豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化

将含有和不含前肽的豆豉溶栓酶编码序列在毕赤酵母中分别进行表达研究,发现在含有前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母工程菌用甲醇诱导时,其培养液中可检测到较强的溶栓酶活性;而在不含前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母菌用甲醇诱导时,培养液中未检测到溶栓酶活性.对毕赤酵母表达和分泌的豆豉溶栓酶进行了分离纯化,并对其纯化产物进行溶栓酶活性、SDS-PAGE电泳、抑制剂作用及免疫印迹分析.结果表明,分泌到培养液中的豆豉溶栓酶已经过剪切加工,其前肽已被切除,重组与天然的豆豉溶栓酶具有相同的溶栓酶活性,其所测定的各理化指标均一致.本研究实现了豆豉溶栓酶在毕赤酵母菌中成功表达,并首次直接证明了前肽对豆豉溶栓酶在毕赤酵母中分泌表达是必须的.图3表1参20  

外源基因在乳酸菌中的表达

乳酸菌表达系统是近几年发展起来的一种高效表达系统．由于许多乳酸菌具有益生菌的特点，该系统已被广泛用于外源基因的表达．相对于其他细菌表达系统而言，乳酸菌表达系统具有多种优势．本文就该系统的优势及其发展前景进行了阐述．参20  

盐碱胁迫对水稻幼苗中基因差异表达的影响

为了阐明已分离的盐碱适应性相关基因(Liuetal, 2000)的表达特性,以14d叶龄的水稻品种日本晴幼苗为材料,分别经NaHCO3 (60mmol/L,pH8. 50) )处理6h、12h、24h、48h, 及不同pH值(pH4. 50, 6. 50, 8. 50, 10. 50)的NaCl(100mmol/L), NaHCO3 (60mmol/L)和Na2CO3 (30mmol/L)处理24h, 以分析时间效应及浓度与pH值间的联合效应. 结果表明,与对照(H2O, pH6. 50)相比较,NaHCO3 (60mmol/L)处理6h、12h、24h、48h后,mitochondrialAT Pase6×103的转录本分别提高2. 73、0. 82、0. 01和1. 79倍;cAPX转录本在24h和48h较对照提高1. 17和1. 49倍;处理6h后CA和HSP90基因表达受显著抑制;UDPG-GT增强表达的滞后期为6h;thioredoxin受NaHCO3轻微抑制.不同pH值和24h处理条件下,NaHCO3和Na2CO3显著促进mitochondrialATPase6×103基因表达.CA基因表达受Na 、HCO-3 和pH的共同影响;而thioredoxin主要受Na 和pH的双重影响; cAPX也表现出类似趋势.UDPG-GT在Na2CO3处理中表达量最高,HSP90的表达随pH的升高而降低. 图6表2参13  

碱性果胶酯裂解酶工程菌的构建

从本研究室筛选的BacillussubtilisWSHB04-02菌株中扩增出编码碱性果胶酯裂解酶的结构基因PL,将其插入大肠杆菌分泌表达载体pET22b( )多克隆位点,得到重组载体pET22b( )PL.序列分析表明,所获PL基因与已报道的B.subtilisSO113的PL基因的同源性为98%.重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达.SDS-PAGE分析显示,表达产物的分子量(Mr)均为43×103,同核酸序列测定所推导的值相符.该工程菌经IPTG诱导后,胞内酶活为8U/mL.研究发现,碱性果胶酯裂解酶不仅在胞内有酶活,胞外也有酶活,说明所构建的表达体系可使该酶向胞外分泌.图3表1参6  

邻苯二酚1,2-双加氧酶(C12O)基因的定位、克隆和表达

射性同位素标记ｔｆｄＣ基因片段作探针，Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交定位Ｌ１菌株的邻苯二酚１，２双加氧酶基因位于ＰｓｔⅠ的Ｉ片段和ＢａｍＨⅠ的Ｍ和Ｎ片段．低熔点琼脂糖回收ＰｓｔⅠ的Ｉ段，直接克隆至表达载体ｐＫＴ２３０上，获得重组子ｐＫＴ２３０ｐ．重组子转化不具开环酶活性的甲胺磷降解菌Ｐ２，获得高效的Ｃ１２Ｏ酶活  

