穿龙薯蓣、黄山药和盾叶薯蓣psbA-trnH片段序列分析

为研究薯蓣叶绿体psbA-trnH片段遗传多样性,探讨该片段用于中药穿龙薯蓣、黄山药和盾叶薯蓣种间分子鉴别和系统学研究中的意义,我们对不同类群薯蓣种的叶绿体psbA-trnH基因间区进行PCR扩增并测序,获得了该区间的完整序列,所得序列用软件MEGA3.0进行相关分析.穿龙薯蓣的psbA-trnH片段全长274bp,黄山药全长279bp,盾叶薯蓣植物个体内的叶绿体DNA则有两种psbA-trnH片段,长度分别为241bp和503bp.经MEGA3.0软件分析,3种薯蓣种间psbA-trnH片段序列的遗传距离(p-distance)为0.00350~0.04545,各个薯蓣种内的不同类群该序列无差异.用UPGMA法根据psbA-trnH序列的遗传距离建立系统发生树,聚类结果和形态分类相符.所得结果显示,psbA-trnH片段序列在所研究的3种薯蓣种内保守,在种间具有明显的较大差异,而3种薯蓣及薯蓣属的系统发生关系尚须进一步研究.图3表2参6     

濒危植物邢氏水蕨和海南岛水蕨叶绿体序列rbcL比较及隐种分析

2021年,水蕨属（Ceratopteris）所有植物包括邢氏水蕨（C. shingii）、水蕨（C. thalictroides）和粗梗水蕨（C. pteridoides）被列为国家二级重点保护野生植物。水蕨属植物是研究植物性别决定、配子体形态建成以及遗传学、细胞生物学和生物化学等学科的模式植物之一,也是中国重要的野生水生植物种质资源。隐种（Cryptic species）问题已经成为系统分类研究、物种形成机制、生物进化和基于保护目的的种群遗传研究及保护计划共同关注的重要问题。基于叶绿体rbcL序列评价邢氏水蕨和海南岛陵水黎族自治县白水岭（BSL）、陵水黎族自治县木号镇（BJC）、海口城西镇（SPSK）等3个新发现的水蕨种群叶绿体序列rbcL的差异及系统发育关系,分析新发现尚未被评价的3个水蕨种群的隐种类型,为水蕨属不同物种和隐种的保护及利用提供科学依据。结果表明,邢氏水蕨和3个种群水蕨的rbcL序列长度为1 227 bp,邢氏水蕨有2个变异位点,分别在783 bp处和1 164 bp处。采用邻近法（NJ）构建了水蕨属叶绿体rbcL系统发育树。系统发育树显示BSL、BJC、SPSK等...     

藜属植物叶绿体基因组结构与系统进化

高等植物的叶绿体基因组主要遗传自母本,具有基因组小、结构简单、序列高度保守等特点.利用系统的生物信息学方法,对4种藜属植物的叶绿体基因组进行编码基因组成、基因组结构、重复序列、变异位点在内的比较基因组学研究,以及基于叶绿体基因组序列的藜亚科植物的系统进化研究.结果表明,4种藜属植物叶绿体基因组平均大小为151936bp,平均GC含量为37.16%,具体基因的拷贝数和总的基因数目差异很小,非常保守.除灰绿藜以外,其余3种藜属植物叶绿体基因组的LSC、SSC和IR区域的边界几乎完全一致,没有表现出明显的扩张与收缩.基因组的重复序列中,相较于SSR,长重复序列片段的比例更高.相比较IR区域,4种藜属植物的LSC和SSC区域之间存在更大的核苷酸位点差异;52-59 kb的基因组区域为4种藜属植物间核苷酸位点变异最大的区段.基于全基因组和LSC+SSC序列,分别构建了包括4种藜属植物在内的藜亚科植物的系统进化树,进化关系完全一致.本研究结果揭示了藜属植物叶绿体基因组的进化特征,可为藜属植物系统进化研究提供优良的候选分子标记.（图4表4参28）     

中国7个毛木耳(Auricularia polytricha)菌株ITS序列比较

对毛木耳7个菌株rRNA基因内转录间区(ITS)进行了克隆测序,并将其与木耳属其它几种的相应序列进行了比较.在供试的7个毛木耳菌株中,除特大(209bp)外,其余6个菌株的ITS2区序列长度完全相同;毛木耳rRNA基因的两个ITS区序列有一定数量的碱基变异,整个ITS区共有11个变异位点.与下载的木耳属另外4个种相比较,均有较大程度的变异.根据遗传同源性分析,遗传距离分析和系统树上所显示的供试菌株及相关已知种的亲缘关系,ITS序列分析支持传统的依据形态学进行的木耳属分类.图2表2参9     

