·L-1以上暴露组中性腺指数显著增加(p≤0.05),雄性个体比率明显升高.通过组织学观察发现,50ng·L-1以上浓度甲基睾酮暴露后卵巢组织切片中出现了精子细胞,且精子细胞数量随剂量的增加而增加.通过生物标记物卵黄蛋白原测定发现,在50ng·L-1以上浓度甲基睾酮暴露后,稀有鲫幼鱼血清中的卵黄蛋白原水平显著增加(p≤0.05).综合分析,17α-甲基睾酮主要表现出雄激素效应,而其在稀有鲫体内的代谢物则能够应激卵黄蛋白原,对稀有鲫幼鱼的最低可观察效应浓度(LOEC)为50ng·L-1.因此,仅依靠体内卵黄蛋白原应激单项指标不能准确判定化学品是否是环境类雌激素.     

稀有鮈鲫神经发育相关基因的克隆、同源性分析及组织分布

作为重要的本土模式鱼类,稀有鮈鲫神经发育相关的生物学背景几乎空白,导致其在神经毒性评价方面的应用受到限制。本文从稀有鮈鲫脑部克隆得到了神经发育相关的神经生长因子(nerve growth factor;ngf)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor;bdnf)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein;gfap)、髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein;mag)、P0蛋白(myelin protein zero;mpz)、微管蛋白α1(α1-tubulin)和Y染色体性别决定基因10(SRY-box containing gene 10;sox10)等基因的片段,并对其进化树及表达谱进行了分析。序列分析表明,bdnf的核苷酸序列与鲫鱼、鲤鱼的同源性最高,均为98%;gfap、ngf、mag和α1-tubulin与斑马鱼的同源性最高,分别为95%、92%、92%和96%;mpz与黑头软口鲦的同源性最高,为94%;sox10与鳙鱼同源性最高,达97%。表达谱分析结果表明,ngf、bdnf、mag、mpz、α1-tubulin和sox10基因均在脑组织中表达量最高,gfap在脊髓中表达量最高,上述结果为这一模式鱼类在神经发育学和神经毒性效应评价方面的应用奠定了基础。     

稀有鮈鲫细胞凋亡相关基因的克隆及序列分析

细胞凋亡是调控机体发育和维护内环境稳定的重要机制。在克隆了稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)肝脏组织中凋亡相关的bcl-2、apaf-1、caspase-3和caspase-9基因的部分cDNA片段之后,进行了序列分析。结果表明,caspase-3和caspase-9基因片段与唐鱼(Tanichthys albonubes)相对应的核苷酸序列同源性最高,而bcl-2、apaf-1基因片段则分别与鮈鱼(Gobio gobio)和鲤鱼(Cyprinus carpio)相对应的核苷酸序列同源性最高,为99%和89%。基于稀有鮈鲫和已知物种的caspase-3基因核苷酸序列构建了系统发育树,发现稀有鮈鲫与唐鱼、斑马鱼(Danio rerio)的亲缘关系最近,而与金头鲷(Sparus aurata)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的亲缘关系较远。本研究为深入理解外源性化学物质对鱼类的毒理学机制及其生态健康风险评价提供科学数据,同时也为稀有鮈鲫在鲤科鱼类的分类及进化地位的研究提供分子水平的重要参考。     

稀有鮈鲫Ras信号通路相关基因的克隆、序列分析及其组织分布

Ras基因是一类在生物进化过程中较为保守的原癌基因,在多种细胞生命活动中起到细胞增殖、分化和细胞骨架构建等重要作用。本文克隆了稀有鮈鲫Ras信号通路相关的k-ras、n-ras、pik3cd、pin1和raf1基因的部分c DNA片段,并分析了其序列。序列分析结果表明,k-ras的氨基酸序列与鲤鱼相对应的氨基酸序列同源性最高,为99%;n-ras、pik3cd、pin1和raf1的氨基酸序列均与斑马鱼相对应的氨基酸序列同源性最高,分别为99%、87%、96%和97%,结果表明稀有鮈鲫与鲤鱼、斑马鱼的亲缘关系较近。组织表达分析表明,k-ras、n-ras、pik3cd、pin1和raf1基因在肝脏、鳃、肾脏、脑和性腺等组织中具有表达差异性。本文为研究环境污染物对鱼类致癌作用机制和安全性评估提供分子生物学基础和科学依据。     

