猪精液酸性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的纯化及性质水

以杜洛克猪精液为材料,采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-32阴离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛柱层析纯化,获得纯化倍数为27.64、比活力为1 773.25 U mg~(-1)的酸性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶纯酶制剂.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定,纯酶两种亚基相对分子质量分别为129.13×10~3和62.24×10~3.对其酶学性质的研究结果表明,酶的等电点为5.10,最适pH值为5.5,最适温度为60℃.酶在pH 3.6~9.2、温度10℃～55 ℃的范围内较稳定.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨罐葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,测得米氏常数K_m为0.455 mmol L~(-1),最大反应速度V_m为17.34μmol L~(-1)min~(-1),活化能为41.70 kJ mol~(-1).图8表1参15     

Zn2+对棉铃虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力与性质的影响

以棉铃虫蛹为材料,经分离纯化获得棉铃虫N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶制剂;研究了Zn2 对棉铃虫N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.14)活力与性质的影响.结果表明,Zn2 对酶活力有抑制作用,酶活力丧失一半的Zn2 浓度(IC50)为1.3mmol/L.进一步研究Zn2 的抑制作用动力学,发现Zn2 对该酶的抑制作用是一种可逆过程,抑制机理表现为竞争型,抑制常数KI为1.158mmol/L.Zn2 不会影响酶的酸碱稳定性,但有Zn2 存在时,在30～40范围内,酶是稳定的,温度高于50℃后,随着Zn2 浓度的增加,酶的温度稳定性也相对增加.图5参10     

Hg2+和Pb2+对中国鲎N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

节肢动物蜕皮与N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)密切相关。为了探究Hg~(2+)和Pb~(2+)这2种重金属离子对节肢动物NAGase的影响,以中国鲎(Tachypleus tridentatus)为材料,从其内脏分离提取了NAGase。利用酶促反应动力学方法,研究Hg~(2+)和Pb~(2+)对中国鲎NAGase的影响;通过对酶荧光发射光谱的测定,研究NAGase酶蛋白经Hg~(2+)和Pb~(2+)作用后的空间构象变化。结果表明,Hg~(2+)和Pb~(2+)对中国鲎NAGase均有较强的抑制作用,Hg~(2+)对NAGase的抑制作用强于Pb~(2+),Hg~(2+)和Pb~(2+)对NAGase的抑制作用均表现为可逆过程,其中Hg~(2+)对NAGase的抑制属于竞争性抑制作用,抑制常数KI为22.68μmol·L~(-1),Hg~(2+)只与游离酶结合,不与酶-底物络合物结合;而Pb~(2+)对NAGase的抑制是属于竞争性-非竞争性混合型抑制作用,抑制常数KI和KIS分别为19.13 mmol·L~(-1)和75.23 mmol·L~(-1),Pb~(2+)与游离酶的亲和力相比与酶-底物络合物的亲和力更强。NAGase经Hg~(2+)和Pb~(2+)作用后荧光发射强度均降低,但荧光发射峰值并没有发生位移,说明Hg~(2+)和Pb~(2+)对中国鲎NAGase的抑制作用均为酶蛋白空间构象的变化所致。这证明了Hg~(2+)和Pb~(2+)对中国鲎NAGase活力具调控作用。     

利用N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶含量评价农药对花翅摇蚊种群发育的影响

为了进一步探索种群水平的生态风险评估方法,本文利用β-N-Acetyl-D-glucosaminidase(NAGase)的变化量来监测农药对摇蚊种群发育的影响。从花翅摇蚊Chironomus kiiensis体内分离纯化得到电泳纯的NAGase,并通过免疫大白兔制得NAGase的多克隆抗体。运用间接非竞争ELISA法检测抗体特异性,结果表明其与共同存在于水体的一些生物的NAGase的交叉反应率为隆线溞4.41%、老年低额溞3.12%、多刺裸腹溞3.40%、中华薄壳介4.17%、日本沼虾3.23%、白纹伊蚊7.50%、小球藻0.5%。运用抗体测得毒死蜱、氰戊菊酯和阿维菌素3种杀虫剂对于摇蚊NAGase释放量的12 d-EC50分别为1.2012、0.0043和0.6281μg·L-1,以NAGase活力作为测试终点,测得相应的12 d-EC50:1.4765、0.0051和0.6756μg·L-1,两者差异不显著,但均显著低于以死亡作为测试终点的12 d-LC50:4.8171、0.0954和2.1340μg·L-1,且毒力大小均为氰戊菊酯阿维菌素毒死蜱。上述结果表明,利用NAGase多克隆抗体可以特异性地检测农药对花翅摇蚊种群发育的影响。     

