百乐克(BIOLAK)活性污泥宏基因组的生物多样性及功能分析

百乐克(BIOLAK)是一种在全球范围内得到成功推广的多级活性污泥工艺,然而,迄今对于百乐克工艺的核心元件——活性污泥的生物群落及其功能尚鲜见报道.以连云港市大浦工业区废水处理厂为例,借助于新一代高通量测序技术,获得百乐克活性污泥中大规模的宏基因组数据(428 588条高质量DNA序列).鉴定出47个门类、872个属及1 351个物种.细菌域(289 933条序列)中包含33个门,其中变形菌门Proteobacteria是生物量最丰富的门(62.54%),其次是拟杆菌门Bacteroidetes(11.29%)、硝化螺旋菌门Nitrospirae(5.65%)和浮霉菌门Planctomycetes(4.79%),显示这些生物类群在百乐克废水处理系统中发挥着关键作用.在748个细菌属中,硝化螺菌属Nitrospira(5.60%)最为丰富,为活性污泥氮循环过程中的关键菌群.其次为芽单胞菌属Gemmatimonas(2.45%),是生物除磷过程的重要菌属.在古菌域(1 019条序列)中鉴定出3个门及39个属.在真核域(1 055序列),鉴定出10个门及60个属,其中,纤毛虫门Ciliophora是最大的门(257条序列).同时,检测到448条病毒序列,主要为噬菌体.在百乐克活性污泥中,参与氮、芳香化合物和磷代谢的功能基因比例分别为2.50%、2.28%和1.56%,均高于美国和澳大利亚两个废水处理厂活性污泥中功能基因的比例.在氮代谢的4个过程中,反硝化相关基因所占比重最高,达到80.81%,其次是氨化(12.78%)、硝化(4.38%)和固氮(2.04%).总之,在百乐克活性污泥中蕴藏着惊人的生物多样性,同时,参与氮、芳香化合物和磷代谢的功能基因非常丰富.     

温度对硝化杆菌(Nitrobacter)活性动力学影响

为探究温度对亚硝酸盐氧化细菌中硝化杆菌属(Nitrobacter)活性动力学影响,本试验采用序批式活性污泥(SBR)反应器,在通过改变系统进水亚硝态氮(NO_2~--N)浓度达到富集Nitrobacter基础上,以富含Nitrobacter污泥为对象(宏基因组物种注释和丰度分析显示Nitrobacter占细菌总数40. 3%),考察不同NO_2~--N浓度梯度下亚硝酸盐氧化过程比亚硝态氮氧化速率(SNi OR)变化规律,基于Monod模型考察系统温度对Nitrobacter活性动力学影响,并进行统计学分析.结果表明,30℃条件下SNi OR达到最大(以N/VSS计),为1. 31 g·(g·d)~(-1).统计学分析结果显示,Monod方程可较好地反映不同温度条件下基质底物浓度对Nitrobacter活性影响.基于菲尔普斯方程计算不同温度区间内温度系数(θ)可知,当系统温度低于25℃或高于30℃时,反应速率随温度变化越敏感.     

天然红树林土壤微生物大片段宏基因组文库的构建

采用改良及优化后的原位裂解法提取红树林土壤环境DNA,通过脉冲场电泳图谱显示所得DNA片段主要集中于23～50 kbp范围, 表明大片段DNA在总DNA中的比率明显提高; 对改良后的原位裂解提取法与不同DNA纯化方法的组合进行比较分析, 确定电洗脱为最佳纯化方法; 运用改良后的原位裂解提取法与电洗脱纯化法联用实验方案,构建了4个季节天然红树林土壤Cosmid宏基因组文库. 随机挑取克隆子,提取质粒后经BamHI酶切验证, 平均插入片段均大于35 kbp,且片段类型各不相同, 推测该文库至少包含了335 Mbp潮间带微生物基因组信息. 该方法的建立使得开发红树林湿地生态系统的特色微生物资源成为可能, 并为探索其它生境的未培养微生物资源提供借鉴.     

