濒危植物厚朴SSR引物筛选及反应体系优化

探索适宜厚朴(Magnolia officinalis)简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)-聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的最佳条件.在SSR引物筛选基础上,利用正交试验设计对影响PCR反应的5个因素(模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和Taq酶催化活性浓度)进行4个水平的优化,并通过温度梯度试验优化引物退火温度.在厚朴及其近缘物种的70对引物中,筛选出13对扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物.PCR各因素在不同水平下对反应体系的影响由大到小依次为引物浓度、Taq酶催化活性浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和模板DNA浓度.PCR最佳优化体系:25 μL体系中,模板DNA质量浓度为2 ng·μL-1,引物浓度为0.6μmol·L-1,Mg2+浓度为2.0 mmol·L-1,dNTPs浓度为0.5 mmol·L-1,Taq酶催化活性浓度为0.03 U·μL-1(1U=16.67 nkat).最佳扩增程序:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,48.0～59.0℃(退火温度随引物不同而定)退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环后72℃延伸10 min.上述结果可为利用SSR-PCR技术研究濒危厚朴群体遗传学和分子生态学提供技术参数.     

家蚕丝心蛋白轻链cDNA和基因调控片段的克隆及序列分析

从家蚕品种菁松×皓月后部丝腺中提取总RNA ,用RT -PCR扩增技术克隆到家蚕丝心蛋白轻链cDNA .序列分析表明 ,该片段全长为 798个碱基 .比较 4种不同品种来源的家蚕丝心蛋白轻链基因外显子区域序列 ,同源性在98.0 %～ 99.4 %之间 ,推测的氨基酸同源性在 98.0 %～ 99.6 %之间 ,4个品种间发生的变异比较一致地集中在不同位置的 8个碱基上 .提取家蚕品种菁松×皓月后部丝腺总DNA ,进行PCR反应 ,获得家蚕丝心蛋白轻链基因调控片段 ,长度约为 1.2kb,测定了其邻近起始密码子一端包括 5 76个碱基的DNA序列 .结果表明 ,该片段包括一些典型的调控元件和多个可能参与丝蛋白基因特异性表达调控的元件 ,该部分序列与J - 139L链基因相应区域同源性高达 98.8% .图 3参 8     

变性高效液相色谱在大通量筛查基因突变中的应用

应用变性高效液相色谱(DHPLC)对已知序列的含外显子7的斑马鱼p53基因片段PCR产物进行突变检测,结果表明,通过克隆测序方法检测出的点突变,用DHPLC同样可以检出.且对该片段的最优化检测柱温为60℃,其特异性很好,敏感性大于95%.     

甘蔗SCoT-PCR反应体系优化与多态性引物筛选及应用

目标起始密码子多态性(Start condon targeted polymorphism,SCoT)分子标记是一种新型的标记,结合了ISSR标记和RAPD标记的优点.本研究针对SCoT-PCR反应体系的影响因素,以甘蔗叶片DNA为材料,在单因子实验的基础上,采用L16(45)正交实验设计,进一步探讨了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物及Taq酶等5个因素对甘蔗SCoT-PCR扩增效果的影响,建立了甘蔗SCoT-PCR的优化反应体系.25μL PCR反应混合液中,含50 ng DNA模板、2.0μL 10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)、0.625 U Ex Taq酶,dNTP和引物的终浓度分别为0.22 mmol/L和0.9μmol/L.以我国种植面积最大的栽培品种新台糖22号为模板,应用优化体系,对40条SCoT标记引物进行测试,筛选出16条有效扩增的引物,且均为多态性引物,其GC含量在50%～67%之间.该体系的稳定性和SCoT标记引物的扩增能力,通过基于随机选择的4条引物对9份具有地理来源和遗传背景不同的甘蔗种质进行标记分析来验证,结果共扩增出84条带,其中多态性条带占82.14%,平均单条引物可扩增出21条.研究结果为在甘蔗上进一步开发和应用功能性SCoT标记奠定了基础.     

甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1的克隆与原核表达

脂肪酸延长酶1(FAE1)是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶.根据Genbank上已知的植物FAE1基因设计引物,以从甘蓝型油菜叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1380bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列比对结果说明了该片段与植物中已知的FAE1序列有极高的相似性,并且不存在内含子序列.将该片段通过高保真酶扩增,EcoRⅠ酶切消化后定向克隆到pGEX-2T表达载体中,在IPTG诱导下于28℃表达出Mr76×103的蛋白质条带.用兔抗GST多克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,并获得阳性检测结果.这为甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1功能的进一步研究奠定了基础.图4表1参14     