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶初步纯化及部分性质

以日本沼虾内脏为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32离子交换柱层析和SephadexG-100分子筛柱层析纯化,获得比活力为3000Umg-1、纯化倍数为8.88倍的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂(NAGase).以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学,结果表明,酶的最适pH为6.0,最适温度为53℃.该酶在pH4.5~9.3区域较稳定,当pH>9.3很快失活;在50℃以下处理30min,酶活力保持稳定,高于50℃,酶稳定性较差,75℃酶完全失活.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.165mmolL-1,最大反应速度Vm为6.55μmolL-1min-1.酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为63.55kJmol-1.图5表1参16     

4种重金属离子对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)NAGase活力的影响

研究了Ag+、Pb2+、Zn2+、Hg2+等重金属离子对克氏原螯虾(Procambarus clarkia)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响,结果表明:4种重金属离子对酶活力均有不同程度的可逆抑制作用,其中Hg2+、Zn2+对酶的抑制作用较强,表现为反竞争性抑制,对结合酶(ES)的抑制常数KIS分别为0.07 mmol/L和22.04 mmol/L;而Ag+、Pb2+对酶有先激活后抑制的作用,其中Ag+对酶的抑制作用类型表现为反竞争性抑制,其抑制常数KI为1.08 mmol/L,Pb2+对酶的抑制作用类型表现为非竞争性抑制,其抑制常数KI为26.17 mmol/L.     

中华绒螯蟹幼蟹蜕壳期间池塘水环境的变化特征

为探究中华绒螯蟹幼蟹蜕壳期间池塘水环境的变化特征,于2018年5月7日至10月13日,对上海松江泖港地区幼蟹生态养殖池塘和水源进行水质监测.结果表明,大眼幼体经160 d养殖,蜕壳11次成长为幼蟹,T均值为27.0±2.9℃,总有效积温为3085.3℃·d;随蜕壳次数增加,有效积温增长趋势贴近指数函数y=42.166e~(0.2644)~x,R~2=0.9629;累计有效积温增长趋势贴近二次函数y=33.059x~2-98.244x+160.05,R~2=0.9992.幼蟹池溶解氧(DO)在养殖前期优于水源,NH~+_4-N、NO~-_2-N、NO~-_3-N总体优于水源,PO_4~(3-)-P在高温季节优于水源,COD_(Mn)在整个养殖阶段均较水源差.除TN、TP、COD_(Mn)有不同程度超标外,幼蟹池和水源其它水质因子基本符合渔业水质标准和地表水环境质量标准的Ⅲ级标准.     

溴氰菊酯对中华绒螯蟹的毒性作用和组织病理研究

为探讨溴氰菊酯对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的毒性影响,采用换水式渔药毒性试验的方法进行了溴氰菊酯对河蟹急性毒性实验和慢性毒性作用下组织病理的研究。结果表明：溴氰菊酯对河蟹24 h、48 h、72 h和96 h半致死浓度(LC50)分别为2.127 μg·L-1、1.380 μg·L-1、1.153 μg·L-1和0.905 μg·L-1,安全浓度(SC)为0.0905 μg·L-1,溴氰菊酯对河蟹的毒性为剧毒;河蟹在溴氰菊酯浓度为0.005~0.32 μg·L-1的慢性毒性作用下,分别于第7、14和21天进行鳃、肝胰腺、心脏、肠、肌肉组织和神经团的组织病理观察,鳃出现鳃小叶水肿、渗出物增加、萎缩到鳃腔闭合出现细胞坏死,肝胰腺的部分肝胰腺管中肝胰腺细胞空泡变性、坏死和肝胰腺管基膜崩解,心脏出现水肿,部分心肌纤维横纹模糊和消失到局部心肌纤维坏死,肠黏膜层柱状上皮细胞从空泡变性、部分坏死到较多上皮细胞坏死崩解脱落入肠腔,肌肉组织和神经团无组织病理变化现象。最早出现不可逆的坏死组织病理变化是在第14天的0.005 μg·L-1浓度组,肝胰腺细胞坏死,此时即使去除溴氰菊酯的毒性作用,坏死已不能恢复。通过与河蟹水瘪子病组织病理的比较分析,溴氰菊酯毒性作用下的河蟹具有独特的组织病理变化特点。     

