溶藻细菌Microbacterium oleivoran 溶藻进程与叶绿素降解动力学

从太湖土著花鲴鱼肝、肠等内脏中筛选出7株具有溶藻功效的菌株,其中溶藻率最高的1株菌命名为GHJ,经DNA测序并构建系统发育树,确定该菌属于微杆菌属(Microbacterium oleivoran),以太湖流域常见藻类———铜绿微囊藻为溶藻对象,以叶绿素a(Chla)含量变化表征溶藻特性,初步揭示溶藻进程中的GHJ菌生长动力学和铜绿微囊藻降解动力学机制,探讨了二者相关关系.结果表明,GHJ的溶藻进程是通过直接溶藻与间接溶藻协同作用,破碎并溶解藻细胞,其在牛肉膏蛋白胨培养基中生长曲线符合Logistic生长模型,动力学方程为■,R~2=0.9797.菌藻比为1:12时的溶藻率最高达到99.60%,此条件下叶绿素与溶藻时间之间的关系符合一级动力学模型[Chla]=111.96×e~(-0.21t),R~2=0.8997;所取菌藻体积比在1∶8—1∶50范围内的叶绿素减少量与溶藻过程时间关系均符合一级动力模型,R~2介于0.6897—0.8997之间,GHJ菌在整个溶藻过程中溶藻趋势相同.本研究可为溶藻菌菌种来源和溶藻过程其他工程应用提供基础理论支撑.     

一株溶藻细菌对铜绿微囊藻的溶藻机理初探

为确定溶藻细菌S7（Chryseobaterium）对铜绿微囊藻的溶藻方式,分别采用高温灭菌（121~123℃）、离心（10 000 r.min-1）、0.22μm滤膜过滤等方式对S7菌液进行处理,检测其对铜绿微囊藻的去除效果。并通过对溶藻过程中叶绿素a和丙二醛（MDA）含量的测定,藻细胞显微结构的观察和细胞成分的红外光谱分析,初步探讨菌株S7对铜绿微囊藻的作用机理。结果表明,S7是通过释放胞外活性物质间接溶藻,该物质具有很强的热稳定性,不属于蛋白质类物质。该活性物质对铜绿微囊藻的叶绿素a有明显的去除效果,并可导致藻细胞膜脂过氧化产物MDA积累量的显著提高和藻细胞解体。藻细胞红外光谱分析表明,经过溶藻物质作用的藻细胞,其蛋白质结构遭到破坏。通过试验结果,推测出菌株S7的溶藻机理：溶藻物质先损伤铜绿微囊藻的细胞壁和粘质胶被,然后通过改变膜的选择透过性进入藻细胞内部,分解叶绿素a,破坏蛋白质,造成藻体正常生理功能的丧失,最终导致藻细胞破裂。     

一株溶藻细菌的分离鉴定及溶藻效果

从太湖分离到一株溶藻细菌CA,该菌对铜绿微囊藻具有强烈的溶藻效果.通过形态学、生理生化特征及16SrDNA序列比对,鉴定该菌株属于水单胞菌属(Aquimonas sp.).将CA菌悬液与铜绿微囊藻共培养,10 d内铜绿微囊藻细胞降解率为100%,叶绿素a降解率为83.9%,且溶藻效果与菌悬液浓度呈正相关,与藻浓度呈负相关.CA菌体本身没有溶藻效果,但其无菌滤液可以溶藻,因此CA是通过释放物质来间接溶藻.在CA菌体的菌藻共培养液中添加少量的牛肉膏、葡萄糖或尿素,菌体显示出溶藻效果.本研究为菌株CA控制铜绿微囊藻水华提供了一种潜在的应用前景.     

