木糖发酵酿酒酵母抑制物耐受能力提升及利用秸秆原料的乙醇发酵性能

木糖利用能力和抑制物耐受能力优良的工业酿酒酵母菌株以及合理的糖化发酵工艺是纤维素燃料乙醇生产的两个关键.对一株工业酿酒酵母菌的磷酸戊糖途径转醛醇酶基因TAL1进行差异过表达,评价其在8种典型抑制物存在时对菌株利用木糖的影响;利用TAL1过表达菌株研究油菜秸秆预处理物料中抑制物含量高低对分步糖化发酵(SHF)、预糖化-同步糖化发酵(P-SSF)和同步糖化发酵(SSF)3种不同糖化发酵方式发酵过程的影响,探讨高固含量发酵的可行性.结果显示,TAL1基因过表达提高了菌株的木糖代谢能力和对8种典型抑制物的耐受能力,适度过表达菌株表现最优,有抑制物存在时的木糖消耗速率提升了20%-70%.秸秆预处理物料中抑制物总含量约为4 g/L时,SHF无法正常发酵,SSF的乙醇收率接近70%,略高于P-SSF;当物料中抑制物总含量下降到约2 g/L时,3种方式都能顺利发酵,SSF表现最优,96 h时的乙醇收率为86.5%,但SSF(96 h)和P-SSF(112 h)所需糖化发酵总时间远低于SHF(144 h);总固含量约为25%的分批补料-同步糖化发酵(FB-SSF)的乙醇浓度和乙醇收率分别达到54.2 g/L和67.2%.上述结果表明,TAL1基因适度过表达提升了菌株的木糖发酵和抑制物耐受能力,菌株已具备比较优秀的发酵和耐受抑制物的能力;预处理物料中抑制物含量相对较高时采用SSF或P-SSF工艺,而抑制物浓度相对较低时,3种糖化发酵方式都可以采用,但SSF所需发酵时间最短,生产能力最高.     

菊芋秸秆高浓度物料分步糖化及乙醇发酵

菊芋是生物能源和生物炼制的新型原料作物,具有和其他作物不同的秸秆组成.为了解菊芋秸秆的生物转化情况,本研究首先比较了NaOH-H_2O_2、瞬间弹射蒸汽爆破(ICSE)及NaOH-H_2O_2和ICSE联用等3种预处理方法,证明对于菊芋秸秆NaOH-H_2O_2预处理法简单高效.进一步研究显示,NaOH-H_2O_2预处理过程中水洗一次即可显著促进酶解和后续发酵.利用分批补料和补加纤维素酶的方式进行高物料浓度条件下预处理菊芋秸秆的分步水解和乙醇发酵,当物料浓度达到30%(m/V)时,水解72 h的葡萄糖和木糖浓度分别可达143.6 g/L和36.2 g/L.利用木糖-葡萄糖共发酵重组酿酒酵母菌株LX03在菊芋秸秆水解液中进行乙醇发酵,发酵72 h乙醇最高浓度达66.2 g/L(8.27%,V/V),且发酵总糖利用率达86.9%.本研究利用菊芋秸秆水解液发酵获得较高的乙醇产量,为进一步利用菊芋秸秆进行高效生物炼制及高浓度纤维素乙醇生产提供了参考.(图3表1参23)     

混合糖发酵条件下甲酸抑制木糖发酵的机制

纤维素燃料乙醇生产面临的一个重要问题是纤维素原料预处理过程中产生多种副产物会显著抑制酿酒酵母的生长繁殖和发酵,其主要成分弱酸类中甲酸被认为具有最强的抑制效应.为了解工业酿酒酵母混合糖发酵时木糖利用被甲酸特异性显著抑制的机制,为发酵菌株的抑制物耐受育种提供依据,以乙酸存在条件下的发酵为对照,研究甲酸存在条件下菌株分别发酵混合糖和单独木糖时的发酵性能以及糖代谢相关基因的表达差异、葡萄糖浓度对菌株发酵木糖和木糖代谢基因表达的影响,同时研究甲酸存在条件下葡萄糖代谢产物乙酸和乙醇对菌株发酵木糖的影响以及混合糖和单独木糖发酵过程中甲酸浓度变化和甲酸脱氢酶基因FDH1转录情况.结果显示:葡萄糖只有在甲酸存在条件下才特异性地显著抑制木糖发酵,木糖消耗速率的下降与木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)酶活下降有关;单独木糖发酵时,只有当乙酸、乙醇和甲酸共存时才表现出抑制效应,且随乙醇浓度增加抑制效应越明显,木糖发酵被抑制与XDH酶活下降有关,但乙酸、乙醇和甲酸三者对木糖发酵的协同抑制效应明显弱于60 g/L葡萄糖存在时的抑制;混合糖发酵时FDH1基因转录被抑制导致甲酸分解缓慢,对甲酸存在条件下木糖发酵被抑制有部分贡献.综上,葡萄糖抑制甲酸分解与葡萄糖代谢产物乙酸、乙醇和甲酸的协同抑制对混合糖发酵时甲酸对木糖发酵特异性显著抑制有贡献,但尚存在其他未知抑制机制,还需进一步深入研究.     

