浸水冷应激对雏鸡某些酶活性及消化道粘膜充血的影响

以海兰雄性雏鸡为试验对象，研究急性浸水冷应激对健康雏鸡某些酶活性消化道粘膜充血的影响。结果表明：雏鸡在浸水冷应激后血清肌酸激酶（CrK）呈一致性升高趋势；而丙氨酸氨基转肽酶（ALT）的活性则在冷应激后15min明显升高（P＞0.05），而后降低，至120min时又恢复致冷应激前水平，雏鸡血清乳酸脱氢酶（LDH）在冷应激后15－60min呈渐进性升高,而后降低；血清γ－谷氨酰转肽酶（γ－GT）的变化趋势为，在冷应激后15min稍升高，而后则逐渐下降；血清尿素氮（BUN)的变化无是,在冷应激后60min降低，浸水应激后不同时间对海兰雏鸡消化道粘膜充血的结果表明：雏鸡在浸水应激后即刻观察造成消化道充血现象并不严重；而浸水应激后不同时间却对雏鸡消化道产生相对较强的影响，特别是冷应激后1－2h胃肠道充血比较严重。     

冷应激对健康雏鸡某些内分泌活动的影响

以罗曼雄性雏鸡为试验对象,研究5d和10d龄健康雏鸡在低于正常饲养温度条件下,在一定时间内机体某些代谢激素的变化规律,结果表明：（1）5d龄雏鸡在两种低温情况下,血清三碘甲腺原氨酸（T3）变化显著,在冷应激最初几h内,T3先下降,至6h（15±1℃）和12h（10±1℃）又升高;血清四碘甲腺原氨酸（T4）变化不明显,在10±1℃情况下,在12h时显著降低;胰岛素（Ins）在两种低温情况下,均于2h时显著升高,而后呈波动性变化,（2）10d龄雏鸡在15℃±1℃条件下,T3在0．5～3h显著下降,至6h回升;T4在2h时显著升高（P＜0．05）;Ins在2h时升高（P＞0．05）,但3h时显著降低,而后又回升（3）血清皮质醇浓度均于冷应激后2h时有所升高,但差异不显著,而后呈波动性变化．     

RBM3重组慢病毒载体的构建、包装和鉴定

构建含有冷休克蛋白RNA结合基序蛋白3(RBM3)基因的慢病毒表达载体,产毒感染ST细胞,以评价重组慢病毒载体提高RBM3蛋白表达的效果.应用分子生物学技术提取仔猪脾脏组织的总RNA,通过反转录方法扩增RBM3基因,将其连入慢病毒载体Plenti6/v5-DEST中,在感受态细胞DH5α中扩增培养,并进行RBM3基因的测序鉴定,将重组的慢病毒质粒转染293T细胞,收获病毒液,感染293T细胞并提取细胞RNA,用逆转录PCR方法检测RBM3 mRNA在感染病毒的293T细胞中的表达,用含有慢病毒空载体pLenti6/V5-DEST的病毒液、含有重组慢病毒载体pLenti6/V5-RBM3的病毒液和无菌去离子水分别感染ST细胞后通过Western blot方法检测RBM3蛋白在感染病毒的ST细胞中的表达.结果表明:构建的慢病毒载体Plenti6/v5-RBM3经测序分析证实基因序列正确.包装后的慢病毒滴度为107 PFU/mL.逆转录PCR方法检测到感染病毒的293T细胞中,RBM3基因在转录水平上有表达,Western blot方法检测到感染病毒的ST细胞中,空载体组与空白对照组相比,RBM3蛋白表达量接近相同(分别为0.312±0.022和0.282±0.028);过表达组与空白对照组相比,RBM3蛋白表达量(0.568±0.045)显著增加(P0.05),RBM3蛋白在翻译水平有表达.因此,本研究构建的携带RBM3基因的重组慢病毒能够感染ST细胞,并使其RBM3蛋白表达量增加.图5参20     

