淇河鲫生长激素全长cDNA的克隆与序列分析

采用RT-PCR法和3',5'RACE(Rapid amplification of cDNA ends)法从淇河鲫脑垂体RNA克隆出生长激素(Growthhormone,GH)cDNA.此cDNA全长1 191 nt[含Poly(A)14 nt],其5'端非编码区长55 nt,阅读框(Open reading frame,OAF)长633 nt,3'端非编码区长503 nt.由其推导的GH前体由210个氨基酸组成,其中氮端前22个氨基酸为信号肽部分.氨基酸序列比较表明,淇河鲫与同目的鲫鱼、鲤鱼、团头鲂和斑马鱼的同源性分别为98.6%、96.2%、91.5%和88.6%;与不同目的胡子鲇和鳗鲡的同源性分别为74.6%和49.5%;与哺乳类的家鼠和人等的同源性低于40%.图3参30     

家蚕丝心蛋白轻链cDNA和基因调控片段的克隆及序列分析

从家蚕品种菁松×皓月后部丝腺中提取总RNA ,用RT -PCR扩增技术克隆到家蚕丝心蛋白轻链cDNA .序列分析表明 ,该片段全长为 798个碱基 .比较 4种不同品种来源的家蚕丝心蛋白轻链基因外显子区域序列 ,同源性在98.0 %～ 99.4 %之间 ,推测的氨基酸同源性在 98.0 %～ 99.6 %之间 ,4个品种间发生的变异比较一致地集中在不同位置的 8个碱基上 .提取家蚕品种菁松×皓月后部丝腺总DNA ,进行PCR反应 ,获得家蚕丝心蛋白轻链基因调控片段 ,长度约为 1.2kb,测定了其邻近起始密码子一端包括 5 76个碱基的DNA序列 .结果表明 ,该片段包括一些典型的调控元件和多个可能参与丝蛋白基因特异性表达调控的元件 ,该部分序列与J - 139L链基因相应区域同源性高达 98.8% .图 3参 8     

解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达

利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸测序结果完全一致 ,说明克隆到的基因确实是豆豉溶栓酶基因 .同源性分析表明 ,DFE成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为 80 .0 %和 86 .5 % ,这提示豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶 .将表达质粒pET Nde转化E .coliBL2 1(DE3)中 ,IPTG可诱导表达大量的DFE融合蛋白 ,占菌体可溶性蛋白的 4 0 % ,主要以包涵体的形式存在 .图 3表 1参 19     

苏云金芽孢杆菌新基因cry1Ab17的克隆和生物信息学

利用高效克隆PCR产物的专用载体pMD18T,直接从苏云金芽孢杆菌WB9的PCR产物中克隆了cry1Ab17新基因.测序结果表明,该基因(GenBank登录号为AY646166)由3471个碱基组成,其编码的蛋白质含有1156个氨基酸残基,其中亲水性氨基酸占30.8%,疏水性氨基酸占45.2%,酸性氨基酸占12.9%,碱性氨基酸占11.1%.氨基酸序列的同源性分析结果表明,Cry1Ab17蛋白与已报道的Cry1Ab蛋白同源性为95.4%～99.7%,该蛋白的4个氨基酸残基———Pro170、Gly449、Gly796和Gly863与其它已报道Cry1Ab蛋白相应位置的氨基酸残基均不同.在核苷酸序列和氨基酸序列多重比较的基础上,应用PAUP4.0构建了Cry1A蛋白家族的系统发育树.SignalP分析结果显示,Cry1Ab17蛋白中不含信号肽序列.此外,对Cry1Ab17蛋白的二级结构和3个结构域也进行了预测和分析.图4表2参15     

表达马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的转基因烟草抗病机制

根据已报道的马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)核苷酸序列，克隆了PVY^N外壳蛋白(CP)基因，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导的方法，转化烟草NC89，获得了38株PCR呈阳性的转基因植株．攻毒试验发现，转基因植株对PVY^N的抗性水平存在着差异，其中有4株表现为高度抗病性．Southern blot表明，PVY^N CP基因已经整合到烟草染色体中，转基因的拷贝数与植株的抗病性成正相关．Northern blot表明，PVY^N CP基因在RNA水平上得到了表达，而且PVY^N CP RNA在细胞中的积累量与转基因植株的抗病性呈明显的负相关．Western blot表明，高度抗病植株未检测到转基因CP蛋白质，而抗病和感病植株都检测到了PVY^N CP蛋白，且不同抗性的转基因植物中转基因蛋白质的积累有一定的差异．实验结果表明，表达PVY^N CP基因的转基因烟草其抗病机制类似于转录后的基因沉默，即抗病件可能是RNA介导的．     