一株放线菌对铜绿微囊藻的溶藻活性

从庐山土样中分离得到一株放线菌JXJ 0071,研究了该菌的孢子、菌丝体和代谢产物对铜绿微囊藻(Micro-cystis aeruginosa)的溶藻活性以及溶藻活性成分的稳定性,并对其分类地位进行鉴定。结果表明,放线菌JXJ 0071的孢子和菌丝体均能使铜绿微囊藻细胞密度显著降低。该菌代谢产物对铜绿微囊藻具有很强的溶藻活性,在藻密度为1.0×107 mL-1的藻液中加入体积分数φ为2%的该菌发酵上清液3,d后溶藻效率达98%。溶藻活性成分主要来自水溶性胞外产物,其对高温、pH和紫外线处理均具有较好的稳定性。以60℃以下的温度处理发酵液2h,溶藻活性成分的溶藻效率基本不变,保持在95%以上;pH 7.0～9.0条件下,其溶藻效率仍很高,在93.8%以上;经波长为254 nm的紫外线照射2 h,其溶藻效率仍达85.7%。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,该菌株属链霉菌属,与Streptomyces rectiviolaceus的序列相似性达99%,但JXJ0071与S.rectiviolaceus的部分生理生化特性有所不同,需要进一步的实验数据确定其种一级分类学单元。     

溶藻菌发酵液及其溶藻产物的生物急性毒性试验

应用发光细菌（Photobacteriumphosphoreum）急性毒性试验,研究了溶藻菌（Streptomycessp．HJC-D1）发酵液及其对铜绿微囊藻（Microcystisaemgmosa）抑制产物的生物急性毒性。结果表明,溶藻菌发酵液本身对发光细菌具有一定的低毒性,发酵3-5d时其相对发光度为（67．59％1：3．11％）-（72．35％±2．76％）;体积分数5％的溶藻菌发酵液可有效抑制初始质量浓度高达（O．1483±0．0032）mg-L-1的铜绿微囊藻生长,其抑藻率达85％以上,且藻液毒性明显低于对照组;以微囊藻毒素为主要溶藻产物进行毒性试验发现,其半抑制质量浓度为1096．92μg·L-1,水体藻毒素质量浓度低于20μg·L-1时其生物毒性较低。     

不同氮磷比对铜绿微囊藻及附生假单胞菌磷代谢的影响

以铜绿微囊藻及其附生假单胞菌X菌株为研究对象,研究了不同氮磷比对铜绿微囊藻和假单胞菌之间磷代谢的影响.结果发现,无论有无附生菌存在,铜绿微囊藻在氮磷比为16：1时,生长情况最好,此时微囊藻能迅速有效地吸收水中的磷,而且附生菌的存在能促进藻的生长.而在氮磷比为4：1时,藻的生长情况最差,在实验后期,藻细胞死亡分解后把一些含磷化合物释放到了水中,附生菌的存在能够加速藻细胞的衰亡和藻体内磷的释放.     

荇菜(Nymphoides peltatum)对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)生长的抑制效应及其机制

构建了荇菜(Nymphoides peltatum)与以铜绿微囊藻为优势种的自然藻体共培养系统,分析系统中各藻种藻细胞密度、藻体叶绿素a含量、荇菜生长指标及水下[光]照度的变化;同时以荇菜种植水配置培养基,在适宜光照条件下培养铜绿微囊藻,分析藻类生长生理指标随时间的变化.结果表明:共培养系统中藻类总藻细胞密度显著下降(P<0.05),其中铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)藻细胞密度下降最为明显,40 d时比初始藻细胞密度减少了94.68%,而三角四角藻(Tetraedron minimum)数量逐渐增多,成为优势藻种,表明荇菜对铜绿微囊藻生长具有明显抑制作用.共培养系统中荇菜鲜重、水下20 cm深处光衰减率均与藻类叶绿素a含量呈显著负相关(P<0.05),表明藻细胞光合能力的大小与荇菜植株的生长及其产生的遮光作用密切相关.随培养时间延长,添加荇菜种植水的培养基中铜绿微囊藻藻细胞光密度值(D650)下降明显;叶绿素a、藻胆蛋白(包括藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白)相对含量均有不同程度的下降,培养9 d后4者相对含量分别降至5.27%、15.53%、21.11%和48.48%;藻细胞Ca2+Mg2+-ATP酶活性下降明显,表明荇菜种植水中存在着某种对铜绿微囊藻产生抑制作用的活性物质,通过对铜绿微囊藻光反应系统(PS Ⅰ和PS Ⅱ)的作用来阻碍藻细胞光合作用进程,抑制藻类生长,说明除了遮光效应外,分泌抑藻活性物质也是荇菜抑制铜绿微囊藻生长的重要机制.     