稀有鮈鲫成体神经发生相关基因的分子克隆及序列分析

成体神经发生是脊椎动物中广泛存在的一种生物学特征。成体硬骨鱼类的脑展现出强烈的神经活性以及出色的脑修复能力,这使得硬骨鱼类成为研究成体神经发生和脑修复的一个理想的模型。本文克隆了成体稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)脑组织中神经发生及脑修复相关的hes5、pax6、sox11和prox1基因的部分cDNA序列并进行了序列分析。序列分析结果表明,pax6和sox11基因片段与斑马鱼(Danio rerio)对应的基因片段的同源性最高,分别为97%和94%; hes5基因与鲤鱼(Cyprinus carpio)相对应的基因片段的同源性最高,为92%;prox1基因在物种间的同源性最低。基于稀有鮈鲫和已知物种相应基因的核苷酸序列构建了系统发育树,发现稀有鮈鲫prox1基因与其他硬骨鱼类的亲缘关系最远。本文为进一步开展神经毒性类化学品对水生生物鱼类的成体神经毒性作用机制研究提供了分子生物学基础。     

四氯丙烯对稀有鮈鲫的急性毒性及安全浓度评价

采用半静态试验方式测试了四氯丙烯对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)的急性毒性,试验浓度分别设定为0.25 mg·L~(-1)、0.30mg·L~(-1)、0.36 mg·L~(-1)、0.42 mg·L~(-1)、0.50 mg·L~(-1)和0.60 mg·L~(-1),同时进行空白对照(试验用水)和分散剂对照(体积分数为0.006%的吐温-80水溶液)试验。采用气相色谱法对试验溶液进行浓度分析,实测浓度分别为0.19 mg·L~(-1)、0.25 mg·L~(-1)、0.34 mg·L~(-1)、0.40 mg·L~(-1)、0.51 mg·L~(-1)和0.64 mg·L~(-1),试验结果以实测浓度表示和统计。结果表明:四氯丙烯致稀有鮈鲫无死亡发生(EC0)的最高浓度为0.25 mg·L~(-1),导致稀有鮈鲫100%死亡(EC100)的最低浓度为0.51 mg·L~(-1)。根据实测浓度,用SPSS(17.0)概率单位法求得四氯丙烯对稀有鮈鲫的半数致死浓度96 h-LC50为0.347 mg·L~(-1),95%置信区间为0.328 mg·L~(-1)~0.361 mg·L~(-1)。     

稀有鮈鲫Dmrt基因家族13个成员的克隆与序列分析

已经发现果蝇Doublesex、线虫Mab-3、青DMRT1Y/DMY和人类DMRT1等性别决定与分化基因均含有一个具有DNA结合能力的保守基序--DM结构域,对性别决定和性别分化具有调控功能.利用简并PCR,从稀有鲫基因组DNA中克隆了13个具有不同DM结构域的Dmrt基因家族成员.基于DM保守基序,建立了各物种的进化树.结果表明,稀有鲫基因组存在多个Dmrt基因成员,该基因在脊椎动物和非脊椎动物中具有高度保守性,是一种理想的环境内分泌干扰物研究的分子模型,在分子生态毒理学研究中具有很好的应用前景.     

稀有鮈鲫作为水生模式生物的研究及探讨

我国本土水生生物稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus Ye et Fu,1983年)是一种优良的试验用鱼,具备成为模式生物必要条件。本文总结了稀有鮈鲫生物生态学研究情况,分析了稀有鮈鲫在多个应用领域与模式生物斑马鱼、青鳉存在的不足和差距,同时借鉴发达国家推动模式生物的实践经验,提出了针对性建议。     

稀有鮈鲫作为水生模式生物的研究及探讨

我国本土水生生物稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus Ye et Fu, 1983年)是一种优良的试验用鱼,具备成为模式生物必要条件。本文总结了稀有鮈鲫生物生态学研究情况,分析了稀有鮈鲫在多个应用领域与模式生物斑马鱼、青鳉存在的不足和差距,同时借鉴发达国家推动模式生物的实践经验,提出了针对性建议。     