不同强度冷刺激对大鼠心脏、大脑、睾丸和肺脏中CIRP表达的影响

采用Western blot和实时荧光定量RT-PCR方法,研究不同强度不同时间冷刺激后大鼠心脏、大脑、睾丸和肺脏中冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)的表达情况.结果表明:常温(20℃±1℃)下大鼠4种组织中均存在一定的CIRP的表达;急性冷刺激组(-10℃±1℃、-4℃±1℃、0℃±1℃、4℃±1℃)心脏、大脑和睾丸中CIRP mRNA表达在冷刺激0～6 h呈上升趋势,6 h时达到最高值,随后呈下降趋势,肺脏中CIRP mRNA表达在0～6 h呈下降趋势,在6 h时达到最低值,随后呈上升趋势;慢性冷应激组(10℃±1℃)大鼠心脏、大脑和睾丸3种组织中CIRP mRNA在不同时间点(1周、2周、3 W周)的表达均高于正常对照组(P>0.05),肺脏CIRP mRNA表达均低于对照组(P>0.05),并且同一组织不同时间点之间差异不显著(P>0.05).可见冷刺激后CIRP的表达存在一定规律并且表现出组织特异性,可能与组织保护特异性有关.     

冷应激对断乳仔猪ACTH及皮质醇的影响

断乳仔猪在-3~3℃低温条件下冷暴露24h,然后在15~18℃室温条件下恢复,检测血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇的动态变化.结果表明,仔猪血浆中ACTH和皮质醇含量随冷暴露时间延长而逐渐升高,冷应激6h时,ACTH含量高于冷应激前的水平(P<0.05);冷应激12h时,ACTH和皮质醇含量与冷应激前比较均有极显著升高(P<0.01);冷应激24h时,两激素含量与冷应激前无显著差异.终止冷暴露后0.5h,ACTH和皮质醇含量均高于冷应激前水平(P<0.05,P<0.01);3h时两激素水平基本恢复正常,但6h时两激素水平再次升高(P<0.01),呈波动性变化.表1参10     

温度对中国荷斯坦奶牛血液某些生化指标的影响

以健康荷斯坦黑白花奶牛为试验对象，研究了不同环境温度（θ/℃5，10，15，20，25）对奶牛血清各项生化指标的影响。研究结果表明，肌酸激酶（CK）在血清中的活性随着温度的上升呈波动性下降趋势，特别是在25℃时显著低于其他温度组；乳酸脱氢酶（LDH）在血清中的活性随着温度渐升而呈下降趋势，特别是在15℃以后大幅度下降；γ－谷氨酰转肽酶（γ－GT）的活性从5℃至20℃呈逐渐升高的趋势，而在25℃又回降至5℃水平；天门立氨酸氨基转移酶（AST）在血清中的活性随温度渐升而渐进性升高，特别是在25℃时显著高于5℃时的水平；碱性磷酸酶（ALP）在血清中的活性也是随温度渐升而渐进性升高，但在25℃时下降明显；丙氨酸氨基转移酶（ALT）在血清中的活性随温度上升而呈下降趋势，且下降幅度比较平稳；尿素氮（BUN）在血清中的含量随温度上升而渐进性升高，变化趋势平稳。血清白蛋白（TP）呈波动性变化。无明显规律性。本实验结果说明，北方高寒地区奶牛血清中的某些生化指标可随着环境温变的变化而变化。表2参7     

BALB／C鼠睾丸组织中冷诱导RNA结合蛋白的cDNA克隆与序列分析

冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)在多种冷应激细胞(包括重组中国仓鼠卵巢细胞)中被发现.迄今为止,冷应激对活体生物基凶表达的影响还未见报道.和细胞相比,生物体具有更加复杂的冷应激调节机制.本研究以冷处理的BALB/C鼠为实验动物,从其睾丸组织巾克隆出了CIRP的cDNA.结果表明,CIRP在生物体中能够被低温诱导,可能防止生物体遭受冷损伤.根据克隆的cDNA所推测的氨基酸序列与GenBank上公布的小鼠、大鼠、人类、牛蛙、美西螈、非洲爪蟾胚胎细胞和卵母细胞的CIRP氨基酸序列同源性分别为100%、99.40%、95.5%、67.4%、58.4%、76.9%和79.1%.这表明CIRP在生物进化过程中是高度保守的,可能具有多种生理功能.因此,这一研究将为探索人类和动物冷应激分子机制创立系统试验模型和奠定新的实践基础.图5参14     