木糖发酵酿酒酵母抑制物耐受能力提升及利用秸秆原料的乙醇发酵性能北大核心CSCD

木糖利用能力和抑制物耐受能力优良的工业酿酒酵母菌株以及合理的糖化发酵工艺是纤维素燃料乙醇生产的两个关键.对一株工业酿酒酵母菌的磷酸戊糖途径转醛醇酶基因TAL1进行差异过表达,评价其在8种典型抑制物存在时对菌株利用木糖的影响;利用TAL1过表达菌株研究油菜秸秆预处理物料中抑制物含量高低对分步糖化发酵（SHF）、预糖化-同步糖化发酵（P-SSF）和同步糖化发酵（SSF）3种不同糖化发酵方式发酵过程的影响,探讨高固含量发酵的可行性.结果显示,TAL1基因过表达提高了菌株的木糖代谢能力和对8种典型抑制物的耐受能力,适度过表达菌株表现最优,有抑制物存在时的木糖消耗速率提升了20%-70%.秸秆预处理物料中抑制物总含量约为4 g/L时,SHF无法正常发酵,SSF的乙醇收率接近70%,略高于P-SSF;当物料中抑制物总含量下降到约2 g/L时,3种方式都能顺利发酵,SSF表现最优,96 h时的乙醇收率为86.5%,但SSF（96 h）和P-SSF（112 h）所需糖化发酵总时间远低于SHF（144 h）;总固含量约为25%的分批补料-同步糖化发酵（FB-SSF）的乙醇浓度和乙醇收率分别达到54.2 g/L和67.2%.上述结果表明,TAL1基因适度过表达提升了菌株的木糖发酵和抑制物耐受能力,菌株已具备比较优秀的发酵和耐受抑制物的能力;预处理物料中抑制物含量相对较高时采用SSF或P-SSF工艺,而抑制物浓度相对较低时,3种糖化发酵方式都可以采用,但SSF所需发酵时间最短,生产能力最高.     

耐碱性木聚糖酶产生菌的筛选及发酵条件研究

利用刚果红透明圈法,从造纸厂碱性土壤中筛选到一株木聚糖酶生产菌株X24-14,经培养特性研究及16S rDNA序列分析,初步认为该菌属于纤维菌属(Cellulosimicrobium).经发酵条件优化,该菌在麸皮60 g/L,蛋白胨10 g/L,K2HPO4 7.0 g/L, pH 8.5,接种量为5%, 37 ℃, 200 r/min的条件下发酵培养108 h,可达到最大活力,为2 204 u/mL. 该酶最适反应温度为60 ℃;具有较宽的pH作用范围,在pH 4.2～9.4范围内能保持较高的酶活力,在pH 9.4条件下,仍具有80%的酶活力; pH稳定性较好,在4 ℃、pH 11.0的条件下处理24 h仍能保持75%的酶活力.图3表1参12     

接种量对泔脚发酵产氢的影响

接种量对泔脚的发酵产氢会产生很大的影响。以经热预处理(80℃,15min)的城市生活垃圾厌氧消化污泥为接种物,以850W、4min的微波+pH9.0预处理的泔脚为发酵底物,考察了40%、50%、60%、70%、80%、90%的接种量对泔脚中温(36℃)批式发酵产氢的影响。结果表明:过低的接种量(40%、50%、60%)下,泔脚的发酵产氢能力较差;而较高的接种量(70%、80%、90%)尤其是80%、90%的高接种量对泔脚的发酵产氢更为有利。然而,接种量越大,反应器的利用效率越低。因此,80%的接种量为泔脚发酵产氢的最佳接种量,其产氢延迟时间λ、最大比产氢率、产氢率、生物气中氢气的最高体积含量分别为4.22h、22.77mL/(gVS·h)、194.04mL/gVS、44.2%。     

