gsh1基因的克隆及其在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase)编码基因gsh1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastorisx-33,构建了重组菌P.pastorisx-33(pGAPZA-gsh1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并通过PCR进行了验证.对阳性转化子的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶的酶活是宿主菌的3.0倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42.2mg/L,是宿主菌的1.6倍.图7表1参10     

杂合抗菌肽LPCB在毕赤酵母中的表达条件优化

为获取能表达具有天然活性的杂合抗菌肽的重组酵母菌,确定其最佳表达条件,将构建好的重组酵母表达载体pPICZα-A-CecropinB(1～10)-Magainin2(1～12)(简称pPICZα-A-CBMA)和pPICZα-A-Lfcin-Pro-CecropinB(简称pPICZα-A-LPCB)经SacⅠ线性化处理,分别电转入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,PCR扩增验证,甲醇诱导表达.采用抑菌圈法初步测定产物活性,优化杂合肽LPCB诱导时间、诱导剂浓度、诱导温度、培养基pH等表达条件,传代检测其质粒稳定性.结果显示,基因工程菌P.pastoris X-33/pPICZα-A-CBMA和P.pastoris X-33/pPICZα-A-LPCB成功构建.表达产物前者抑菌活性微弱,后者抑菌活性良好.杂合肽LPCB的最佳表达条件为:25℃,pH中性培养,每24 h添加0.5%(V/V,φ)甲醇,诱导表达72 h.重组酵母菌pPICZα-A-LPCB在培养超过100代后,未发生质粒丢失.     

麻疯树酰基载体蛋白的基因克隆、表达分析及原核表达

从麻疯树胚乳cDNA文库中筛选分离了一个编码酰基载体蛋白的cDNA序列,全长为806 bp,其开放读码框(ORF)长度为393 bp.编码130个氨基酸,该序列在GenBanl澄录号为EF179617,命名为JcACP.该基因编码的蛋白质相对分子质量(M)约为14.4×103,等电点为5.2,具有酰基载体蛋白的典型特征--含有4'-磷酸泛酰巯基乙胺辅基的结合位点.RT-PCR试验结果表明,该基因在麻疯树的叶、茎和种子中表达,以种子中的表达量最高,在根中不表达,种子萌发后其表达量随萌发进程递增,在96 h时表达量达到最高.结果表明,JcAcP在种子中的高度表达可能与种子萌发时的代谢活动有关.同时,将其在大肠杆菌中成功进行了原核表达.     

黑曲霉耐热木聚糖酶XYNB在毕赤酵母中的高效表达

高比活木聚糖酶的高效表达是进一步提高木聚糖酶发酵效价、降低生产成本的有效途径.将黑曲霉木聚糖酶基因XynB(不含信号肽)克隆到分泌型表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,G418和PCR鉴定的阳性转化子经0.5%甲醇、在28℃诱导表达.SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为20×103左右.优化的诱导表达条件为,每隔12 h添加0.5%的甲醇,发酵5 d后,比活达4 757 U/mg;其最适温度为55℃,最适pH为5.0,80℃处理30min后仍有74%的残余酶活.     

中国虎纹捕鸟蛛神经毒素肽基因的克隆及在酵母中的表达

从中国珍稀毒蜘蛛种虎纹捕鸟蛛的粗毒中分离纯化的虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)是含33个氨基酸的多肽.有关实验已证实,HWTX-Ⅰ是一种作用于突触前膜的神经毒素和高阈值钙通道抑制剂,在电刺激时HWTX-Ⅰ也影响交感神经释放肾上腺素和迷走神经释放乙酰胆碱,这些结果表明,HWTX-Ⅰ具有潜在的镇痛活性.本文报道通过RT-PCR方法克隆、测定了HWTX-Ⅰ的cDNA序列.在此基础上,以pPIC9K为表达载体和GS115为宿主,筛选His Muts克隆,以甲醇为诱导剂,成功地构建并在毕赤酵母系统分泌表达HWTX-Ⅰ基因.进一步分析HWTX-Ⅰ表达产物,生物活性实验观察到酵母表达体系所获得的HWTX-Ⅰ产物具有与天然HWTX-Ⅰ相似的生理活性.图4参10     