氨氮对中华绒螯蟹仔蟹肝组织RNA/DNA及肝细胞结构的影响

以中华绒螯蟹（Eriocheir sinesis）仔蟹为研究对象。采用静水试验法,温度在20℃左右,用氨氮与过滤海水分设5个质量浓度组（2.04、6.35、9.04、11.75和19.13 mg.L-1）,同时以过滤海水为对照组（氨氮质量浓度为0.30 mg.L-1）,每一个质量浓度组设3个平行样本,对中华绒螯蟹仔蟹进行6 d胁迫试验。每2 d观察仔蟹的蜕壳情况,并分别于实验后的2、4和6 d取仔蟹肝组织样,应用激光共聚焦技术分析测定RNA/DNA荧光相素比,同时用透射电镜观察6 d后,最高浓度组和对照组仔蟹肝细胞结构的变化情况。试验结果表明;对于氨氮的胁迫,仔蟹的变态率随染毒浓度的增高而降低,同时变态蜕壳的时间也会产生延迟现象。氨氮的胁迫会引起仔蟹的肝组织细胞内的DNA和RNA的质量分数逐渐降低,导致RNA/DNA比率的不断下降。在高质量浓度氨氮的胁迫下,使得仔蟹肝细胞线粒体部分解体、胞质空泡化和染色质浓缩、转运泡数量增多,体积增大,细胞出现许多空泡和微绒毛消失等一系列的损伤变化。破坏了仔蟹自身机能正常的代谢和生长水平。     

中华绒螯蟹感染类立克次氏体微生物的研究

对“颤抖病”中华绒螯蟹病蟹病理组织超显微结构观察表明，在病蟹鳃上皮细胞、肝胰腺细胞及血淋巴细胞中存在大量类立克次氏体(rickettsia—1ike organism，RLO)微生物．RLO主要以包含体形式存在于寄主细胞的细胞质中，同时也能散在或群居状存在于包含体外的细胞质内．RLO细胞形态主要有两类，即初级体细胞型和中间体细胞型．初级体RLO表现为体积较小、电子密度深染的球状颗粒．中间体RLO呈现球状、椭圆体及棒状等多种细胞形态．中间体RLO能以二分裂和出芽两种方式繁殖．人工感染实验表明，RLO能通过水体经鳃感染健康蟹，使其表现颤抖病症状．血淋巴细胞中RL0的存在及电镜对不同发病时期病蟹组织的观察结果说明，RLO能够依靠血淋巴循环迅速从最初感染的鳃组织向肝胰腺扩散，形成系统感染，导致器官组织细胞机能紊乱．图版2参24     

阿维菌素对中华绒螯蟹肝胰腺氧化胁迫效应和组织结构的影响

采用半静态染毒法,研究不同浓度(1.6、8.0、16.0μg·L-1)阿维菌素在胁迫中华绒螯蟹12、24、48、96 h时肝胰腺超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)积累量等氧化胁迫相关指标的变化;并在胁迫60 d时,记录各实验组和对照组中华绒螯蟹肝胰腺颜色的变化并进行组织病理观察。3个阿维菌素浓度组为实验组,空白组和溶剂组为对照组。结果表明在整个实验过程中空白组和溶剂组各个时间点各项指标之间无显著差异(P>0.05);低浓度(1.6μg·L-1)组SOD和CAT活力变化不显著(P>0.05);中浓度(8.0μg·L-1)组SOD和CAT活力变化趋势一致,持续被诱导,SOD活力在24 h以后显著高于空白组(P<0.01),CAT活力在48 h以后显著高于空白组(P<0.01);高浓度(16.0μg·L-1)组SOD和CAT活力在12 h~24 h之间变化趋势一致,表现为显著升高(P<0.05),但是在48 h之后,SOD活力显著下降(P<0.05);96 h时,高浓度组SOD活力显著低于空白组(P<0.01),而CAT活力显著高于空白组(P<0.01);在整个实验过程中各实验组MDA积累量逐渐增加,高浓度组氧化胁迫指标的变化幅度大于低浓度组。胁迫60 d时,取样观察可见对照组中华绒螯蟹肝胰腺正常,各实验组中华绒螯蟹肝胰腺发生了不同程度的病变,肝胰腺颜色由最开始的橘黄色变成了淡黄色、黄白色甚至白色,高、中、低各浓度组肝胰腺白化所占的比例分别是66.6%、57.1%和25.0%。组织病理分析显示,淡黄色肝胰腺的病理变化主要是B细胞数量减少,肝胰腺上皮细胞部分肿大并出现空泡;黄白肝病理观察可见肝胰腺上皮细胞中空泡数量增多,体积增大,且空泡内出现内容物,细胞核固缩;白肝的病理表现主要是基膜增厚,上皮细胞大量脱落,散落在管腔中,空泡数量进一步增多,肝胰腺的生理功能受损。由此得出,阿维菌素会对中华绒螯蟹肝胰腺造成氧化胁迫和组织损伤,且阿维菌素和对肝胰腺的氧化胁迫效应和组织结构损伤程度有一定的剂量-效应关系。     