游离亚硝酸抑制硝化杆菌属(Nitrobacter)活性动力学研究

为探究游离亚硝酸（FNA）对亚硝酸盐氧化细菌中硝化杆菌属（Nitrobacter）活性抑制动力学影响,采用序批式活性污泥（SBR）反应器,在通过改变系统进水FNA浓度达到富集Nitrobacter基础上,以富含Nitrobacter污泥为对象（宏基因组物种注释和丰度分析显示上Nitrobacter占细菌总数40.3%）,基于批次试验,考察不同FNA浓度梯度下亚硝酸盐氧化过程比亚硝态氮氧化速率（SNiOR）变化规律,进而拟合FNA抑制Nitrobacter活性抑制动力学模型,并进行统计学分析.结果表明,当FNA≤0.1mg/L时,随着FNA浓度升高,SNiOR迅速升高.当FNA>0.1mg/L时,SNiOR随着FNA浓度升高而降低.尤其当FNA浓度高于0.7mg/L时,SNiOR始终维持在0gN/（gVSS·d）,表明Nitrobacter活性统被完全抑制.统计学分析结果显示相对于Haldane、Aiba、Edwards-1#、Edwards-2#、Luong抑制动力学模型,Han-Levenspiel模型最适合描述FNA对Nitrobacter活性的抑制影响.其统计学常数：残差平方和（RSS）为0.02、可决系数（R²）为0.90、拟合方程的方差检验统计量F值为78.1、可信度P值为3.29×10^-12,其动力学常数值分别为：最大比亚硝态氮氧化速率（r_max）为1.57gN/（gVSS·d）;半饱和常数（K_S）为0.01mg/L;临界抑制常数（S_m）为0.66mg/L.     

我国典型森林土壤微生物驱动的氮代谢途径特征解析

微生物介导的氮代谢途径对生态系统结构和功能稳定性的维持起着重要作用,阐明微生物群落与氮代谢途径之间的关系可以从微观水平上扩展对氮代谢途径的理解.然而,微生物的基因水平转移使得基于分类学的方法并不能说明两者之间的关系.有研究表明,功能性状影响着群落构建和生态系统功能,将基于功能性状的研究方法应用于土壤微生物能更好地说明氮代谢途径的特征.因此,本文选择5种我国典型森林土壤,包括黑土（黑龙江哈尔滨）、暗棕壤（吉林长白山）、黄棕壤（湖北武汉）、红壤（福建福州）和砖红壤（海南乐东）,利用可以量化微生物功能性状的宏基因组技术对不同森林土的氮代谢途径特征进行了研究,主要包括氨同化、硝酸盐异化还原、硝酸盐同化还原、反硝化、硝化、固氮和厌氧氨氧化过程.结果表明,细菌序列在宏基因组文库中占主导位置,占所有序列的98.02%,且所涉及的几种氮代谢途径在细菌中都被检测到.5种森林土有着相同的氮代谢途径特征,即氨同化是细菌中检出频率最高的氮代谢途径,每百万个带注释的细菌序列平均检测到2830个氨同化途径的功能基因,固氮和厌氧氨氧化代谢途径检出频率较低,每百万个序列分别只检测到28.3和10.7个功能基因.不同森林土壤中同一氮代谢过程可由不同的微生物参与,且负责整个氮代谢途径的微生物的群落结构不完全相同.     

宏基因组揭示紫色土中邻苯二甲酸酯去除的微生物学机制

邻苯二甲酸酯具有内分泌干扰特性,在环境中持久存在,其去除机制备受关注.为探究邻苯二甲酸酯在紫色农田土壤中的去除机制、关键微生物及功能基因,以邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）和邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）为目标污染物,分别设置含量为0、5、10和20 mg·kg^-1的单一污染土壤,避光培养90 d,利用宏基因组技术探究其去除的微生物生态学机制.结果表明,DBP和DEHP在土壤中的降解动态均符合一级动力学降解模型,半衰期介于17.0~38.2 d之间,5 mg·kg^-1的DBP降解速率最快,依次快于10 mg·kg^-1的DEHP、5 mg·kg^-1的DBP、5 mg·kg^-1的DEHP以及20 mg·kg^-1的DBP和DEHP.第7 d和15 d的土壤样品间细菌群落结构存在显著差异,放线菌门相对丰度随时间不断提升,且与DBP或DEHP半衰期呈反比.物种共现网络分析筛选出变形菌门的Pandoraea属为群落中的关键物种,可以用来指示DBP和DEHP污染程度.KEGG功能注释结果表明,Pandoraea在群落中负责酯键水解、苯甲酸降解、群体感应、ABC转运和双组分系统等功能,可以促进邻苯二甲酸酯上下游降解、细胞通讯和其它降解菌的生长繁殖,以此维持群落结构的稳定.由此可见,紫色土中,DBP和DEHP的去除效率取决于初始含量和自身性质,放线菌门的细菌在降解中扮演重要角色,Pandoraea在促进邻苯二甲酸酯降解和调节降解菌群结构和功能的稳定中均发挥关键作用.     