重组BALB/C鼠冷诱导RNA结合蛋白CIRP多克隆抗体的制备与鉴定

冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)是第一种在哺乳动物细胞中被发现的冷休克蛋白,伴随着细胞冷应激过程过量表达.为进一步研究冷诱导RNA结合蛋白CIRP的生物学功能,构建重组BALB/C鼠CIRP的原核表达载体,重组BALB/C鼠CIRP蛋白经NI-NTA亲和树脂纯化后免疫獭兔制备抗CIRP多克隆抗体,以间接ELISA和Western blot检测抗体效价和抗原特异性.本实验成功构建了CIRP的原核表达载体,在E coli XL-1-blue得到了高效表达,利用原核表达包涵体蛋白免疫獭兔获得了高效价的CIRP多克隆抗体,该抗体能识别肝脏和睾丸中天然的CIRP蛋白.图5参14     

不同强度冷应激对大鼠肌肉、脾脏和肝脏中HSP70表达的影响

通过两个低温温度段对健康Wistar大鼠进行冷应激试验,利用免疫印迹技术检验肌肉、脾脏和肝脏中HSP70表达的相对变化情况,探讨不同时间和强度冷应激条件下,3种组织中HSP70表达的情况以及通过HSP70表达量的变化看是否可以将其作为评估冷应激的指标.正常饲养的大鼠环境温度为(20±1)℃,而实验组大鼠分别在(0±1)℃和(10±1)℃环境下进行低温冷应激,然后在冷应激后不同时间宰杀取组织,利用Western-blotting检测HSP70的表达量.结果表明:(1)在(0±1)℃急性冷应激条件下,随着冷应激时间的延长,肌肉和脾脏中HSP70的表达持续增加,与对照组(CK)相比,差异显著(P<0.05);(2)在(10±1)℃慢性冷应激条件下,仅1wk肌肉组中HSP70的表达增加(P<0.05),其它情况下各组织中HSP70的表达与CK相比无显著差异(P>0.05).上述结果说明,相应强度的冷应激可以诱导机体的HSP70表达,并且随时间延长,HSP70的表达增加,可以考虑将HSP70作为监测大鼠应激的指标.图1表2参14     

急性冷暴露对仔猪血浆中IL-2、IL-6、ACTH和皮质醇水平的影响

为了探讨急性冷应激对仔猪免疫系统的影响,本试验将18头45 d"约克夏"仔猪随机分成常温对照组(Control,C)、冷暴露组(Cold exposure,CE)和冷暴露并阻断糖皮质激素受体组(Cold exposure+RU486,CER).常温组在18～20 ℃、冷暴露各组在4～8℃环境下分栏饲养.冷暴露时间持续12 h,在冷暴露开始后的第0、1、3、6、9、12 h六个时间点对18头仔猪采血并分离血浆,分别使用双抗体夹心ELISA法检测各血浆样品的IL-2和IL-6水平,放射免疫分析法测定血浆样品的ACTH和皮质醇水平.结果显示:单纯冷暴露组IL-2水平和IL-6水平在冷暴露6 h时明显升高(P<0.01),ACTH水平在各时间点均明显降低(P<0.01),而Cortisol水平仅在冷暴露3 h时明显升高(P<0.01),IL-2与IL-6的水平呈强相关(r=0.959 5),ACTH与IL-2的水平呈巾等强度负相关(r=-0.435 9)、与IL-6的水平呈弱的负相关,皮质醇与IL-2的水平呈弱的负相关、与IL-6的水平呈中等强度负相关(r=-0.447 8);受体阻断组IL-2在冷暴露6h、9 h和12 h时均明显升高(P<0.01),IL-6在冷暴露6 h明显升高(P<0.01),ACTH在冷暴露各时间点均明显降低(P<0.01),IL-2和IL-6水平呈中等相关(r=0.416 1),ACTH与IL-2、IL-6的水平均呈强负相关(r=-0.676 5/-0.717 4),皮质醇与IL-2、IL-6均呈弱负相关.上述结果表明,急性冷暴露能使IL-2、IL-6及皮质醇的分泌增强,且阻断糖皮质激素受体会导致IL-2和IL-6之间以及ACTH与IL-2/IL-6之间的相关性改变.图1参21