利用细菌表面展示技术构建镉耐受性的重组根瘤菌

通过细菌表面展示功能基因InaXN、猴金属硫蛋白α亚基四聚体MT4α和两种启动子PnifH及Plac元件,分别构建两个重组质粒pTNIM和pBLIM.进一步通过三亲本杂交,将重组质粒分别导入费氏中华根瘤菌HN01,分别构建获得诱导表达型重组菌HN01(pTNIM)和组成表达型重组菌HN01(pBLIM).在培养条件下比较测定重组菌和出发菌对镉的吸附能力和耐受性,结果表明,组成表达型重组菌HN01(pBLIM)在上述两个方面的能力得到明显增强,对镉的吸附富集能力提高了2倍.研究还发现重组根瘤菌也具有很好的静态吸附效果.盆栽实验结果表明,接种诱导表达型重组菌HN01(pTNIM)的大豆根瘤和根中Cd2+的富集量均明显高于野生菌株HN01.本实验为后续探索重组根瘤菌与宿主植物共生体系在Cd2+污染土壤修复中的应用前景奠定了基础.     

基于黄单胞菌冰核蛋白N端的表面展示体系建立

为了建立一个自主、高效的细菌表面展示体系,利用野油菜黄单胞菌冰核蛋白N端结构域,将短小芽孢杆菌脂肪酶展示于大肠杆菌Rosetta 2(DE3)表面.采用细胞分级、脂肪酶活测定和His-tag In-gel stain分析等检测了重组蛋白的表达情况,并进一步检测了不同底物、温度、pH和有机溶剂对酶活稳定性的影响.结果显示融合蛋白在大肠杆菌细胞外膜成功展示,重组菌脂肪酶活为(74.6±4.5)U/g冻干细胞,展示水平为每个细胞表面19 267个脂肪酶分子;展示酶对中长链脂肪酸酯表现出较高的水解活性,最适pH为11.0,最适温度为40℃,且在40℃保温一周仍保持80%以上的酶活.本研究表明基于野油菜黄单胞菌冰核蛋白N端的展示体系是一种高效、稳定的细菌表面展示体系.     

与黑龙江大豆主栽品种匹配的优良根瘤菌筛选与鉴定

根瘤菌剂在大豆上能否充分发挥共生固氮效应涉及到根瘤菌的结瘤固氮能力、与大豆品种的匹配性、土壤特性等多种因素.黑龙江省是我国大豆的主产区之一,为筛选得到适于在黑龙江推广应用的根瘤菌资源,从黑龙江、河北和湖南等地区采集土壤样品,采用大豆结瘤法,从10个土样中分离获得59株大豆根瘤菌株,再依据BTB显色反应和16S r DNA分析,鉴定出36个慢生型大豆根瘤菌.沙培结果表明,有34株根瘤菌能够在大豆品种黑农61上有效结瘤;再从中选出4株共生效应较好的菌株做进一步实验.匹配实验表明,这4株菌SN2-5、NW5-3、SN7-2和SN10-3同样能与黑龙江另外16个主栽大豆品种结瘤;与不接根瘤菌的对照组相比,SN2-5、NW5-3、SN7-2和SN10-3处理的大豆的根瘤固氮酶活和生物量显著提高,且整体表型优于HN01和USDA110.土壤盆栽实验结果表明,NW5-3、SN10-3、SN7-2在黑土中具有显著的接种效果,且在10 mmol/L NH_4NO_3高氮处理下,4个优良供试菌均能够与黑农61结瘤.与不加氮素的处理相比,其中NW5-3和SN10-3形成根瘤具有近50%的固氮酶活性.本研究筛选的4个慢生型大豆根瘤菌SN2-5、NW5-3、SN7-2、SN10-3与黑龙江的主栽大豆品种具有良好匹配性能,可进一步用于黑龙江大豆产区的田间实验.