餐厨垃圾厌氧消化过酸化系统微生态特征的宏基因组学分析

过酸化失稳是困扰有机废物厌氧消化（AD）过程高效稳定运行的一大难题.为探析不同诱导方式造成过酸化的AD系统微生态特征差异,在餐厨垃圾中温AD反应器中分别引入负荷扰动（R2）、温度及搅拌扰动（R3）以诱发系统过酸化,利用宏基因组学测序技术,对比考察稳定与酸化系统微生物群落结构及主要产甲烷功能路径差异.结果表明,两种方式均成功诱发系统过酸化失稳,过酸化系统中挥发性脂肪酸（VFA）过量富集（R2、R3系统中分别高达（12.53±1.96） g·L^-1和（8.00±0.81） g·L^-1）的同时,丙酸等多碳VFA组分比例大幅升高.R2、R3系统酸化后其产甲烷菌及相关酶受到高浓度VFA的显著抑制,酸积累程度更高的R2受抑制更为明显.且经相关性分析发现,多碳酸尤其是丙酸是抑制产甲烷作用的关键因素.与R2相比,R3具有更高的耗氢能力,耗氢微生物如可耗H₂产酸的Treponema属和氢营养型产甲烷菌Methanoculleus属、Methanospirillum属等相对丰度显著高于R2.酸化系统均以乙酸营养型产甲烷为主要的产甲烷途径,并以Methanosaeta属为主要的乙酸型产甲烷菌.酸化系统中更高含量的乙酸产甲烷途径的AK-PTA酶有利于促进对乙酸的利用,增强厌氧消化微生物菌群对高浓度乙酸的耐受 能力.本研究中的相关结果可为提高有机废物AD微生态抗酸化能力提供理论依据和数据支撑.     

基于新一代测序技术的A2O与BIOLAK活性污泥宏基因组比较分析

本研究是A2O(anaerobic/anoxic/oxic,厌氧/缺氧/好氧)与百乐克(BIOLAK)活性污泥宏基因组比较分析的首份报告.在百乐克和A2O活性污泥宏基因组中,分别检测到47个和51个门类,超过了澳大利亚强化生物除磷(enhanced biological phosphorus removal,EBPR)、美国强化生物除磷和Bibby活性污泥中所检测到的生物类群.百乐克活性污泥中所发现的门类,均在A2O活性污泥中检测到.但是,有4个门类仅在A2O活性污泥中出现.Ignavibacteriae门在A2O活性污泥宏基因组中的比例(2.044 0%)是百乐克活性污泥(0.637 6%)的3.2倍.与此同时,芽单胞菌门在百乐克活性污泥宏基因组中的比例是2.467 3%,比其在A2O活性污泥中的比例(0.140 4%)高出17倍多;衣原体门在百乐克活性污泥宏基因组中的比例是0.219 2%,比其在A2O活性污泥中的比例(0.036 0%)高出6倍多.另外,在属的层级,有167个属仅在A2O活性污泥中检出;与此同时,有50个属仅发现于百乐克活性污泥中.因此,在门和属的层级,A2O与百乐克活性污泥的生物群落均存在巨大差异.然而,在百乐克和A2O两个活性污泥中,与氮、磷、硫和芳香族化合物代谢相关的功能基因比例均是非常接近的.此外,两个活性污泥中KEGG(Kyoto Encyclopedia for Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)所有6个类别的排序均相同.同时,氮代谢相关的功能基因分类和通路分析表明,高丰度酶在百乐克和A2O宏基因组中具有相同的排序.因此,A2O和百乐克活性污泥宏基因组比较分析显示,两个不同的生物群落具有相似的功能分配.     

微塑料和镉复合污染对狼尾草根际土壤微生物群落结构和功能的影响

微塑料和重金属复合污染对植物生长和根际微生物群落和功能的影响目前尚未清晰.以狼尾草为实验材料进行盆栽模拟试验,研究重金属镉（Cd）与不同种类MPs （PE、PS）、粒径（13 μm和550 μm）、质量分数（0.1%和1%）的微塑料复合污染对狼尾草生长、重金属积累和根际微生物群落功能的影响.结果表明,MPs和Cd复合污染条件下整体呈现对植物生长胁迫增加、Cd含量和积累量降低的趋势.MPs和Cd复合污染能改变细菌群落组成,降低细菌多样性,其中550 μm 0.1% PE+Cd处理组ACE指数和Chao1指数降低最显著.与单一Cd污染相比,不同MPs种类、质量分数和粒径的MPs添加能改变新陈代谢、氨基酸的转运和代谢、能量生成和转换等功能组的基因丰度,显著影响狼尾草根际土壤细菌的功能.研究采用宏基因组学的方法分析了MPs和Cd复合污染对狼尾草根际细菌群落和功能的影响,可为MPs重金属复合污染的生态毒理效应及其生物修复提供基础数据和科学依据.     

环境宏基因组学技术的主要瓶颈及发展

从环境宏基因组文库的构建及筛选两方面分析了环境宏基因组学技术所存的主要瓶颈,综述了针对主要瓶颈而发展的最新环境宏基因组学技术,展望了环境宏基因组学技术在微生物生态学基础研究及生物技术应用研究领域的发展方向.