Streptomyces sp. WJS-825产谷氨酰胺转胺酶发酵条件优化及中试

应用五因子二次正交旋转回归试验设计,建立了微生物谷氨酰胺转胺酶 (TG)发酵生产过程中以酶活力和菌体细胞生长量作为目标函数的数学模型,并以此模型对链霉菌 (Streptomycessp. )WJS-825菌株发酵生产TG的培养条件进行优化,确定了影响TG生产的主要因子及其最适取值为多价胨 2. 1%、可溶性淀粉 1. 5%、初始pH 7. 0及培养温度 30℃.以该优化工艺条件进行了 5L发酵罐小试和 200L发酵规模的中试生产.结果表明,在中试发酵生产中使用以豆饼粉部分替代多价胨的经济性发酵优化培养基,以及发酵过程中在线监控pH、溶氧系数等多项发酵调控参数,并分段控制pH、温度、通气量和搅拌转速以及进行适时的流加补充碳源,该菌株生长繁殖能力强、产酶效果好,TG活性达 3. 2u/mL,而且连续重复的中试发酵生产试验的TG产量均稳定在 3. 2u/mL以上. 图 2表 3参 15     

鲜甘薯原料的运动发酵单胞菌快速乙醇发酵条件

对运动发酵单胞菌232B同步糖化发酵(SSF)鲜甘薯快速生产燃料乙醇的条件进行了研究.通过单因素试验和正交试验获得了乙醇发酵的最佳参数为:初始pH值6.0～7.0,硫酸铵5.0 g/kg,糖化酶量1.6 AUG/kg淀粉,初始总糖浓度200 g/kg,接种量ψ=12.5%.经过21 h发酵,乙醇浓度为95.15 g/kg.发酵效率可达94%.同时对不灭菌发酵也进行了研究,发酵效率可达92%.残糖的HPLC分析结果说明,发酵液中已没有葡萄糖存在,经酸水解后又出现了葡萄糖、半乳糖、甘露糖等成分,说明发酵结束后的残糖是多种低聚糖.图4表4参19     

利用豆粕和小麦秸秆生产多肽的固体发酵工艺条件优化

以豆粕、小麦秸秆和糖渣为主要原料,以产脂肽细菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)XZ-173为接种剂进行一系列固体发酵试验.通过基质筛选和单因素试验研究固体发酵基质组成、装料量、发酵温度、初始pH、发酵时间、含水率和接种量对多肽产量的影响,通过响应面优化法优化氮源和碳源及二者比例.结果表明:(1)固体发酵产多肽最佳基质组成为豆粕63.03%,小麦秸秆粉33.00%,糖渣1.93%,酵母提取物2.04%,外加无机盐溶液10.18%(V/m);(2)最佳发酵条件为含水率50%(用pH 7.5的去离子水配制),接种量10%(V/m),发酵温度30℃,恒温发酵48 h;(3)在最优条件下多肽实际产量为110.06 mg/gds(gds表示每克初始干物质),与预测值109.85 mg/gds吻合(R~2=0.9742).本研究在实验室水平上得到的以农产品加工副产品和作物秸秆为主要原料生产多肽的固体发酵优化工艺可为农业废弃物的资源化和多肽的工业化生产奠定基础.     

深黄伞形霉(Umbelopsis isabellina)华2-1产油发酵培养条件优化

为开发微生物油脂资源,从富含油脂的土样中分离获得一株产油脂微生物——深黄伞形霉(Umbelopsisisabellina)华2-1,油脂含量达48.60%.采用单因素和正交实验方法,对深黄伞形霉华2-1的发酵培养条件进行优化研究.优化的培养条件为:葡萄糖100 g/L,酵母粉3 g/L,接种量为20%,初始pH值为5.0～6.0,MgSO4.7H2O和KH2PO4的添加浓度分别为0.5 g/L和2 g/L,培养温度为31℃,最佳发酵培养时间为168 h.华2-1在优化发酵条件下可获得菌体生物量、油脂产量和油脂含量分别为45.86 g/L、24.47 g/L和59.53%,较优化前分别提高了21.48%、33.42%和22.49%.因此,深黄伞形霉华2-1作为微生物油脂生产的新资源具有广阔的应用前景.     