溶藻细菌DC-L14的分离、鉴定与溶藻特性

从滇池蓝藻水华集聚区分离获得一株溶藻细菌DC-L14,经16S rDNA序列分析鉴定为Lysinibacillus fusiformis;小白鼠毒性试验初步显示该菌株未产生小白鼠中毒毒素;该菌能使铜锈微囊藻905聚集成团,沉于瓶底,最终黄化;该菌作用4 d,使惠氏微囊藻107、绿色微囊藻102、水华束丝藻和水华鱼腥藻的叶绿素a下降率最高为70.1%.最低为65.5%,平均为67.2%;当细菌处于稳定生长期时溶藻效果最强,共培养4 d能使铜锈微囊藻905的叶绿素a含量下降82.1%;离心沉降后检测,发现菌体本身无溶藻效果,而无菌上清液与原菌液溶藻效果相同,高温处理后的菌液溶藻能力增强,推测该细菌是通过分泌溶藻物质溶藻,该物质可能为非蛋白质类,高温可能有利于溶藻物质的释放.图4表1参25     

赖氨酸对铜绿微囊藻细胞的抑制机理

在光照条件下赖氨酸可以有效地抑制铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的生长,为了探讨其抑制机理,研究了不同含量赖氨酸对铜绿微囊藻细胞的毒理效应.结果表明:赖氨酸对不同品系铜绿微囊藻生长的抑制效果为无毒藻株＞低毒藻株＞高毒藻株,抑制率为95.52%～49.69%.在抑制前期.赖氨酸对铜绿微囊藻细胞抗氧化系统(SOD、MDA)和细胞膜完整性都没有显著影响,但对细胞色素(叶绿素a和藻胆蛋白)以及细胞酯酶活性具有显著影响;在抑制后期,铜绿微囊藻细胞破碎死亡,各种指标都发生显著性变化.铜绿微囊藻对赖氨酸的响应并不产生细胞脂质过氧化等一般的毒理效应,它可能是一种有序变化的死亡过程.     

纳米银和银离子对2种微藻的急性毒性效应

为了探讨AgNPs对典型微藻的急性毒性效应及其机制,采用柠檬酸钠还原法制备AgNPs,以摇瓶实验法评估了不同浓度的AgNPs和Ag+对铜绿微囊藻和普通小球藻叶绿素a含量、形态结构和叶绿素荧光参数的影响。实验结果表明:AgNPs对普通小球藻和铜绿微囊藻的96 h-EC50分别为1.113 mg·L-1和0.697 mg·L-1,而Ag+对2种藻的96 h-EC50分别为0.106 mg·L-1和0.032 mg·L-1。扫描电镜结果表明:AgNPs处理使普通小球藻细胞表面出现褶皱,细胞变形甚至向内塌陷。对铜绿微囊藻部分细胞出现变形变得不规则,且出现某些胞外物质使细胞粘附在一起。透射电镜观察发现,高浓度Ag+处理使2种藻的细胞均发生质壁分离,部分细胞转变为孢子。而AgNPs处理使普通小球藻细胞蛋白核增大,蛋白核与类囊体区无明显连接通道。铜绿微囊藻拟核区膨大,类囊体和色素体被推向四周,部分类囊体断裂,同时,发现该藻可以分泌胞外物质在细胞周围吸附AgNPs颗粒。对于普通小球藻,0.6 mg·L-1AgNPs处理后细胞光系统Ⅱ的最大光化学量子产率ΦP0相对于CK没有显著差异,但0.09 mg·L-1Ag+处理使ΦP0显著增加。在高浓度AgNPs或Ag+处理时,ΦP0均显著降低。AgNPs未对普通小球藻光系统II性能参数PI_Abs造成影响,但不同浓度Ag+处理均使得该参数显著升高。对于铜绿微囊藻,2种毒物均使其ΦP0显著降低。而PI_Abs仅在2种毒物的最高浓度处理时显著降低。综上,AgNPs对2种藻的急性毒性远小于Ag+,而两者对铜绿微囊藻的毒性均大于普通小球藻。AgNPs胁迫使2种藻叶绿素a含量显著降低,并诱导2种藻在形态结构和光合生理方面发生了显著变化,造成不同程度的损伤,但与Ag+的毒性效应存在一定的差异。提高光吸收能通量补偿耗散能量和分泌胞外物质结合Ag+是微藻2种重要的解毒机制。     