瞬时表达比较马铃薯X病毒CP基因3种结构对RNA沉默的诱导效果

RNA沉默是植物抵御病毒侵染的一种防卫机制,病原来源的抗性(pathogen-derived resistance,PDR)被认为是通过RNA沉默起作用的.转化的核酸片段在基因组中的位置、长短和不同排列结构等均影响RNA沉默的效率.用全长马铃薯X病毒(PVX)CP基因构建非翻译的正义、反义和反向重复结构转基因的植物表达载体,通过农杆菌渗入法瞬时表达测试了这些转基因对RNA介导抗性的诱导效率和有效性.结果表明,反向重复的PVXCP是更为有效的RNA沉默诱导因子,同时也证明让目的基因在受试植物中瞬时表达,在转化植物之前能比较快速地检测转基因的表达情况以及表达产物的功能,从而节约时间和资源,并减少盲目性.图3表2参21     

一种新去整合素Adinbitor的表达、序列分析及其对C6神经胶质瘤细胞凋亡的诱导

Adinbitor为一通过基因工程方法获得的来自于中国白眉蝮蛇毒腺的去整合素家族的新成员 .从蝮蛇毒腺中提取总RNA进行RT -PCR扩增 ,获得了 2 19bp的白眉蝮蛇去整合素基因 .cDNA测序及由此推导的氨基酸序列结果显示 ,Adinbitor为含有 73个氨基酸的多肽 ,其中包括 12个半胱氨酸 ,并具有去整合素的特征模序 -RGD .对此去整合素基因进行克隆、转化与诱导后 ,得到了该蛋白的可溶性高效表达 .经组氨酸亲和层析纯化 ,获得了分子量Mr为 9×10 3 的均质融合蛋白 ,并将其命名为adinbitor.序列分析表明 ,adinbitor与已发表于GENBANK上的整合素序列有很高的同源性 ,其中同源性最高的是南韩的saxatilin ,二者的蛋白质同源性高达 91.78% .活性测定结果表明 ,Adinbitor能有效地诱导神经胶质瘤细胞C6的细胞凋亡 ,有希望成为一种抗癌新药 .图 5参 15     

甘蓝型油菜半胱氨酸蛋白酶cDNA的克隆及组织特异性表达分析

采用SSH (Suppression subtractive hybridization)和Race-PCR (Rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆得到来自甘蓝型油菜(Brassica napus L.)矮化突变体'NDF-1'的一个差异表达基因编码区的全长cDNA序列,命名为Bncp5.该基因全长1 224 bp,含有1 080 bp的完整开放阅读框,编码359个氨基酸.该基因编码区与甘蓝中一个与衰老相关的半胱氨酸蛋白酶基因(登录号AF454960)同源性达97%,氨基酸序列同源性达到100%. Bncp5编码的蛋白相对分子质量为39.5×103,等电点为5.57.对其活性位点的分析表明其具备真核生物半胱氨酸蛋白酶的活性中心,且有很高的功能区段保守性,推测为一跨膜蛋白.相对定量PCR的检测结果表明, Bncp5在野生型和矮化突变体的根、茎、子叶和真叶中都有表达,但是表达量存在显著性差异.在野生型高秆油菜中,根的表达量最低,在真叶的表达量最高;在矮化突变体中,根、茎中的表达明显高于野生型,而在子叶和真叶中的表达量与野生型油菜的表达量基本一致.     

水稻RBX1基因cDNA的分离及其过量表达载体对水稻的转化

RBX1蛋白是基于Cullin蛋白的E3复合体中的一个亚基,对于基于Cullin蛋白的E3复合体结合E2及Cullin蛋白的活化具有重要作用.利用RT-PCR分离到水稻RBX1cDNA,序列比对分析显示,水稻RBX1与拟南芥、人、果蝇及酵母中该同源蛋白的氨基酸序列一致性分别为80%、74.4%、72%和51.2%.酵母双杂交实验显示,水稻RBX1与水稻Cullin4蛋白有着相互作用.将水稻RBX1cDNA插入植物表达质粒pHB,利用农杆菌介导法将构建好的植物表达载体导入水稻,获得植株38株.以基因组DNA为模板对潮霉素抗性基因片段进行扩增,初步确定其中32株为转基因植株.图5表1参17