基于叶绿体基因组的浮萍亚科系统进化

由于浮萍形态高度退化,其系统进化研究较为困难,基于叶绿体基因组研究浮萍亚科系统进化对解决该问题具有重要意义.通过过滤全DNA数据(即包含细胞内的核DNA、叶绿体DNA和线粒体DNA的测序数据)和直接提取叶绿体DNA测序两种方法组装叶绿体基因组,然后分别基于rbc L基因和叶绿体全基因组序列构建浮萍亚科系统发育树,并比较浮萍叶绿体基因组大小.经比对发现,通过两种方法得到的Landoltia punctata ZH0051叶绿体基因组完全一致,全长均为171 013 bp,序列相似度100%.基于叶绿体全基因组序列构建浮萍亚科系统发育树的节点置信值都达到了1,确认了浮萍亚科的进化次序为多根紫萍属、少根紫萍属、绿萍属、扁平无根萍属、芜萍属.浮萍亚科中叶绿体基因组最大的为少根紫萍属(171 kb),最小的为绿萍属(166 kb).本研究表明过滤全DNA数据组装出的浮萍叶绿体基因组是可靠的;浮萍叶绿体基因组大小虽有所差异,但随进化没有明确的扩张或收缩的趋势.     

长柄石杉不同地理居群叶绿体DNA trnL-trnF序列变异与聚类分析

采用直接测序法,对石杉科广布种长柄石杉(Huperzia serrata var.longipetiolata)21个居群(福建省19个居群和江西省2个居群)共计126株个体的叶绿体DNA trnL-trnF序列进行测序,用Clustal X和MEGA5.0软件进行序列分析,UPGMA法构建聚类图,以期了解序列变异与地理分布的关系,为长柄石杉资源的保护及开发利用提供参考依据.扩增获得的序列全长在928-967 bp之间,经排序后两端切平,序列长925 bp,G+C平均含量为34.05%;21个长柄石杉居群的cpDNA trnL-trnF序列存在20个变异位点,5个信息位点.UPGMA聚类结果显示,福建省居群与江西居群存在较大遗传距离,分聚为不同分支;福建省内19个居群再分聚为3个分支,其中11个居群间的遗传距离为零.研究结果表明长柄石杉居群间存在较明显的遗传分化和一定强度的基因流,居群间的叶绿体DNA trnL-trnF序列变异与地理分布尤其是山脉形成的隔离和屏障有关,较高的遗传多样性和基因流水平有利于长柄石杉种群的生存与进化.     

应用Tail-PCR扩增蓝猪耳T-DNA侧翼序列

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用TAIL-PCR成功扩增了转基因蓝猪耳T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2 000 bp,大多数片段在400 bp和800 bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,确定了部分T-DNA插入位点周边序列编码的可能蛋白,并提交序列7条;另外还对T-DNA转化植物时整合的位点进行了分析,发现断裂位点集中在距右边界15～18 bD和右边界外234 bp处,分别占总扩增片段的47.62%和38.10%.这为利用T-DNA标签进行蓝猪耳基因克隆和功能分析提供了实验技术上的保证.图2表2参24     

麻疯树叶绿ω3脂肪酸脱饱和酶基因的克隆和鉴定

根据几个已知的植物ω3脂肪酸脱胞和酶基因序列,利用RT-PCR和RACE技术从麻疯树中克隆了一条编码叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶的cDNA序列.对该序列的分析表明,该cDNA的编码区长1 368bp,编码一个长度为455个氨基酸的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量(Mr)大小为52.1×103.同源分析显示,推测的氨基酸序列与其他物叶绿体脂肪酸脱饱和酶具有很高的相似性.RT-PCR分析表明,该基因在麻疯树叶片中有着稳定的表达.此外,还通过酵母表达系统鉴定了该基因编码的酶的功能.对转基因酵母的脂肪酸组成分析发现,α亚麻酸在转基因酵母中积累.上述结果表明,该麻疯树cDNA编码了一个叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶.     

水稻精细胞优势表达基因RSSG58的启动子克隆和功能鉴定

利用本实验室已经克隆的水稻精细胞优势表达基因RSSG58的cDNA序列与NCBI中的粳稻基因组文库进行比对、定位,结合生物信息学方法分析预测基因上游的启动子序列.在此基础上设计引物,以粳稻Oryzasativa(japonicacultivar-group)日本晴黄化苗总DNA为模板,采用DNA聚合酶链式反应(PCR)的方法扩增出基因上游1093bp和462bp两个不同长度的启动子缺失片段(分别命名为JP58B和JP58S),测序结果显示,其具有大多数高等植物启动子的保守元件.进一步构建启动子片段的植物表达载体pBI121-JP58B和pBI121-JP58S,瞬时表达结果显示,两个启动子片段对报告基因GUS均具有启动活性.图4参20     