阿特拉津对铜绿微囊藻和四尾栅藻生长的影响

在实验室内利用MA培养液培养,通过测定藻生长量和叶绿素a含量,研究不同浓度下的阿特拉津对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)和四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)生长的影响,并以藻细胞数表示的最大比生长率为指标,评价2种藻对阿特拉津的敏感性.结果表明,在0.001～5.000 mg·L-1质量浓度范围内,阿特拉津对铜绿微囊藻和四尾栅藻的生长表现出低浓度刺激、高浓度抑制的效应,且阿特拉津对四尾栅藻的刺激效应明显大于铜绿微囊藻.     

铁限制对铜绿微囊藻光系统活性变化的影响

通过研究铁限制时铜绿微囊藻光系统活性的变化,了解铁限制控制铜绿微囊藻水华过程的机制.结果表明,铁限制使光合效率Fv/Fm明显降低,光系统Ⅱ接受的能量总体上呈减少趋势.超低温荧光发射光谱显示,铁缺乏限制了藻细胞光系统Ⅰ的活性,而相对促进了光系统Ⅱ荧光叶绿素复合物的产生,说明铁限制使铜绿微囊藻细胞的光能分配更趋向于光系统Ⅱ,其中的CP47蛋白荧光几乎完全消失,CP43蛋白荧光则相对增加.     

干粉菌剂保护剂对溶藻菌溶藻效果与稳定性能的影响

针对液体菌剂在使用过程中易受杂菌污染以及运输过程中存储不便等问题,选取蔗糖、甘油、谷氨酸钠、脱脂乳粉等4种常见材料做干粉菌剂保护剂,真空冷冻干燥条件下,以小麦粉作为载体,分析不同浓度保护剂作用下的活菌数量及冷冻干燥前后的活菌率变化,作为探究4种保护剂在干粉菌剂制备过程中保护作用与机理的依据.实验结果表明,浓度为10%蔗糖溶液、10%甘油溶液、4%脱脂乳粉溶液以及8%谷氨酸钠溶液做保护剂时活菌率最高、活菌数最大,蔗糖浓度为10%,冷冻干燥前液体菌剂中溶藻菌的数量约为9.65×10~9 CFU·mL~(-1),冷冻干燥后干粉菌剂中溶藻菌数量约为15.20×10~9 CFU·mL~(-1),溶藻菌成活率为157.51%,高于其他3种保护剂.整个溶藻过程大致持续8 d,在第8 d时,蔗糖作保护剂的菌剂溶藻率达96.04%,以甘油作保护剂菌剂溶藻率达96.11%,菌剂中含有谷氨酸钠和脱脂乳粉,溶藻率分别为94.14%和94.22%.蔗糖和甘油在菌体新陈代谢过程中对菌的保护能力较强,溶藻菌菌体数量多,成活率高,菌体稳定性好,溶藻效果比液体菌剂稍差.     