大肠杆菌植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨植酸酶的结构与功能,研究了来源于大肠杆菌的植酸酶基因在酵母中的表达和纯化条件.将含有大肠杆菌植酸酶基因的毕赤酵母工程菌在不同甲醇浓度和不同诱导时间下培养,检测植酸酶的表达情况.结果表明:诱导培养基中一次性添加2.5%的甲醇,诱导96 h后,蛋白浓度达到1.36 mg mL-1,酶活力达到6 530 U mL-1;将在毕赤酵母中表达的植酸酶粗酶液经过硫酸铵盐析、Resource S柱和Superdex-75三步纯化,得到单峰纯的蛋白,比活力为137 280 Umg-1.用圆二色谱分析纯化后的蛋白在pH 5.0和8.0环境中的结构变化,结果显示pH 8.0环境使大肠杆菌植酸酶发生了变性.图3参16     

酵母基因报道系统检测环境二恶英类似物的污染

利用一套酵母基因报道检测系统，建立和标化了对二恶英类标准样品测定的方法，证明此系统可检测ng级的二恶英及其类似物，具有简单、快速的的特点．对广州市区工业和生活污水排放较为集中的水体进行的测定显示，二恶英及其类似物在部分地区超标，而各区经处理的自来水均无超标污染．对小鼠急性毒性实验的血清样品的测定同样证明系统能够测定未浓缩处理的复杂样本，具有一定的应用价值．图4参10     

假单胞菌表达载体pYMB03的构建与性能分析

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是具有强抗逆性能的环境优势菌,构建其质粒表达载体有着明显的应用潜力.将恶臭假单胞菌AB92019菌株中肽聚糖相关脂蛋白编码基因的启动子PoprL和质粒载体pTrcHis-B的多克隆位点片段插入到质粒载体pUCPl8的EcoRL/HInIII位点,获得了重组载体pYMB03.用绿色荧光基因gfp作为标记进行外源蛋白表达的结果表明,该载体能分别在恶臭假单胞菌AB92019菌株和大肠杆菌DH5a菌株中,由启动子PoprL启动组成型表达GFP蛋白并使细胞产生可见荧光.经SDS-PAGE验证,所产生的GFP蛋白分别占细胞总蛋白的12.5%和5.O%.重组菌株YMB001中GFP表达量与菌体培养时间有关,在稳定期后期其相对荧光强度达到最大值(D600nm=l.0),但与培养温度未见相父性.对携带该载体的2株重组恶臭假单胞菌7次168 h继代培养测定,载体pYMB03的稳定性均为100%.     

粘红酵母△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

Δ12-脂肪酸脱氢酶一般特异性催化在油酸的Δ12位引入双键转变成亚油酸.为了从粘红酵母YM25079中克隆全长Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列,参考已知的Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列设计基因特异性引物,通过PCR扩增获得到全长为1 353 bp的c DNA序列,序列分析结果表明该序列具有一个编码450个氨基酸的完整开放阅读框,所编码蛋白质的大小为50.9×103.与报道的Δ12-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ12-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证其功能,把开放阅读框序列亚克隆到表达载体p YES3/CT,构建重组表达载体p YRGD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达.脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,该序列所编码的蛋白质具有Δ12-脂肪酸脱氢酶活性,能将油酸转化为亚油酸,亚油酸的含量占酵母总脂肪酸的4.31%.以上结果表明,PCR所获得序列是新的Δ12-脂肪酸脱氢酶基因.     

酵母菌处理高浓度色拉油加工废水研究

从含油土壤中筛选出适用于色拉油加工废水的酵母菌菌群,并用摇瓶试验研究了该菌群对未经预处理的高浓度含油色拉油加工废水的降解效果．采用酵母菌菌群处理总有机碳（ Ｔ Ｏ Ｃ） 含量为ρ Ｔ Ｏ Ｃ＝ ２ ５００ ｍｇ Ｌ－ １ 的色拉油加工废水,２４ ｈ 内可以去掉８５ ．２ ％ 的 Ｔ Ｏ Ｃ．酵母菌菌群在酸性条件下（ｐ Ｈ３ 左右） 表现出更好的处理效率,反应温度升高时 Ｔ Ｏ Ｃ 去除率有降低的趋势．结果表明,高浓度含油色拉油废水可以直接用酵母菌法进行处理     

酿酒酵母对Cu2+生物吸附机制的研究

采用废啤酒酵母分析了pH值、加菌量等影响啤酒酵母吸附Cu2 的主要因素,结果表明:pH4.5,吸附时间1—1.5h,加菌量0.01g·ml-1为最佳吸附条件;酵母对Cu2 的吸附符合Langmuir模型,表现为单分子层吸附;酵母菌细胞壁表面的—COOH,—NH3以及脂肪在其吸附铜离子时起着重要作用,NaOH处理的酵母吸附能力大大增加.     