不同温度胁迫方式对中华绒螯蟹免疫化学指标的影响

为研究温度骤变在水生动物病害发生中的可能作用，本研究以中华绒螯蟹为材料，将环境温度从20℃突然升高或下降，然后在不同时间取样分析，从免疫学的角度探讨了不同的温度改变方式对中华绒螯蟹抗氧化能力的影响．研究结果表明，（1）在2h内将饲养水温从20℃升至32℃，然后在30min内降至20℃，中华绒螯蟹的血细胞密度（DHC）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力先升高后下降，6h时出现峰值，3d后趋于稳定，丙二醛（MDA）的含量变化则呈相反趋势；（2）在24h内将饲养水温从20℃降至8℃，其DHC随时间的延长而逐渐降低，SOD和CAT先增加后下降，在d1出现峰值；而MDA的含量先下降后升高，在d3出现峰值，但总的来说，MDA的含量均高于0h处理组；（3）在24h内水温从20℃升至32℃，其SOD和CAT在温度变化6h后呈升高趋势，而后逐渐下降，DHC的变化无一定规律，但均明显低于0h处理组，MDA的含量随时间延长而增加．以上结果表明，温度胁迫使中华绒螯蟹机体抗氧化能力下降，从而导致机体的氧化代谢失衡和免疫防御能力下降．     

果糖对莆田黑猪精液中NAGase的抑制动力学

为了解精液中不同类型糖类物质对精子细胞中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)的影响,以莆田黑猪精液NAGase为材料,研究精液和精液稀释液主要成分之一果糖对酶的抑制作用.结果显示,果糖对NAGase具有浓度效应(IC50=575 mmol L-1).果糖对NAGase的抑制类型是可逆的非竞争性抑制,抑制常数是1.27×10-2 mmol L-1.应用底物反应的动力学方法研究果糖对该酶的抑制动力学,建立了抑制动力学模型,证明了果糖对该酶的影响是快速结合再缓慢失活的过程.本研究表明,在高浓度的抑制剂溶液中NAGase将完全失活,底物对其无保护作用.     

水体Hg~(2+)对中华绒螯蟹肝胰腺和血淋巴酶活性的影响

以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)作为暴露生物,检测了水体Hg2+对中华绒螯蟹肝胰腺、血淋巴谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性的影响。结果表明,肝胰腺中GPT和GOT活性随水体中Hg2+浓度(0.01～0.30mg·L-1)升高而降低;中华绒螯蟹血淋巴中GPT和GOT活性变化趋于分化,0～0.05mg·L-1暴露组,随Hg2+浓度升高血淋巴GPT活性迅速上升,0.10～0.30mg·L-1暴露组,随Hg2+浓度升高血淋巴GPT活性迅速下降;GOT活性随着水体Hg2+暴露浓度的升高则持续上升,表现出"剂量-效应"正相关;两种组织中AKP和ACP活性随暴露浓度的升高都表现出"低-高-低"的变化趋势,并且最高值均出现在0.05mg·L-1的Hg2+处理组。4种酶活性对水环境中Hg2+反应灵敏,可作为中华绒螯蟹毒理学评价指标以及重金属监测指标。     