溶藻细菌胶囊与植物共生系统的建立及其对Microcystis aeruginosa的控制

当前,蓝藻水华时常爆发,其中铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是我国蓝藻水华的典型代表.微生物控藻技术具有高效、生态安全性好、原位修复等特点,近年来已经成为治理蓝藻水华的主要手段.本文通过搭建芦苇湿地试验装置,模拟太湖近岸水域原生环境,以水生植物控藻与溶藻细菌胶囊强化相结合的方式对Microcystis aeruginosa进行生态学-微生物操控试验.从藻胆蛋白、抗氧化系统、膜脂值活性等方面的研究来探究控藻系统的溶藻机制,并通过高通量技术与主成分分析来探索溶藻细菌与藻之间的群落动态关系.试验结果表明,原位藻类控制系统效率高,14 d溶藻率为(88.74%±1.10%),其中溶藻细菌胶囊占主导地位,植物修复为辅.通过对藻胆蛋白的破坏和藻类抗氧化系统的摧毁来导致藻类膜结构的受损,胞内物质流出而死亡.利用高通量技术发现,溶藻细菌胶囊所包埋的菌株Bacillus sp.HL在微生物体系中成为优势菌种.主成分分析结果表明高效原位控藻体系促进了藻体内ROS水平,增强了藻的Zeta电位和抗氧化酶活性,从而抑制了Microcystis aeruginosa的生长.     

焦酚对共培养铜绿微囊藻和雨生红球藻影响的初步研究

以单株藻为对象的纯培养抑藻测试体系被广泛用于化感抑藻活性物质筛选和作用机理研究,但自然水体中藻类常常相伴而生并相互作用,共存藻类对化感物质抑藻效果的影尚不清楚。为探讨藻类共存状态下对化感物质的响应,选择沉水植物穗花狐尾藻(Myriophyllum spicatum)的典型化感抑藻物质焦酚,以有害蓝藻铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)和经济绿藻雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)为受试藻,同时设置混合共培养体系和纯培养体系,比较焦酚对不同培养体系中两株藻的影响。结果显示,纯培养和共培养体系中,焦酚对铜绿微囊藻细胞增长的抑制率分别为96.82%和93.18%,而对雨生红球藻细胞增长的抑制率显著降低,分别为29.39%和45.40%。焦酚处理的纯培养和共培养体系中铜绿微囊藻胞外藻毒素质量浓度分别为3.23、2.00μg·L~(-1),雨生红球藻单个细胞内虾青素质量浓度分别为0.82、1.21 pg·cell-1。与纯培养相比,共培养体系中焦酚对铜绿微囊藻生长的抑制作用减弱,微囊藻毒素释放量显著降低(P0.05),而对雨生红球藻生长的抑制作用增强(P0.05),单个细胞内虾青素积累量最大(P0.05),表明两者共存减弱了焦酚对铜绿微囊藻的抑制效应,却增强了焦酚对雨生红球藻的影响。这些结果初步说明共存藻类会影响化感物质对目标藻株的抑制效应,在后续化感抑藻作用研究中,充分考虑藻类所处生物和非生物环境,将有助于深入揭示水生植物化感抑藻作用生态机制,明确化感作用和化感物质的生态学价值。     

FDA-PI双色荧光法检测蓝藻细胞活性的研究

对FDA-PI双色荧光法检测水华鱼腥藻和铜绿微囊藻的活性进行了研究,用荧光显微镜对染色结果进行测定.结果表明,在蓝色光激发下(495nm),活细胞被双醋酸荧光素FDA染成亮绿色,死亡细胞被碘化丙锭PI染成红色.染色效率与原植体类型和细胞密度有关.对细胞密度为6×107—7×109个·l-1的铜绿微囊藻,FDA染色效率可达94%以上.对细胞密度为4×107—5×108个·l-1的水华鱼腥藻,FDA染色效率可达91%以上,但细胞密度增大到5×109个·l-1时,由于藻丝体易卷曲在一起,FDA染色率下降到67%.对死亡细胞,PI染色率基本都可达到100%.因此,用FDA-PI检测活细胞和死亡细胞混合的细胞悬液,可根据细胞所发出的不同荧光而判断细胞活性.     