采用高通量测序技术检测肺癌致病突变及靶向药物突变位点

Ion Torrent高通量测序平台可通过测序癌症病人的基因组,找出致病突变位点进而选择对应的靶向药物以更加有效地治疗并减少毒副作用.利用Ion Torrent平台共检测了55例非小细胞肺癌组织的甲醛固定石蜡包埋样本(FFPE样本),对测序结果进行分析并找出致病突变位点.其中,30(54.5%)例样本有抑癌基因TP53的突变,突变类型一共包括36种,是突变频率最高的一个基因.突变频率次高的基因是EGFR,检测到17(30.9%)例病人共8种突变类型.突变频率第三高的是ERBB4(HER4,与EGFR同属HER家族),检测到14(25.5%)例病人共两类突变.此外,还有其他突变频率较高的基因,如MLH1(8例,14.5%)、KRAS(6例,10.9%)、PIK3CA(5例,9.1%)等.本研究表明通过提取肺癌病人FFPE样本中的DNA并使用Ion Torrent平台测序可以找到致病突变,可用于指导医生进行更好的靶向药物治疗.     

玉米根际土壤中大环内酯类抗性基因的分布特征

环境中的抗生素残留将胁迫农作物根际土壤微生物产生耐药性,使得这些农作物的根际土壤成为抗性基因转移的"热区"。采用陆生微宇宙系统,模拟玉米生长过程中大环内酯类抗生素进入植物根际土壤后相应抗性基因的分布情况。利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了63 d内玉米根际土壤中大环内酯类抗生素抗性基因(erms)的相对丰度(erms∶16S rDNA,即erms绝对浓度与16S rDNA绝对浓度的比值)。结果显示:土壤中不同抗性基因相对丰度存在较明显的差异,整体表现为ermFermXermBermC。7 d时,非根际(BK)土壤中ermB、ermC、ermF和ermX相对丰度分别为4.72×10~(-2)、1.98×10~(-3)、7.13×10~(-1)和1.75×10~(-2),而63 d时则分别为1.74×10~(-3)、3.24×10~(-4)、3.53×10~(-3)和2.28×10~(-3),基因相对丰度增幅分别为-96.3%、-83.6%、-99.5%和-87.0%;根际(RH)土壤中ermB、ermC、ermF和ermX相对丰度增幅分别为-88.3%、103.0%、-88.6%和71.5%,暗示玉米根际可能具有促进土壤中抗性基因ermC和ermX增殖或转移的作用。不同深度土层中erms相对丰度由大到小依次为0～0.2、0.2～0.4和0.4～0.6 m,表明erms在土壤中具有向下迁移的特性,且随着土壤深度的增加,相对丰度呈递减趋势;与未种植玉米(CK)土壤相比,种植玉米(MA)土壤中erms检出率和相对丰度较高,表明玉米的根际环境有利于不同类型erms的富集以及在剖面土壤中的纵向迁移。     

解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达

利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸测序结果完全一致 ,说明克隆到的基因确实是豆豉溶栓酶基因 .同源性分析表明 ,DFE成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为 80 .0 %和 86 .5 % ,这提示豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶 .将表达质粒pET Nde转化E .coliBL2 1(DE3)中 ,IPTG可诱导表达大量的DFE融合蛋白 ,占菌体可溶性蛋白的 4 0 % ,主要以包涵体的形式存在 .图 3表 1参 19     

海栖热袍菌耐高温β-甘露糖苷酶基因的克隆及表达

以海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8基因组DNA为模板,克隆得到β-甘露糖苷酶基因(man2).测序分析表明,该基因全序列为2358bp,编码785个氨基酸,分子量约为92×103.根据蛋白质氨基酸的同源性分析,该β-甘露糖苷酶与新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)Man2(accession No.AAK52304.1)的同源性最大,达到80%.将此基因连接至表达载体pET-28a( )并转化到大肠杆菌BL21细胞中,经IPTG诱导,β-甘露糖苷酶活力达5.96U/mL.粗酶的温度稳定性分析表明,该酶的热稳定性好,90℃处理10min,活力回收率65%,具有重要的工业应用前景.图3表1参17     

焦化废水生物膜样品和苯酚降解菌分离株基因盒的分析

使用59-碱基(59be)保守序列和整合酶基因的引物进行PCR扩增,研究了焦化废水处理装置中微生物菌群的基因盒结构,并对两株分离的苯酚降解荫IS-17和IS-46的基因盒进行了扩增测序分析.从5个焦化废水生物膜总DNA样品中均获得了基因盒扩增产物.对IS-17和IS-46的基因盒PCR产物克隆建库并测序,通过序列比对等方法来研究和分析序列的功能.发现本研究获得的基因盒与已报道的基因盒存读码框序列、两端引物结合序列、间隔区大小等方面存在一些不同.本研究结果表明,在焦化废水生物膜菌群中普遍存在基因盒结构,采用基因盒PCR能够从环境或菌株中获取新基因.     

