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克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中辅酶NADH的有效供给影响1,3-丙二醇的产量和得率,通过在K.pneumoniae强化丙酮酸-CO2途径,以提高胞内NADH水平和1,3-丙二醇产量.将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W3 03)的甲酸脱氢酶基因fdh1和K.pneumoniae的丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl B在K.pneumoniae中过表达,强化丙酮酸-甲酸-CO2途径.结果显示,单独表达fd h1、pfl B和共表达fhd1、pfl B基因的克雷伯氏菌与出发菌株相比,胞内NADH含量明显增加,1,3-丙二醇产量分别提高了8%、12%、18%,摩尔转化率分别提高了7.3%、13.2%、19.5%,除乙酸外其他副产物都有不同程度的降低.本研究表明,强化丙酮酸-甲酸-CO2途径提高了NADH的再生效率,促进了1,3-丙二醇的合成. 相似文献
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辅酶B12作为甘油脱水酶(GDHt)的辅酶参与到Klebsiella pneumoniae代谢甘油生成1,3-丙二醇(1,3-PD)和3-羟基丙酸(3-HP)的途径中.前期研究表明底物甘油可以导致辅酶B12分子中Co—C键的断裂,进而引起GDHt的失活.为进一步研究非活性的维生素B12(CNCbI)转化为具有活性的辅酶B12(AdoCbI)的过程,从K.pneumoniae中克隆得到了ATP:钴(I)胺素腺苷转移酶(ACA)基因btuR和还原酶基因yciK,并成功构建了双启动子表达质粒pUC18-tac-btuR-tac-yciK,将表达质粒转化Escherichia coli JM109获得了一株重组菌.利用改进的分析方法,结果表明:1)重组蛋白具有腺苷转移酶的活性;2)重组菌可以很好地将非活性的钴胺素,如维生素B12,转化生成具有活性的辅酶B12. 相似文献
3.
3-羟基丙醛(3-HPA)是一种重要的化工产品,可由甘油经甘油脱水酶作用后生成.为获得产3-HPA基因工程菌,在已构建含甘油脱水酶基因及其激活因子大亚基质粒pEtac-dhaB-gdrA的基础上,构建了包含小亚基gdrB激活因子的重组质粒pEtac-dhaB-gdrA-gdrB.利用大肠杆菌通用tac启动子将该质粒在不同Escherichia coli BL21、DH5a及JM109中进行表达.阳性转化子经IPTG诱导后,提取总RNA,以cDNA为模板进行RT-PCR发现,目标基因在不同宿主都能较好转录.SDS-PAGE、酶活测定和3-HPA浓度测定结果表明,目标蛋白表达存在差异;酶活分别为4.7(±0.44)、3.5(±0.95)、8.1(±0.66)U/mg;发酵液中3-HPA的含量分别为0.012(±0.0044)、0.014(±0.003)、0.375(±0.018)g L-1,重组E.coli JM109/pEtac-dhaB-gdrA-gdrB具有较好的甘油脱水酶基因表达和产3-HPA性能.该基因工程菌与克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)相比,发酵副产物明显较少,有利于后期提取,为生产3-HPA提供了一条新思路. 相似文献
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利用PCR-mediated Technique对酿酒酵母W303-1A金属硫蛋白基因(cup1)进行敲除,获得一株铜离子敏感型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A cup1△),其对Cu2+抑制浓度由1.2 mmol/L降为0.08 mmol/L;以pYX212载体为基本构架,以S.cerevisiae W303-1A cup1△为宿主菌,构建了以cup1作为筛选标记的pYX212M表达系统,并成功表达了绿色荧光蛋白基因(gfp),从而实现了高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用.本研究构建的高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统不仅廉价、安全,而且丰富了酵母的表达系统,同时对微生物的铜抗性机理及生物修复功能的研究具有指导意义. 相似文献
5.
