水体中盐单胞菌属(Halomonas)细菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

通过制备标准曲线模板,针对一株盐单胞属细菌X3(经鉴定为Halomonas alkaliphila)的16S r DNA序列设计和筛选特异性引物,建立水体中盐单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法,并将该法用于检测莱州人工鱼礁海域Halomonas属细菌数量.结果表明,引物X3-3F和X3-3R能够对Halomonas属的细菌进行特异性检测,对细菌浓度为6.75×10~1-6.75×10~7 CFU/m L检测重复性和稳定性较好,最低检出浓度为67.5 CFU/m L.运用建立的方法对莱州人工鱼礁海域水体样品的检测结果表明,在未投礁海域2011年5月和7月水体样品中Halomonas细菌数量分别为8.71×10~3 CFU/m L和2.37×10~3 CFU/m L,而投礁区5月份水样也检出了该属细菌,但荧光信号较弱,7月份水样未检出该属细菌.本研究可为Halomonas属细菌的快速检测及其在海水养殖水质净化方面的推广应用提供有力的技术支撑.     

化学-生物絮凝污水处理工艺中微生物群落结构变化分析

利用分子生物学技术，直接从化学-生物絮凝工艺的活性污泥样品中提取DNA，对16S rDNA V3区进行PCR扩增，结合DGGE（变性浓度梯度凝胶电泳），分析了活性污泥中微生物群落结构，并对Shannon多样性指数进行分析讨论，通过研究指出系统中细菌数量的增加或减少．测定了活性污泥中部分菌种的16S rDNA V3区片段序列，通过NCBI（美国国立生物技术信息中心）基因库比对，初步确定细菌的属．结果表明，PCR—DGGE结合测序技术是一种完全可行的快速进行环境样品微生物研究的分析方法．图3表4参13     

基于分子信标探针的荧光定量PCR方法检测转基因食品

选择了内源基因大豆植物凝集素(lectin)、玉米转化酶(invertase)和外源基因花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子的分子信标探针,确定了探针浓度和镁离子浓度等反应条件,分别对转基因大豆和转基因玉米系列标准品进行内源基因和外源基因的荧光PCR扩增,在PCR反应过程中分别以两种荧光通道信号分别追踪同一样品DNA内源基因和外源基因的扩增动力学变化,并依此绘制了循环阈值与转基因食品百分比含量之间的标准曲线,建立了转基因大豆和转基因玉米的分子信标探针-荧光定量PCR检测方法,该方法具有特异性强、敏感性高的特点,实现了对转基因食品的定量分析.图7表1参11     

利用PCR-DGGE技术分析乳制品中的乳酸菌

在食品发酵行业,需要一种简捷有效的方法检测发酵产品中的有益微生物.聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(Ploymerase chain reaction and denaturing gredient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术广泛应用于微生物生态学的研究.采用PCR-DGGE对5种含有乳酸菌的乳制品进行了菌群组成分析,并通过传统培养方法和核酸序列分析进行了验证.结果表明,所有测试样品中的活菌数量都在106～109 cfu/mL之间,通过平板培养法分离出了形态明显的杆状菌和链球状菌,对其进行16S rDNA核酸序列测定及同源性分析,将其鉴定为德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus).建立了由已知乳酸菌组成的DGGE参考阶梯(Reference ladder),可用其对相应菌株进行DGGE鉴定.用两对不同引物进行PCR-DGGE分析,除样品1外,试样中均检测到德氏乳杆菌和嗜热链球菌.对DGGE参考阶梯未能直接鉴定的样品1的电泳条带进行同收、序列分析,分别鉴定为卷曲乳杆菌(L.crispatus)和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus).同时发现,引物R518-F357对嗜热链球菌模板的识别效率高于引物Lac1GC-HDA2.以上结果表明,RCRDGGE技术可以对样品中的乳酸菌进行快速的分析和鉴定.图4表1参30     

几株紫色非硫细菌的分离鉴定与产氢特性分析

从重庆地区不同环境淤泥、泥水样品中,经富集培养、分离纯化,获得5株紫色非硫细菌.根据菌体的菌落形态、染色特性、生理生化特征及活细胞光吸收峰对菌株进行常规鉴定,结合菌株16S rDNA扩增测序进行分子生物学分析验证,构建了菌株与数据库中近缘菌株的系统发育树.以优化的培养条件(营养、pH、接种量等参数)对供试菌株的生理生化特性和产氢能力做了比较分析.结果显示,5个菌株均为光合产氢细菌,菌株ANI、D1为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris),AN2、AS1、BS1等3株为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides);其中类球红细菌菌株AN2在给定的培养条件下光合产氢能力最高,可达9.55μg/mL d-1,是一株有应用前景的光合产氢细菌.图4表2参15     