附生假单胞菌存在下不同光照时间对铜绿微囊藻生长与磷代谢的影响

通过设置8/16、12/12、16/8不同光暗比,分析了附生细菌存在下不同光照时间对铜绿微囊藻(M icrocystis aeruginosa)生长及其与附生假单胞菌(Pseudom onassp.)磷代谢之间关系的影响。结果表明:光照时间越长,铜绿微囊藻生长越快,16 h光照下的比增长速率为8 h光照下的1.6倍。铜绿微囊藻的快速生长促进了附生细菌中磷的释放;藻细胞增殖越快,附生细菌释放的磷越多。铜绿微囊藻对数生长期末,8、12、16 h光照下附生细菌磷含量分别降至对数生长初期的87.8%、78.6%和64.9%。铜绿微囊藻对附生细菌磷释放的促进作用是由藻细胞生长对磷的消耗再吸收导致的。     

光合细菌对铜绿微囊藻生长的抑制效应

为了探讨光合细菌对水华藻类的控制作用,在实验室条件下,通过菌藻共同培养,研究了沼泽红假单孢菌(Rhodopseudomonas palustras)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)及其混合培养物对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)生长的抑制效应.实验结果表明,光合细菌混合培养物对铜绿微囊藻抑藻作用最强,培养5 d时,铜绿微囊藻生物量降低率达58.9%,培养时间、培养温度、菌体投加量及培养基pH值等对光合细菌混合培养物的抑藻作用均有不同程度的影响.光合细菌混合培养物发挥抑藻作用的适宜条件为培养温度25℃,培养时间≤5 d,光合细菌投加量(V_(光合细菌菌悬液):V_(藻培养液)=1:80),藻培养基pH为8.0左右.     

基于实验室培养的一株铜绿微囊藻生长动力参数率定及生长数值模拟

铜绿微囊藻水华是目前湖库中主要的有害蓝藻水华,其预测预报方法研究对缓解水华危害具有重要意义。在CE-QUAL-W2模型的基础上,利用PIKAIA遗传算法模拟一种蓝藻水华典型优势种铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的室内生长过程,分析不同生长动力学参数对其生长的敏感性,并确定敏感性参数的阈值。结果表明,CE-QUAL-W2模型能较好地模拟铜绿微囊藻的室内生长过程,最大生长率(AG)、沉降速率(AS)、最适光强(ASAT)、藻细胞氮含量(ALGN)、藻细胞磷含量(ALGP)和单位藻干重叶绿素a(Chl-a)含量(ACHLA)是影响铜绿微囊藻生长的敏感性参数。其中,与Chl-a峰值呈正相关的参数有AG和ACHLA,呈负相关的参数有AS、ASAT、ALGP和ALGN。与Chl-a峰现时间呈正相关的参数有AS和ASAT,呈负相关的参数有AG、ALGP和ALGN。ACHLA的变化只会使Chl-a同倍比放大或缩小,不改变峰现时间。这6个参数的较优取值如下:AG为7.526 8 d~(-1),AS为0.002 2 m·d~(-1),ASAT为102.774 4 W·m~(-2),ALGP为0.000 5,ALGN为0.041 3,ACHLA为0.125 8 mg·μg~(-1)。     

白玉兰落叶水浸出液抑制蓝藻生长和叶绿素荧光特性分析

利用浮游植物荧光仪对暴露于不同浓度白玉兰落叶水浸出液下微囊藻生长、最大光合作用效率(Fv/Fm)、实际光合作用效率[Y(Ⅱ)]、光能利用效率(alpha)和最大相对电子传递速率(r ETRmax)进行为期15 d的检测,分析白玉兰落叶浸出液对微囊藻的抑制效应和叶绿素荧光特性影响.结果发现,白玉兰落叶浸出液能有效抑制微囊藻的生长,呈明显浓度抑制型变化,抑藻能力随时间的延长而下降.低浓度(0.4、0.8、1.2、1.6 g·L-1)浸出液胁迫下,对微囊藻叶绿素荧光参数无显著影响;高浓度(2.0 g·L-1)浸出液胁迫下,在早期(4 d内)对荧光参数有极显著抑制作用.三维荧光图谱表明,在投量为2.0 g·L-1时,第15天色氨酸及酪氨酸荧光峰强度约为1.2 g·L-1投量情况下的1/3,同时腐殖酸的荧光峰强度减弱.第7—15天,藻细胞生长的半抑制浓度EC50值最小约为0.5—0.7 g·L-1.