RAPD扩增中商品酶体系对扩增产物的影响

随机选用了10条RAPD引物，采用3种商品TapDNA聚合酶体系，以5个不同物种的动植物总DNA为模板，进行RAPD扩增，实验发现，在对同一模板、采用同一引物进行的RAPD扩增中，仅仅因为使用了不同的商品TaqDNA聚合酶，获得的扩增产物差别极大；不同商品来源的PCR反应缓冲体系，对扩增产物也有一定影响，但相对较小，这说明，不同的商品酶体系对RAPD扩增产物影响很大，因此，影响RAPD扩增产物稳定性的一个关键因素是商品TaqDNA聚合酶本身；研究中前后一致地使用同一商品TaqDNA聚合酶体系，是成功进行RAPD分析的基础。     

活性污泥总DNA不同提取方法的比较

为了快速、简便和经济地获得活性污泥的总DNA,以用于分子生物学研究,采用5种不同的DNA提取方法提取活性污泥的总DNA,并通过提取的核酸总量、纯度、是否含有聚合酶链反应抑制剂等指标综合分析不同的提取方法对活性污泥总DNA提取效果的影响.结果表明:蛋白酶K-SDS-酚氯仿法和柱提取DNA试剂盒法提取活性污泥总DNA效果最好,提取DNA总量多,纯度高,可不经纯化直接进行PCR扩增反应。     

高氨氮废水处理系统中功能微生物的检测

利用16S rDNA分子检测技术对高氨氮废水处理系统中的氨氧化细菌、亚硝酸盐氧化细菌等难分离培养微生物进行了分析检测.从实验室处理高氨氮废水的生物流化床硝化系统生物膜中提取细菌总DNA,以其为模板,利用氨氧化细菌(AOB)和亚硝酸盐氧化细菌(NOB)的16S rDNA特异性引物进行多聚酶链式反应(PCR)扩增,获得AOB和NOB的特异片段.将特异片段与pGEM-T载体连接并转化到E.coli DH5α中获得重组子,对阳性重组子进行酶切分型,AOB可分为8种不同类型.选取AOB的8种类型代表以及随即选取8个NOB克隆进行测序.经GenBank搜索以及同源性分析,发现所获得的8个AOB类型来自不同的菌株,处理系统中以Nitrosomonas sp.和Nitrosococcus sp.为氨氧化细菌的优势菌属;8株NOB重组子中有7株来自不同的菌株,系统中Nitrobacter sp.和Afipia sp.为亚硝酸盐氧化细菌的优势菌属.图6表1参14     

Design and use of group-specific primers and probes for real-time quantitative PCR

Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) has gained popularity as a technique to detect and quantify a specific group of target microorganisms from various environmental samples including soil, water, sediments, and sludge. Although qPCR is a very useful technique for nucleic acid quantification, accurately quantifying the target microbial group strongly depends on the quality of the primer and probe used. Many aspects of conducting qPCR assays have become increasingly routine and automated; however, one of the most important aspects, designing and selecting primer and probe sets, is often a somewhat arcane process. In many cases, failed or non-specific amplification can be attributed to improperly designed primer-probe sets. This paper is intended to provide guidelines and general principles for designing group-specific primers and probes for qPCR assays. We demonstrate the effectiveness of these guidelines by reviewing the use of qPCR to study anaerobic processes and biologic nutrient removal processes. qPCR assays using group-specific primers and probes designed with this method, have been used to successfully quantify 16S ribosomal Ribonucleic Acid (16S rRNA) gene copy numbers from target methanogenic and ammonia-oxidizing bacteria in various laboratory- and full-scale biologic processes. Researchers with a good command of primer and probe design can use qPCR as a valuable tool to study biodiversity and to develop more efficient control strategies for biologic processes.     

栉孔扇贝内参基因稳定性研究

合适的内参基因对准确定量目标基因表达水平非常重要。利用实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析了不同发育阶段和雌激素暴露条件下栉孔扇贝性腺组织中β-actin、β-TUB、EF-lα、18SrRNA和GAPDH5个内参基因的表达水平,并利用RefFinder软件对其表达稳定性进行了分析。结果表明:在所考察的内参基因中,EF-lα在栉孔扇贝不同发育阶段和雌激素暴露下的表达均最为稳定,可作为定量目标基因表达水平的内参基因之一。     

微生物分子生态学进展

This paper summarizes some molecular techniques applied in the studies on microbial ecology,such as hybridization of nucleic acid probes,ampification of polymerase chain reaction,denaturing gradient gel electrophoresis and analyses of ribosomal RNA gene sequences,and the progress,performance,achievements and advances made from the researches of microbial ecology in recent years by using these molecular techniques．     

微生物分子生态学进展[综述]