氰戊菊酯对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生命阶段的毒性效应

为探明氰戊菊酯对鱼类不同生命阶段的毒性效应,以斑马鱼和稀有鮈鲫为测试生物,评价了氰戊菊酯对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生命阶段的急性毒性差异。研究发现,氰戊菊酯对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎的96 h-LC50值分别为0.901(0.664~1.22)和0.636(0.233~1.74)mg·L~(-1)。氰戊菊酯对稀有鮈鲫胚胎孵化有明显的促进作用,染毒48 h后,0.188和0.375 mg·L~(-1)氰戊菊酯对稀有鮈鲫胚胎的孵化率分别为88.9%和100%。氰戊菊酯对斑马鱼仔鱼、幼鱼和成鱼的96 h-LC50值分别为0.00340、0.0183、0.00487 mg·L~(-1),氰戊菊酯对稀有鮈鲫仔鱼、幼鱼和成鱼的96 h-LC50值分别为0.0520、0.00277、0.00345 mg·L~(-1)。因此,氰戊菊酯对斑马鱼不同生命阶段的毒性从高到低顺序依次为:仔鱼成鱼幼鱼胚胎,氰戊菊酯对稀有鮈鲫胚胎、仔鱼、幼鱼和成鱼的毒性为幼鱼成鱼仔鱼胚胎。试验结果表明,斑马鱼仔鱼对氰戊菊酯的敏感性高于稀有鮈鲫相应的生命阶段,相对于斑马鱼,稀有鮈鲫胚胎、幼鱼以及成鱼对氰戊菊酯的毒性作用更为敏感,说明氰戊菊酯对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生命阶段的毒性效应差异较大。     

城市污水处理厂进出水中类雌激素暴露影响评价

以稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)为模型动物,利用卵黄蛋白原(VTG)和生长发育指标作为类雌激素污染的生物标志物,评价了沙湖污水处理厂进出水中类雌激素暴露对稀有鮈鲫仔鱼的影响.结果表明:暴露21d后,未稀释进水和一级处理出水对稀有鮈鲫仔鱼VTG有显著诱导,各级处理水对稀有鮈鲫的生长发育也造成了一定的影响,在进水和一级处理出水暴露组中有死亡现象发生.以17β-雌二醇(E2)为阳性对照,对稀有鮈鲫VTG的诱导作标准曲线,计算进水以及各级出水的类雌激素E2的活性当量,发现污水处理厂一级和二级处理工艺对污水的类雌激素活性的去除率分别为47%和95%以上.表明在现有污水处理工艺中,二级处理工艺可去除大部分的类雌激素,而一级处理工艺却不能有效去除类雌激素.     

三氯酚暴露致稀有鮈鲫肝脏损伤的比较蛋白质组研究

为探讨2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)暴露致鱼类肝脏损伤的毒性效应,以稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)为模式生物,TCP暴露浓度为1、10、100μg·L-1,进行流水暴露实验(28d),利用二维凝胶电泳方法(2-DE),结合质谱分析技术(MALDI-TOF-MS),对TCP致稀有鮈鲫肝脏损伤的蛋白表达谱进行了研究.结果显示,共发现35个差异蛋白点,其中11个蛋白被成功鉴定(C.I.>95%).对鉴定的蛋白根据GOTerms进行功能分类,发现它们主要参与脂类代谢与转运、氧化应激以及蛋白修复和氧化磷酸化等生物学过程。以上结果表明,TCP对稀有鮈鲫具有明显的肝脏毒性效应.     

稀有鮈鲫体内多种神经化学物质的同时测定

本文建立了一种可以同时检测稀有鮈鲫体内24种神经化学物质的分析方法。该方法采用QuEChERS技术对样品进行提取和净化,待测物采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）分析,利用同位素内标法进行定量。该方法仪器检测限（IDL）范围为0.01—0.06 ng·mL⁻¹,方法定量限（MQL）范围为0.28—1.97 ng·g⁻¹。在两种浓度添加水平下,基质效应处于60.6%—129.0%之间,相对回收率处于66.8%—116.7%之间,仪器日内偏差≤ 8.3%,仪器日间偏差≤10.9%,方法相对标准偏差≤ 10.8%。结果表明,该方法准确可靠,满足鱼体中神经化学物质定量分析要求。     

稀有鮈鲫集群行为在生物早期预警系统中的应用研究

以鱼类为指示生物的生物早期预警是一种高效快捷的水体污染物生态损害预警技术,然而,将鱼类的集群行为应用于生物早期预警的研究目前还较为缺乏。以稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)为实验对象,使用“集群分数”量化参数对其健康状态下的集群行为进行了观测和量化。根据24 h急性毒性暴露实验结果,通过梯度暴露实验和突发污染模拟实验2种方式测试了暴露于镉离子(Cd²⁺)、对氯苯胺和间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS222)3种化学品下的稀有鮈鲫集群行为变化情况。结果表明,稀有鮈鲫具有明显的集群行为,其集群分数处于3～5之间,且对化学品的暴露具有明显的变化响应。3种化学品1 h暴露下对稀有鮈鲫集群行为的最低有影响浓度(LOEC)分别为3 mg·L^-1(Cd²⁺)、10 mg·L^-1(对氯苯胺)和11 mg·L^-1(MS222),且稀有鮈鲫的集群分数对化学品暴露的反应较为灵敏且迅速,在3种化学品加入后的10 min内即表现出明显的响应。因此集群分数是一种可用于量化鱼类集群行为的良好参数,且稀有鮈鲫的集群行为是一种可用于生物早期预警的优良行为指标,可用于Cd²⁺、MS222和对氯苯胺等化学品突发水体污染的早期生物预警。     