麻疯树叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶基因的克隆和鉴定

根据几个已知的植物ω3脂肪酸脱饱和酶基因序列,利用RT-PCR和RACE技术从麻疯树中克隆了一条编码叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶的cDNA序列．对该序列的分析表明,该cDNA的编码区长1368bp,编码一个长度为455个氨基酸的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量（Mr）大小为52．1×10^3．同源分析显示,推测的氨基酸序列与其他植物叶绿体脂肪酸脱饱和酶具有很高的相似性．RT-PCR分析表明,该基因在麻疯树叶片中有着稳定的表达．此外,还通过酵母表达系统鉴定了该基因编码的酶的功能．对转基因酵母的脂肪酸组成分析发现,α亚麻酸在转基因酵母中积累．上述结果表明,该麻疯树cDNA编码了一个叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶．图4表2参21     

Interspecific and intraspecific identification of Dendrobium based on the psbAtrnH intergenic region sequences and the 5S rRNA gene spacer sequences北大核心CSCD

This research aimed to investigate the interspecific and intraspecific identification of Dendrobium by using the multi-locus method so as to provide a molecular basis for Dendrobium identification through the combination of chloroplast psbA-trnH intergenic region sequences and ribosome 5S rRNA gene spacer sequences. PCR direct sequencing was applied to detect the chloroplast psbA-trnH intergenic region sequences as well as the ribosome 5S rRNA gene spacer sequences of 12 Dendrobium species, while the psbA-trnH intergenic region sequences of Dendrobium denneanum dq-2 variety and dq- 5line were cloned and sequenced for single nucleotide polymorphism (SNP) analyzing. The sequences were analyzed by the software Sequencher4.14, Bioedit7.0, MEGA5.2 and Dansp5.0; the interspecific and intraspecific Kimara-2-Parameter(K2P) distances were also calculated. The phylogenetic tree (using Neighbor joining method) was constructed with Bulbophyllum odoratissimum and Bletilla striata as outgroup. The results showed an average length of chloroplast psbA-trnH gene sequences in Dendrobium as 742.3 bp, with 72 variable sites, including 33 information sites; the average length of the ribosome 5S rRNA gene spacer sequences in Dendrobium was 336.4 bp, with 213 variable sites including 139 information sites. Using psbAtrnH intergenic region sequences in combination with ribosome 5S rRNA gene spacer sequences can not only identify D. denneanum, D. hancockil, D. thysiflorum, D. devonianum, D. moniliforme, D. chrysotoxum, D. officinale, D. heterocarpum and D. nobile, but also differentiate D. officinale from different geographical populations, and distinguish the dq-2 variety and dq 5line with SNP in the multi locus of D. denneanum.     

CMS高粱保持系叶绿体基因ps1A1和ps1A2片段的克隆与序列比对

以15种包括同质异核和同核异质高粱材料的总：DNA为模板进行RAPD分析，196个随机引物中，引物Y-19扩增得到一个很有规律的差异片段SAY-192300。该片段只出现在4个保持系(B)和3个恢复系(R)中，而不出现在6个不育系(A)和2个杂种F1中，进一步对cms—Al、cms—A2两套8个材料(A／B／R／F1)的总DNA、mtDNA和cpDNA用引物Y-19进行扩增，发现片段SAY-192300仅在cpDNA得到，Southern杂交结果证实了片段SAY-192300的叶绿体来源，同时也表明在cms胞质中该片段所在区未发生插入、缺失等大的结构变异,DNA序列测定结果表明，该片段为叶绿体ps1A1和ps1A2基因的部分序列。图6表2参19。     

甘薯块根腐烂真菌的分离和鉴定

从腐烂甘薯块根中分离到4株丝状真菌,分别编号为SP-1、SP-2、SP-3和SP-4,它们都能在甘薯块根片上快速生长.将这4株真菌接种在PDA培养基上,观察其菌落形态和结构特征.提取4株菌的总DNA,利用真菌的18S rDNA通用引物进行扩增、克隆和测序,其18S rDNA序列的长度分别为1 810 bp、1 769 bp、1 768 bp和1 770 bp.将这些序列在GenBank中进行序列比对,获得的同源性较高的序列用于构建系统进化树.根据分子鉴定和形态观察的结果,SP-1菌株是匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)SP-1,SP-2是尖镰孢(Fusarium oxysporum)SP-2,SP-3是康宁肉座菌(Hypocreakoningii)SP-3,SP-4是肉座菌属(Hypocrea),命名为Hypocrea sp.SP-4.     