籽粒苋苹果酸酶(NAD-ME)基因密码子偏好性分析

遗传密码子是生命信息的基本遗传单位,每种氨基酸对应1～6个同义密码子.特定物种在长期进化中形成了适应自身基因组环境的密码子使用偏性.运用CHIPS、CUSP和CodonW程序分析自主克隆的籽粒苋NAD-ME基因的密码子偏好性,并与马铃薯等7种植物的ME基因密码子偏好性进行比较,以期为该基因在作物遗传改良中选择合适的受体植物提供依据.结果表明,籽粒苋NAD-ME基因偏好于以A或T结尾的密码子,其它几种被比较作物的ME基因也有同样的趋势,但双子叶植物的偏好性更强.基于NAD-ME基因的密码子使用偏性的系统聚类分析表明,籽粒苋与马铃薯、拟南芥、葡萄、蓖麻、毛果杨等双子叶植物聚为1类,玉米和高粱这2个单子叶植物聚为1类,预示籽粒苋NAD-ME基因更适合导入马铃薯等双子叶植物.对籽粒苋NAD-ME基因的密码子偏好性与大肠杆菌和酵母的基因组密码子偏好性进行比较,发现均存在差异,与大肠杆菌的差异高于酵母,表明酵母表达系统要优于大肠杆菌表达系统.若要进一步提高籽粒苋NAD-ME基因在大肠杆菌或酵母中的表达水平,尚需对其密码子进行优化.  

低磷胁迫下不同品种水稻秧苗生长的分子生理特性

以国际上公认的化感水稻PI312777和非化感水稻Lemont(均引自美国)为材料,采用水培方法研究了不同水稻品种响应低磷(0.5 mg/L,以P计)胁迫的分子生理特性.结果表明,低磷胁迫促进PI312777根的生长,对株高和干重具有微弱的抑制作用.而Lemont相应形态指标均受到较大的抑制,与PI312777相比,均达到极显著差异.低磷胁迫对PI312777相应生理生化指标的影响均低于Lemont,且达极显著水平.此外,低磷胁迫下,PI312777植株氮(N)、磷(P)、钾(K)含量均不同程度高于Lemont,具体表现为两种水稻植株N含量差异不显著,而P、K含量差异达极显著水平.N、P、K吸收利用相关的12个关键酶的基因差异表达进一步证明了前述结论.研究显示,低磷胁迫下,PI312777比Lemont具有更强的适应性能力.  

皮质醇影响青鳉鳃内钠钾ATP酶基因表达的研究

目前河流中存在较高浓度的天然和人造糖皮质激素(如皮质醇等)污染,其可能对鱼类的渗透压调节和海河洄游产生影响.鱼类鳃内钠钾ATP酶对调节渗透压平衡、适应海河洄游等起关键性作用,有研究表明鱼类鳃内钠钾ATP酶基因表达受皮质醇调控.为此,论文克隆了青鳉钠钾ATP酶α和钠钾ATP酶β基因的序列片段,建立了实时定量RT-PCR测定方法,研究了盐度的增加对其基因表达的影响,并重点探讨了皮质醇对鱼类适应盐度时鳃内钠钾ATP酶基因表达变化的影响.结果表明,适应15‰盐水的青鳉鳃内钠钾ATP酶α和钠钾ATP酶β基因表达显著升高;在转入淡水48h后,钠钾ATP酶α和钠钾ATP酶β基因表达基本恢复到正常水平,但是转入含有100ng·L-1皮质醇暴露水平的淡水中,48h后钠钾ATP酶α基因表达仍处于较高水平,表明100ng·L-1浓度的皮质醇能够显著诱导鳃内钠钾ATP酶α的基因表达,可能干扰渗透压调节,对一些洄游鱼类的溯河过程可能构成潜在影响.  

邻苯二酚1,2—双加氧酶（C120）基因的定位,克隆和表达

放射性同位素标记ｔｆｄＣ基因片段作探针，Ｓｏｕｔｈｅｒｍｂｌｏｔ杂交定位Ｌ１菌株的邻苯二酚１，２－双加氧酶基因位于ＰｓｔＩ的Ｉ片段和ＢａｍＨＩ的Ｍ和Ｎ片段。  

SO2长期吸入对大鼠肺组织基因表达谱的影响

采用Affymetrix的基因芯片(RAE230A)技术,研究了SO2长期动态吸入(14mg/m3,1h/d,共30d)后大鼠肺组织基因表达谱的改变.结果表明,与对照组(CK)相比,SO2长期吸入后大鼠肺组织表达上调的基因有173个,其中包括79个已知基因和94个新基因,而表达下调的基因有85个,其中包括46个已知基因和39个新基因.表明:(1)长期吸入SO2的大鼠肺基因表达谱与其CK相比,表达有差异的基因涉及到脂肪酸代谢、免疫、炎症、氧化应激、原癌基因、肿瘤抑制基因和细胞外基质等,表明低剂量长期吸入SO2在体内的机理非常复杂;(2)SO2高剂量短期吸入与低剂量长期吸入后,大鼠肺组织基因表达谱的改变很不一致,表明二者在体内的作用机理不同;(3)SO2可引起多种基因的表达发生改变,这意味着多种基因的表达是易变的、不稳定的,在肺组织中可能存在着SO2诱发的表达不稳定型基因组.表1参19