现代分子生物学技术在生态学研究中的应用大大推动了微生物生态学的发展,导致了微生物分子生态学的产生．微生物分子生态学方法弥补了传统的微生物生态学方法的不足,使人们可以避开传统的分离培养过程而直接探讨自然界中微生物的种群结构及其与环境的关系．微生物生态学研究中采用的分子生物学方法主要有核酸探针技术、ＰＣＲ扩增技术、ｒＲＮＡ序列同源性分析方法、剃度凝胶电泳方法等．这些技术方法的采用,取得了一系列重要的成果和微生物生态学研究中的突破［１～６］,使得对某些微生物的研究成为可能,并在分子水平上阐述了生态问题…     

北江河水中抗生素抗性基因污染初步研究（Preliminary Studies on the Pollution Levels of Antibiotic Resistance Genes in the Water of Beijiang River, South China）

环境中细菌的耐药性,尤其是对抗生素的耐药性已成为影响生态环境的重要因素.论文采用抗生素抗性平板法调查了北江河水中四环素、红霉素及磺胺类这3类抗生素耐药性细菌的存在,采用定性PCR及荧光定量PCR方法分别研究了该水域sul1和sul2这2种磺胺类抗生素抗性基因(ARGs)的存在和含量水平.结果表明,所采集北江水域的9个样品中有5个对四环素有耐药性,7个对红霉素有耐药性,8个对磺胺二甲嘧啶有耐药性;定性PCR实验并经基因测序结果证实,5个样品含有sul1,4个样品含有sul2.进一步的PCR定量分析结果显示,7个样品中均检出sul1和sul2磺胺抗性基因,它们与内对照基因16S-rRNA表达量比值分别在10-2.56~10-0.52及10-3.25~10-1.24范围内,该结果显著高于美国科罗拉多州北部河流的研究结果.此外,数据分析也发现,sul1和sul2磺胺抗性基因的含量水平与该区域水中磺胺含量分布具有一定的相关性,表明外源性抗生素对河流的污染是诱导抗性基因的重要因素.     

Cultivation of aerobic granular sludge in a conventional,continuous flow,completely mixed activated sludge system

Aerobic granules were formed in a conventional, continuous flow, completely mixed activated sludge system (CMAS). The reactor was inoculated with seed sludge containing few filaments and fed with synthetic municipal wastewater. The settling time of the sludge and the average dissolved oxygen (DO) of the reactor were 2 h and 4.2 mg·L^-1, respectively. The reactor was agitated by a stirrer, with a speed of 250 r·min^-1, to ensure good mixing．The granular sludge had good settleability, and the sludge volume index (SVI) was between 50 and 90 mL·g^-1. The laser particle analyzer showed the diameter of the granules to be between 0.18 and 1.25 mm. A scanning electron microscope (SEM) investigation revealed the predominance of sphere-like and rod-like bacteria, and only few filaments grew in the granules. The microbial community structure of the granules was also analyzed by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE). Sequencing analysis indicated the dominant species were α, β, and γ-Proteobacteria, Bacteroidetes, and Firmicutes. The data from the study suggested that aerobic granules could form, if provided with sufficient number of filaments and high shear force. It was also observed that a high height-to-diameter ratio of the reactor and short settling time were not essential for the formation of aerobic granular sludge.     

Rapid,recurring, structured survey versus bioblitz for generating biodiversity data and analysis with a multispecies abundance model

A bioblitz inexpensively and quickly generates biodiversity data, but bioblitzes are often conducted with haphazard, unreplicated sampling. Results tend to be taxonomically, geographically, or temporally biased, lack metadata, and consist of lists of observed taxa that do not enable further analyses or correction for imperfect detection. A rapid, recurring, structured survey (RRSS) uses a structured sampling design and temporal and spatial replication to survey randomly selected sites on a conservation property. We participated in a loosely structured bioblitz and a subsequent RRSS at Big Canoe Creek Nature Preserve in Springville (St. Clair County), Alabama (USA) to compare observed richness derived from the 2 survey approaches. The RRSS data structure enabled us to fit models that accounted for imperfect detection to estimate abundances, occupancy probabilities, and habitat associations. The loosely structured bioblitz data could not be used in such models. We present a new integrated multispecies abundance model that we applied to avian RRSS data. Our model extension enables estimation for the community, employs data augmentation to estimate the number of undetected species, and incorporates covariates. The RRSS generated a more comprehensive and less biased list of observed taxonomic richness than the loosely structured bioblitz (e.g., 73 vs. 45 bird species and 104 vs. 63 insect families from the RRSS vs. loosely structured bioblitz, respectively). Models fit to the RRSS data identified seasonal patterns in avian community composition and allowed for estimation of habitat–occupancy relationships for insect taxa. The RRSS protocol has potential for broad transferability as a standardized, quick, and inexpensive way to inventory biodiversity and estimate ecological parameters while providing an outreach opportunity.