抗除草剂转基因作物实时荧光定量PC检测

建立了一种以SYBR Green Ⅰ为结合染料、快速准确检测转抗除草剂基因成分的实时荧光定量PCR方法.以转基因大豆与转基因玉米标准品为材料,通过使用特异性引物和SYBR Green Ⅰ结合染料实时荧光定量PCR技术,对转基因农作物中外源抗除草剂基因进行了定量检测,绘制了两种基因扩增的标准曲线图,根据标准曲线方程计算外源基因含量;并作了溶解曲线、检测方法检测灵敏度和精密度的分析.研究发现,两者标准曲线方程线性关系良好.R~2 值分别达到0.993 9与0.992 4.通过已知标准品进行验证,实测值与真值接近,与实际含量的相埘偏差是6.52%和7.90%.结果表明,SYBR Green Ⅰ结合染料法完全可以用于转基因农作物定量PCR检测.图5表2参11     

高氨氮废水处理系统中功能微生物的检测

利用16S rDNA分子检测技术对高氨氮废水处理系统中的氨氧化细菌、亚硝酸盐氧化细菌等难分离培养微生物进行了分析检测.从实验室处理高氨氮废水的生物流化床硝化系统生物膜中提取细菌总DNA,以其为模板,利用氨氧化细菌(AOB)和亚硝酸盐氧化细菌(NOB)的16S rDNA特异性引物进行多聚酶链式反应(PCR)扩增,获得AOB和NOB的特异片段.将特异片段与pGEM-T载体连接并转化到E.coli DH5α中获得重组子,对阳性重组子进行酶切分型,AOB可分为8种不同类型.选取AOB的8种类型代表以及随即选取8个NOB克隆进行测序.经GenBank搜索以及同源性分析,发现所获得的8个AOB类型来自不同的菌株,处理系统中以Nitrosomonas sp.和Nitrosococcus sp.为氨氧化细菌的优势菌属;8株NOB重组子中有7株来自不同的菌株,系统中Nitrobacter sp.和Afipia sp.为亚硝酸盐氧化细菌的优势菌属.图6表1参14     

低温纤维素降解菌的分离与鉴定

对内蒙古部分地区土壤中低温降解纤维素的微生物进行研究,以期获得一些高酶活的低温纤维素酶产生菌.采用纯培养的方法,在10℃下培养获得纯培养物.以细菌16S rDNA通用引物PCR扩增后进行序列同源性比对确定种属.以DNS法测定纤维素酶活性,并对酶活较高的菌株进行产酶条件的优化.结果共分离得到55株可低温降解纤维素的菌株,16S rDNA序列分析表明它们分别属于γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及β-变形菌纲(β-Proteobacteria).该55株菌的纤维素酶活性均在22℃下最高.其中菌株CF11在10℃下的酶活在分离得到的55株细菌中最高.通过优化,菌株CF11产纤维素酶的最佳条件初步确定为pH值为6.5,培养时间为10 d,并且是以酵母提取物作为氮源,其纤维素酶活为58.091 IU.因此菌株CF11是一株极具开发潜力的低温纤维素酶产生菌.     

黄河三角洲湿地土壤微生物群落结构分析

采用末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)技术和16S rDNA克隆文库的方法,分析了黄河三角洲滨海湿地土壤不同深度细菌和古菌的群落结构.研究表明,随着深度的增加,细菌群落的多样性下降,而古菌群落多样性则有上升的趋势,且土壤的细菌和古菌群落结构都呈现出规律的层状分布.该土壤包括各种硫酸盐还原菌、产甲烷古菌、光合细菌等丰富的细菌和古菌资源.图5参27     

一株菲降解菌的分离鉴定及其降解条件研究

以菲为研究对象,从克拉玛依稠油污染土壤中筛选到1株对菲具有较好降解效果的菌株JZ3-21。通过形态观察、生理生化指标及16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定。该株菌的16S rDNA序列与Pseudomonas属的相似性达99%,结合分离菌株的形态、生理生化特征和16S rDNA基因序列的分析结果,初步鉴定该菌株为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida.）。对其降解条件进行了研究,结果表明：在40℃,pH 8.0,接种量为1.5%的条件下,菌株对初始质量浓度为100 mg.L-1的菲在64 h内的降解率高达94.2%。该菌对高质量浓度菲有较好的耐受性,其最高耐受质量浓度可达2 000 mg.L-1。