用温度敏感型菌株发酵生产L-谷氨酸不存在生物素亚适量问题,因此该方法在国际上被广泛使用.通常采用对出发菌株进行传统诱变的方法获得温度敏感型菌株.以谷氨酸棒杆菌CICC 10226为出发菌株,先克隆其ItsA基因,然后通过基因敲除的方法构建了突变菌株Corynebacterium glutamicum WT ΔL,该菌株同时具有温度敏感性和溶菌酶敏感性.经透射式电子显微镜观察发现,于38℃培养的突变株细胞与在30℃培养的同一种细胞相比,细胞明显增大,而出发菌株无该现象.发酵试验表明,在生物素过量的情况下,在发酵进入细胞产酸期后通过将发酵温度从原来的30℃提高到38℃,温度敏感突变株的产酸量增加近5倍.如果在发酵培养基巾添加适量的琥珀酸和乙酸,该菌株与不添加的在30℃培养的对照相比,产酸量增加近6.5倍.对于野生型出发菌株而言,在生物素过量的情况下,无论是否采用变温发酵方法都几乎不产酸.说明温度敏感突变株即使在生物素过量的情况下也能通过变温发酵诱导其合成并分泌产生L-谷氨酸.图10表1参13 相似文献
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Fenton试剂法预处理发酵甘油生产提取废水 总被引:1,自引:0,他引:1
采用Fenton试剂预处理高浓度难降解发酵法甘油生产提取废水。研究了pH、Fe2 + 、H2 O2 、反应时间和H2 O2 投加次数对废水COD去除效果的影响。结果表明 ,通过Fenton试剂氧化可使废水中的COD值从 135 0 0mg/L降至 4 0 30mg/L ,COD去除率达到 70 1%。废水的BOD5/COD值从 0 2 0 2提高至 0 5 6 8,可生化性得到较大提高 ,为后续处理创造了条件。研究成果为发酵法甘油生产提取废水的预处理提供了一种非常有效的方法。 相似文献
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碱性果胶酯裂解酶基因工程菌Pichia pastoris诱导表达条件初步优化 总被引:2,自引:0,他引:2
在摇瓶水平上,采用单因素试验方法,对影响碱性果胶酯基因工程菌Pichia pastoris表达的主要因素进行研究.确定初始甲醇浓度、甲醇补加量和氮源酵母氮基(YNB)浓度3个主要影响因素的初步优化结果为5%、O.8%和1.3%.在此基础上,利用响应面分析法进一步优化.经优化,表达条件为初始甲醇浓度4.35%、甲醇补加量0.75%1:2及YNB浓度1.31%,优化后碱性果胶酯裂解酶(PL)表达量达到40.6 U/mL,较初始培养条件提高约2.3倍.同时,利用SDS-PAGE电泳对优化前后基因工程菌表达情况进行分析,结果同样表明胞外FI标蛋白PL表达量有明显增加,进一步证实条件优化后对目标蛋白PL分泌表达具有十分明显的促进作用. 相似文献
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嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因perA在大肠杆菌中的高效表达 总被引:5,自引:0,他引:5
利用PCR技术得到嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillusstearothermophilus)过氧化氢酶基因 perA ,将该基因与表达载体 pKK2 2 3 3连接构建重组质粒pK perA ,转化大肠杆菌过氧化氢酶HPⅠ和HPⅡ双缺突变株UM 2 ,得到重组大肠杆菌UM 2 1.酶活测定结果表明 ,表达产物具有正常的生物学活性 .SDS PAGE电泳结果显示出明显的特异性表达条带 ,单体Mr =86× 10 3 ,与嗜热脂肪芽孢杆菌所产酶相同 .实验表明 ,重组质粒在宿主UM 2中有较好的稳定性 ,在无选择压力条件下传代 6 0次基本保持稳定 ,传代 10 0次重组质粒保留 80 %以上 .摇瓶实验确定重组菌的最佳表达条件为 :IPTG浓度 ,0 .75mmol/L ;诱导时间 3h ;培养基起始 pH 6 .5 ;诱导温度 37℃ ;装液量 5 0mL/ 2 5 0mL .在优化条件下 ,重组菌产生的过氧化氢酶占菌体总蛋白的 8% ,酶活力可达 35U/mL ,是原始菌株BacillusstearothermophilusIAM110 0 1的 11.7倍 .图 2表 1参 10 相似文献
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产1,3-丙二醇新型基因工程菌的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
以甘油为底物转化生产1,3-丙二醇的生物合成途径中,往往由于还原力NADH的不足,限制了1,3-丙二醇的合成,引起中间代谢产物3-羟基丙醛累积,进而抑制甘油脱水酶的活性,阻碍菌体的生长,严重影响1,3-丙二醇的合成途径.为了解决合成途径中还原力不足这一主要矛盾,本文以大肠杆菌和克雷伯氏菌染色体DNA为模板克隆得到yqhD和dhaB、dhaT基因,构建双启动子表达载体pEtac-dhaB-tac-yqhD及表达载体pUC-tac-dhaT,成功共转入E.coli JM109,得到可利用两种辅酶(NADH、NADPH)将片油转化为1,3-丙二醇且传代稳定的重组大肠杆菌双质粒系统,发酵结果表明,1,3-丙二醇产量提高了28.6%.图6表1参17 相似文献
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1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260 U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40 g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5 g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.图6表1参18 相似文献