组织滴虫病及其研究动态

组织滴虫病是近年来国内养禽业中出现的一个新问题。作者根据国内外资料,对本病的病原、流行特点和症状、诊断进行了较为详细的评述,并提出了科学的饲养管理措施和防治方法。     

土壤酶研究动态与展望

1　土壤酶的研究简史土壤酶主要来源于土壤微生物和植物根系的分泌物及动植物残体分解释放的酶 ,包括氧化还原酶类、水解酶类、裂合酶类和转移酶类 .自 1898年Ｗｏｏｄｓ首次从土壤中检测出过氧化氢酶活性以来 ,土壤酶研究经历了一个较长的奠定和发展时期 .2 0世纪 5 0年代以前为土壤酶学的奠定时期 ,许多土壤学者从各种土壤中共检测出了 4 0余种土壤酶的活性 ,并发展了土壤酶活性的研究方法和理论 ,土壤酶研究逐渐发展成一门介于土壤生物学和生物化学之间的一门新兴边缘交叉学科[1～ 2 ] .50年代至 80年代中期为土壤酶学迅速发展的时期 ,这…     

酵母融合菌对铬离子的吸附特性研究

酵母融合菌的完整细胞、细胞壁、细胞内含物富集水体中的铬,比较了各组分对铬离子的吸附能力差异,并进行了模型拟合.结果表明:细胞壁的去除率和吸附量都明显高于完整细胞;完整细胞及细胞壁对铬的吸附均符合Freundlich和Langmuir热力学方程,且细胞壁对Cr6 的最大吸附量和吸附亲和力都大于完整细胞,说明细胞壁是该吸附剂吸附重金属离子的主要部位.同时利用多种分析手段研究了各组分对铬的吸附行为:酵母细胞壁的特殊结构以及AFM图显示细胞壁可以为活性基团吸附、络合或螯合金属离子提供更为广阔的空间;X-射线衍射和FTIR分析检测表明吸附剂对铬的吸附并未破坏其本身的结构.     

啤酒废酵母核酸降解物在龙眼生产上应用的研究

使用45μg/mL的啤酒废酵母核酸降解物处理龙眼后,与对照相比叶片厚度增加了16.80%,叶片鲜比重（mg/cm^2）增加了14.15％,叶片干比重（mg/cm^2）增加了32.12%,叶绿素a增加了68.88%,叶绿素b增加了27.50%,叶绿素总量增加了56.10%,使用40μg/mL的核酸降解物处理后,能增加龙眼雌花量,提高雌雄花比,座果数比对照增加了183.94%,单株产量增加128.94%,单果重增加26.57%,可食率增加11.29%,可溶性固型物增加9.51％,维生素C增加14.97%,明显地改善了龙眼的果实品质。     

用啤酒糟酶解液培养酵母菌产麦角固醇的研究

以麦角固醇质量分数达３％以上的酵母菌株Ｙｓ－５和Ｙｓ－１６为培养菌,进行了用啤酒糟酶解液代替糖蜜培养基发酵生产麦角固醇的实验．结果表明,在最适条件下,添加少量自溶性酵母,酵母菌的麦角固醇产率可提高２０％左右．     

重金属离子对酵母降解苯酚的影响

研究了铜、镉、锌和铅对酵母 (Pityrosporumsp .)降解苯酚的影响 .急性毒性试验表明 :Cu2 36h时对菌体生物量的毒性抑制微低于对苯酚降解的抑制 ;48h时对菌体生物量的毒性高于对苯酚降解的毒性 .受试时间段 ,Cd2 对菌体生物量的毒性均高于其对苯酚降解的毒性 .在 0— 36h内 ,Cu2 对菌体比增长速率的EC50 是 45 0nmol·l- 1 ,对苯酚降解速率的EC50 是 0 32nmol·l- 1 ;Cd2 相应的EC50 分别是 681nmol·l- 1 和 33 3nmol·l- 1 .Cu2 比Cd2 具有更高的毒性 .而锌和铅在低浓度时 ,对酵母降解苯酚过程中菌体生物量以及苯酚的降解均有促进作用 ,其促进作用随着金属离子浓度的增加而减弱 .     

自絮凝颗粒酵母酒精连续发酵过程精馏废液循环回用工艺的研究

以玉米粉双酶法制备的糖化液为底物,采用酵母细胞自絮凝形成颗粒作为细胞固定化方法在有效容积１．５ Ｌ小型悬浮床生物反应器中研究了不同酒精精馏废液循环比条件下的连续发酵工艺过程,并探讨了酒精精馏废液“全循环”的可行性．研究结果表明：虽然产生了比较强的副产物抑制效应,但该工艺能够稳定操作,为酒精发酵行业彻底解决废液污染问题提供了一条简便、可行的工艺路线