大豆栽培种和野生种豆类胰岛素的基因分析

以栽培大豆和野生大豆的基因组ＤＮＡ为材料,利用ＰＣＲ技术扩增并克隆了豆类胰岛素基因,分析了两者的ＤＮＡ序列．结果表明,测定的ＤＮＡ序列分别为８４１ｂｐ和９０３ｂｐ,有４个核苷酸差异;在信号肽编码区域内各存在一个内含子,大小分别为３６８和３７０个核苷酸;在ＯＲＦ范围内,与前人报导的ｃＤＮＡ序列分别有１个和２个位点的核苷酸差异,从而导致相应位点的氨基酸发生变化．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明,栽培大豆和野生大豆的豆类胰岛素基因分别以单拷贝和多拷贝形式存在于基因组中     

全基因合成方法学研究

通过基因全合成实现基因的分子改造和人工组建正成为一种实验室常规手段,因此,建立一种能够在相对低廉和短时间内准确和高效地设计和合成长片段基因的方法十分重要.本研究报道了一种重复性好、错误率低、低成本和简便的基因设计和全合成方法.此方法包含经DNA2.0软件的序列优化,Gene2Oligo软件的寡核苷酸设计,覆盖全长基因双链的寡核苷酸的组合和引物介导下的全基因的合成等步骤.运用此方法,对3个不同长度的基因(分别为653bp,1309bp和1498bp)成功地进行了密码子优化和一步全合成.其中的amyFF在大肠杆菌中表达量提高了12倍.图2参18     

用简并引物扩增与克隆D.radiodurans超氧化物歧化酶和过氧化氢酶基因片段

依据超氧化物歧化酶（ＳＯＤ） 和过氧化氢酶（Ｃａｔ） 的保守性氨基酸序列,设计简并引物,自Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ 基因组ＤＮＡ扩增并克隆了ＳＯＤ和Ｃａｔ 基因片段．ＳＯＤ 和Ｃａｔ 基因片段分别长４５３ ｂｐ 和６７３ ｂｐ,各编码１５１和２２４ 个氨基酸,氨基酸序列与不同生物来源的ＳＯＤ或Ｃａｔ 具有高度同源性     

稀有鮈鲫Dmrt基因家族13个成员的克隆与序列分析

已经发现果蝇Doublesex、线虫Mab-3、青DMRT1Y/DMY和人类DMRT1等性别决定与分化基因均含有一个具有DNA结合能力的保守基序--DM结构域,对性别决定和性别分化具有调控功能.利用简并PCR,从稀有鲫基因组DNA中克隆了13个具有不同DM结构域的Dmrt基因家族成员.基于DM保守基序,建立了各物种的进化树.结果表明,稀有鲫基因组存在多个Dmrt基因成员,该基因在脊椎动物和非脊椎动物中具有高度保守性,是一种理想的环境内分泌干扰物研究的分子模型,在分子生态毒理学研究中具有很好的应用前景.     

D.radiodurans kat A和kat B基因的结构分析与功能鉴定

以简并引物PCR获得的Cat酶基因片段探针,结合生物信息学方法,探明了耐辐射奇球菌（D.radiodu-rans)基因组中存在两个编码过氧化氢酶（Catalase,Cat)的基因：katA和B.katA和katB基因长2277bp和1611bp,各编码758和536个氨基酸,用pKK223-3表达载体连接katB基因,转入Cat酶缺陷型大肠杆菌（E. coliUM2)进行表达.katB基因表达产物具有Cat酶活性,电泳迁移位置与D.radiodurans CatB酶位置相符,并可重建E.coliUM2对低浓度H2O2损伤的耐受力。     

DNA宏条形码(metabarcoding)技术在浮游植物群落监测研究中的应用

保护生物多样性和生态系统健康是维持生态系统功能和实现人类可持续发展的必要条件。浮游植物作为水生生态系统的初级生产者发挥着重要的生态功能,同时有毒藻类的爆发也会威胁水生态安全。然而,基于形态学的物种鉴定方法难以满足日益增长的水生态环境监测的需求。DNA条形码技术利用基因组特定基因的DNA序列来鉴别生物物种,目前已被广泛用于快速物种鉴别。然而其在水生生态系统浮游植物群落的监测中才刚刚起步。由于浮游植物物种多样性高,单基因DNA条形码往往难以识别所有浮游植物种类;近年来,采用多基因条形码、全叶绿体基因组序列的超级条形码,以及特定DNA条形码方法在浮游植物种类鉴别中有很大潜力。本文综述了浮游植物DNA条形码技术在物种鉴别研究方面的进展,以及DNA宏条形码技术(DNA metabarcoding)在水生浮游植物环境监测的应用现状及前景。     

近江牡蛎4种类型GST基因cDNA全序列的克隆与分析

为从分子水平上研究不同类型谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)基因在近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)等贝类体内代谢去毒过程中的作用,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到近江牡蛎肝脏4种类型GST基因cDNA全序列.序列分析结果表明,mu、pi、omega、sigma4种类型GST基因cDNA全长分别为970bp、773bp、999bp、1277bp,分别编码215、207、242、203个氨基酸.构建系统进化树发现,除太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)pi型GST外,所有类型GSTs序列都能各自聚集成一簇.