磷酸三(2,3-二氯丙基)酯阻燃剂对稀有鮈鲫的毒性效应

为研究新型阻燃剂磷酸三(2,3-二氯丙基)酯(TDCPP)的毒性效应,以稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)为实验生物,采用半静态实验方法,分别进行96 h和28 d的染毒,研究TDCPP对稀有鮈鲫的急性毒性和慢性毒性效应,并通过对稀有鮈鲫脑组织中与神经纤维的生长、发育、轴突再生等相关基因mRNA表达量的检测,初步探讨了TDCPP的神经毒性作用。结果表明：TDCPP对稀有鮈鲫的96 h-LC₅₀为2.99(2.20～3.38) mg·L^-1,根据化学物质对鱼类毒性分级标准TDCPP属于剧毒性。经0.9、1.5、2.1和2.7 mg·L^-1 TDCPP染毒28 d,与对照组相比,暴露组稀有鮈鲫肝脏及脑组织中SOD和GSH-Px的活性均受到抑制,且随着TDCPP的暴露浓度增加,其抑制作用显著增强;暴露组稀有鮈鲫脑组织中与神经纤维的生长、发育相关的微管蛋白α/β、神经丝NF-M以及关键蛋白GAP-43等基因的mRNA表达量,与对照相比均发生显著下调。可知,TDCPP暴露可以诱发稀有鮈鲫神经毒性作用。     

噻虫嗪对稀有鮈鲫早期生命阶段毒性效应

我国是新烟碱类杀虫剂生产、销售和使用大国,噻虫嗪等新烟碱类农药在水环境中检出率较高。本文以本土物种稀有鮈鲫为研究对象,开展胚胎及幼鱼噻虫嗪(0、0.5、5和50 μg·L^-1)半静态暴露实验,评估药物对稀有鮈鲫早期生命阶段毒性效应。结果表明,50 μg·L^-1噻虫嗪暴露可导致稀有鮈鲫胚胎死亡率显著增加,药物处理组孵化后仔鱼畸形率均显著增加,仔鱼畸形多呈现为脊柱弯曲。28 d幼鱼亚慢性暴露实验结果表明,不同梯度噻虫嗪暴露均可导致幼鱼死亡率增加;功能基因定量结果显示稀有鮈鲫幼鱼胆固醇合成相关基因sc5d、ebp和sc4mol在转录水平表达下调,nsdhl、caspase3和ctsl1a与对照组相比无显著性差异。5 μg·L^-1噻虫嗪处理组中幼鱼p53、p21和mycb等基因转录水平表达显著下调。上述结果表明,新烟碱类杀虫剂噻虫嗪对稀有鮈鲫早期生命阶段存在胚胎毒性,并导致仔鱼致畸和死亡;功能基因转录水平变化预示药物暴露可能增加幼鱼致癌风险,这些可能对鱼类种群繁衍产生负面效应。     

氯代多氟醚基磺酸对稀有鮈鲫肝脏组织损伤及其毒理学机制研究

6:2氯代多氟醚基磺酸(F-53B)作为全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)的替代品,已在金属电镀行业使用了40多年,这种普遍使用导致其在环境、野生动物和人体中广泛检出,且有研究表明F-53B具有肝细胞毒性作用,但其脂毒性机制尚不明确。将5月龄稀有鮈鲫暴露于0、10和200 μg·L^-1 28 d,以蛋白质组学作为研究手段,探究F-53B对稀有鮈鲫肝脏的脂毒性效应机制。在28 d暴露后,200 μg·L^-1处理组观察到明显的血脂异常,肝脏蛋白组分析表明与脂质代谢相关的途径受到显著影响,与对照组相比,其中10 μg·L^-1组与脂质代谢相关的上调蛋白有19个,下调的有4个,200 μg·L^-1组上调蛋白有15个,下调蛋白9个,共同上调蛋白12个,下调蛋白2个,涉及脂肪酸降解、脂肪酸氧化、转运途径中酶的上调。同时PPAR信号通路参与了F-53B诱导的脂质代谢紊乱,表现为对PPAR的3种亚型的蛋白表达均产生激活作用,导致成骨/成脂分化失衡。这表明F-53B可破坏PPAR信号通路,破坏稀有鮈鲫的脂质稳态,结果可为F-53B脂毒作用机制研究提供新的思路。