亚硝酸盐急性胁迫对中华绒螯蟹幼体相关免疫指标和应激蛋白(HSP70)表达的影响

为探讨亚硝酸盐急性胁迫对中华绒螯蟹机体免疫力的影响,以及机体在胁迫过程中的应对策略,分别测定了幼蟹(平均体重3.25 g)在10、20、30、40 mg L-1亚硝酸盐暴露组和对照组中血细胞总数(Total hemocyte counts,THC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活力、丙二醛(Malodiadehyde,MDA)含量以及热休克蛋白70(Heatstress protein 70,HSP70)表达量在受胁迫2 d内的动态变化.结果表明:1)低浓度亚硝酸盐(10 mg L-1)胁迫组THC在胁迫3 h时显著高于对照组,肝胰腺中SOD活性在胁迫3 h和6 h时亦显著提高,表现出一定的"毒物兴奋效应".2)但随着暴露时间的延长和亚硝酸盐浓度的升高,幼蟹THC减少,肝胰腺SOD活性下降,而MDA含量升高.3)对照组中有少量的HSP70表达.幼蟹经10、20 mg L-1亚硝酸盐处理后,鳃组织中HSP70表达量在胁迫6 h后达到最大,而经30、40 mg L-1亚硝酸盐处理后,HSP70表达量在胁迫3 h后达到最大.各浓度组所诱导的HSP70最大表达量与水中亚硝酸盐的浓度呈正相关.以上结果说明亚硝酸盐胁迫可通过加剧组织中脂质过氧化的方式导致机体免疫力下降,肝胰腺中MDA的含量变化可作为亚硝酸盐胁迫的有效评价指标之一,而HSP70表达量的变化可作为早期预警指标应用于亚硝酸盐胁迫评价中.图2表1参36     

强氯精对尼罗罗非鱼精巢N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的失活动力学(英文)

强氯精是水产养殖过程中普遍使用的消毒剂,为了解强氯精能够杀菌却不会对养殖水产动物尤其是其繁殖功能产生危害的有效浓度,以分离自尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)精巢的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)为材料,利用底物反应的动力学方法探讨强氯精对该酶的失活动力学.结果显示该酶在强氯精溶液中是一个可逆的反竞争型的失活过程,其对酶抑制的IC50为(0.25±0.02)mg/m L;而且强氯精能降低该酶的热稳定性和p H稳定性;通过建立失活模型,计算得知正向和逆向微观失活速度常数k′+0和k′-0值分别为3.84×10~(-3)/s和8.37×10~(-4)/s.本研究结果可为评价强氯精对罗非鱼繁殖功能的影响提供理论依据.     

镉离子对尼罗罗非鱼精巢N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的失活动力学（英文）

镉离子污染对水生生物的繁殖造成了不利影响,N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)被认为参与了动物的受精过程.为了解镉离子对罗非鱼繁殖的影响,以尼罗罗非鱼精巢分离获得的NAGase酶为研究对象,采用底物反应动力学方法,建立镉离子对NAGase酶的失活模型,探究镉离子对该酶活性的影响.结果显示,镉离子对NAGase表现出了可逆的抑制,对NAGase抑制的IC_(50)为40.95 mmol/L.镉离子对NAGase的抑制机理为竞争型抑制,抑制常数KI为17.13mmol/L,同时测定了微观失活速度常数.本研究表明镉离子对NAGase的抑制类型为竞争型的可逆抑制,结果可为后期研究镉离子对罗非鱼繁殖性能的研究提供理论基础.     

海栖热袍菌耐高温β-甘露糖苷酶基因的克隆及表达

以海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8基因组DNA为模板,克隆得到β-甘露糖苷酶基因(man2).测序分析表明,该基因全序列为2358bp,编码785个氨基酸,分子量约为92×103.根据蛋白质氨基酸的同源性分析,该β-甘露糖苷酶与新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)Man2(accession No.AAK52304.1)的同源性最大,达到80%.将此基因连接至表达载体pET-28a( )并转化到大肠杆菌BL21细胞中,经IPTG诱导,β-甘露糖苷酶活力达5.96U/mL.粗酶的温度稳定性分析表明,该酶的热稳定性好,90℃处理10min,活力回收率65%,具有重要的工业应用前景.图3表1参17