强化丙酮酸-CO2途径对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中辅酶NADH的有效供给影响1,3-丙二醇的产量和得率,通过在K.pneumoniae强化丙酮酸-CO2途径,以提高胞内NADH水平和1,3-丙二醇产量.将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W3 03)的甲酸脱氢酶基因fdh1和K.pneumoniae的丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl B在K.pneumoniae中过表达,强化丙酮酸-甲酸-CO2途径.结果显示,单独表达fd h1、pfl B和共表达fhd1、pfl B基因的克雷伯氏菌与出发菌株相比,胞内NADH含量明显增加,1,3-丙二醇产量分别提高了8%、12%、18%,摩尔转化率分别提高了7.3%、13.2%、19.5%,除乙酸外其他副产物都有不同程度的降低.本研究表明,强化丙酮酸-甲酸-CO2途径提高了NADH的再生效率,促进了1,3-丙二醇的合成.     

利用甘油脱水酶基因构建产3-羟基丙醛工程菌及其表达比较

3-羟基丙醛(3-HPA)是一种重要的化工产品,可由甘油经甘油脱水酶作用后生成.为获得产3-HPA基因工程菌,在已构建含甘油脱水酶基因及其激活因子大亚基质粒pEtac-dhaB-gdrA的基础上,构建了包含小亚基gdrB激活因子的重组质粒pEtac-dhaB-gdrA-gdrB.利用大肠杆菌通用tac启动子将该质粒在不同Escherichia coli BL21、DH5a及JM109中进行表达.阳性转化子经IPTG诱导后,提取总RNA,以cDNA为模板进行RT-PCR发现,目标基因在不同宿主都能较好转录.SDS-PAGE、酶活测定和3-HPA浓度测定结果表明,目标蛋白表达存在差异;酶活分别为4.7(±0.44)、3.5(±0.95)、8.1(±0.66)U/mg;发酵液中3-HPA的含量分别为0.012(±0.0044)、0.014(±0.003)、0.375(±0.018)g L-1,重组E.coli JM109/pEtac-dhaB-gdrA-gdrB具有较好的甘油脱水酶基因表达和产3-HPA性能.该基因工程菌与克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)相比,发酵副产物明显较少,有利于后期提取,为生产3-HPA提供了一条新思路.     

budC缺失对克雷伯氏菌联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的影响

在利用克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇过程中,副产物对碳流的竞争是限制产物合成的重要因素.通过将来源于大肠杆菌的醛脱氢酶基因在budC缺失型克雷伯氏菌中过表达,研究budC缺失对克雷伯氏菌联产1,3-丙二醇和3-羟基丙酸的影响.与K.pneumoniae ZG27/pUC19-aldH相比,缺失型菌株K.pneumoniae ZG40(budC?)/pUC19-aldH发酵60 h后,1,3-丙二醇和3-羟基丙酸的产量分别为64.0 mmol/L和134 mmol/L,3-羟基丙酸转化率提高了22%,副产物中除2,3-丁二醇外均有不同程度降低.本研究表明,过表达醛脱氢酶的重组克雷伯氏菌能够积累3-羟基丙酸,但在微氧发酵24 h后,1,3-丙二醇逐渐向3-羟基丙酸转化;而budC的缺失进一步促进了1,3-丙二醇向3-羟基丙酸的转化.     

促进氰钴胺素转化为腺苷钴胺素的基因表达与鉴定

辅酶B12作为甘油脱水酶(GDHt)的辅酶参与到Klebsiella pneumoniae代谢甘油生成1,3-丙二醇(1,3-PD)和3-羟基丙酸(3-HP)的途径中.前期研究表明底物甘油可以导致辅酶B12分子中Co—C键的断裂,进而引起GDHt的失活.为进一步研究非活性的维生素B12(CNCbI)转化为具有活性的辅酶B12(AdoCbI)的过程,从K.pneumoniae中克隆得到了ATP:钴(I)胺素腺苷转移酶(ACA)基因btuR和还原酶基因yciK,并成功构建了双启动子表达质粒pUC18-tac-btuR-tac-yciK,将表达质粒转化Escherichia coli JM109获得了一株重组菌.利用改进的分析方法,结果表明:1)重组蛋白具有腺苷转移酶的活性;2)重组菌可以很好地将非活性的钴胺素,如维生素B12,转化生成具有活性的辅酶B12.     

高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用

利用PCR-mediated Technique对酿酒酵母W303-1A金属硫蛋白基因(cup1)进行敲除,获得一株铜离子敏感型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A cup1△),其对Cu2+抑制浓度由1.2 mmol/L降为0.08 mmol/L;以pYX212载体为基本构架,以S.cerevisiae W303-1A cup1△为宿主菌,构建了以cup1作为筛选标记的pYX212M表达系统,并成功表达了绿色荧光蛋白基因(gfp),从而实现了高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用.本研究构建的高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统不仅廉价、安全,而且丰富了酵母的表达系统,同时对微生物的铜抗性机理及生物修复功能的研究具有指导意义.     

根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化

通过构建质粒pCAM3300-zeocin,将其电击转化到根癌农杆菌LBA4404中.将含有目的质粒pCAM3300-zeocin的根癌农杆菌和工业化产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5共培养,利用zeocin抗性基因为筛选标记,实现了pCAM3300-zeocin对产甘油假丝酵母的转化.并根据产甘油假丝酵母的生长特性,对转化条件进行了优化,在共培养时间为24h,产甘油假丝酵母和根癌农杆菌的细胞比例为1∶(500～1000)时最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞.初步建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的转化方法.     

gsh1基因的克隆及其在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase)编码基因gsh1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastorisx-33,构建了重组菌P.pastorisx-33(pGAPZA-gsh1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并通过PCR进行了验证.对阳性转化子的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶的酶活是宿主菌的3.0倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42.2mg/L,是宿主菌的1.6倍.图7表1参10     

产1,3-丙二醇新型基因工程菌的构建

以甘油为底物转化生产1,3-丙二醇的生物合成途径中,往往由于还原力NADH的不足,限制了1,3-丙二醇的合成,引起中间代谢产物3-羟基丙醛累积,进而抑制甘油脱水酶的活性,阻碍菌体的生长,严重影响1,3-丙二醇的合成途径.为了解决合成途径中还原力不足这一主要矛盾,本文以大肠杆菌和克雷伯氏菌染色体DNA为模板克隆得到yqhD和dhaB、dhaT基因,构建双启动子表达载体pEtac-dhaB-tac-yqhD及表达载体pUC-tac-dhaT,成功共转入E.coli JM109,得到可利用两种辅酶(NADH、NADPH)将片油转化为1,3-丙二醇且传代稳定的重组大肠杆菌双质粒系统,发酵结果表明,1,3-丙二醇产量提高了28.6%.图6表1参17     

产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB)的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260 U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40 g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5 g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.图6表1参18     

克雷伯氏菌产1,3-丙二醇菌株选育及甘油脱水酶基因转录分析

通过对野生克雷伯氏菌(Klebsiella)进行紫外诱变,获得一株耐高浓度甘油及高浓度1,3-丙二醇的突变菌株A-39-3,该突变株产1,3-丙二醇的量较野生菌株提高了58%,副产物2,3-丁二醇和乙醇的量分别降低了27%和19%.为探讨突变株高产1,3-丙二醇的原因,通过对突变菌株发酵过程中关键酶的酶活跟踪分析,发现1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的酶活力与野生菌株相差不大,甘油脱氢酶(GDH)的酶活力略有下降,而突变菌株的甘油脱水酶(GDHt)的酶活力明显高于野生菌株.并采用半定量RT-PCR方法,从转录水平上比较甘油脱水酶基因的差异,结果发现突变菌株A-39-3甘油脱水酶基因的相对mRNA转录水平是野生菌株K的2.58倍,分析说明该突变株1,3-丙二醇产量的提高与关键酶基因dhaB的mRNA转录水平关系密切.