温度和发酵时间对厨余垃圾发酵产乳酸及其光学异构体的影响

通过间歇实验,探讨了温度和发酵时间对非灭菌的厨余垃圾发酵产乳酸及其光学异构体的影响.结果表明,控制温度在35℃时,发酵液中乳酸浓度远高于45℃和55℃,发酵120h后,总乳酸的产率和产量最大,分别达到0.59gL-1d-1和0.62gg(VS)-1,以有机碳表示的乳酸占发酵液中总有机碳的78%;控制发酵时间小于120h,L-乳酸在35℃、45℃和55℃三个温度条件下都是主要的异构体形式;35℃和55℃时,发酵72h后,随着发酵时间的延长,L-乳酸浓度在总乳酸中的比例呈下降趋势;45℃时,L-乳酸浓度随着发酵时间的延长逐渐增加,L-乳酸在总乳酸中的比例在发酵144h后达到97%.图4表1参21     

水华蓝藻厌氧发酵工艺技术研究

以太湖水华蓝藻为底物,用改进的CSTR(continuous stirred tank reactor)工艺,研究了不同有机负荷条件下蓝藻厌氧发酵相关参数与蓝藻藻毒素的去除效果.结果表明:在(35±1) ℃条件下,逐步提高有机负荷,系统运行稳定,有机负荷最高可达3.53 kg·m-3·d-1,此时最大容积产气率达0.89 m3·m-3·d-1,COD去除率在70%左右,甲烷体积分数达60%以上.不同负荷条件下,出料中藻毒素(MC-RR、MC-LR)检测均为阴性,已达无害化处理要求,表明该工艺可以有效处置水华蓝藻,实现能量回收与无害化处理的目标.     

Clostridium papyrosolvens厌氧发酵产氢研究

采用分批培养研究了从高浓度厌氧产氢活性污泥中筛选的优势菌种Clostridium papyrosolvens的发酵产氢能力.结果表明:该菌有较强的高糖耐受性和耐酸性,当葡萄糖浓度为30 g/L、pH阶段性控制在4.5时,发酵44 h葡萄糖消耗率为83.7%,总产气量达到3 081.3 mL/L,最高产气率为187.5 mL L-1 h-1,氢气含量为67.5%,比产氢率达1.06 mol(H2)/mol(葡萄糖).研究中选用了廉价的发酵产氢培养基,以玉米浆为氮源,以还原铁粉作氧化还原电位控制剂,省去了牛肉膏、蛋白胨等昂贵氮源以及L-半胱氨酸、维生素、无机离子等高成本组分,显著降低了纯菌发酵的培养基成本,获得了较好的产氢效果.图5表2参23     

厌氧好氧一体化生物反应器处理发酵废水的研究

采用新型厌氧好氧一体化生物反应器对发酵废水进行了中试处理研究.试验结果表明,系统总有机负荷最高可达到8.88kg(COD)m-3d-1,系统去除率稳定在88.10%~96.88%,说明反应器处理效率高,抗冲击能力强.反应器结构合理,利于保持丰富、高活性的微生物,反应器厌氧区颗粒污泥TS高达83.9gL-1,VS/TS为56.9%~57.4%,比产甲烷活性为280~350mL(CH4)gvss-1d-1;好氧区固定化微生物TS高达64.03gL-1载体,VS/TS为94.02%~94.30%.反应器各功能区对废水的降解过程分析,说明反应器厌氧区和好氧区一体化结构合理,可将废水逐级降解,从而保证整个系统的处理效果.图8表4参11     

利用醋糟开发植物栽培基质的发酵技术

对利用酿造工业废弃物醋糟开发有机栽培基质的发酵技术进行了试验研究。结果表明：通过加入鸡粪、粉煤灰、石灰水和尿素等碱性物质调节酸度后，能促进醋糟正常发酵，发酵后的产物理化性状均适合于作植物栽培基质。     

秸秆干发酵沼气增产研究

研究了复合菌剂预处理秸秆和添加沼气发酵促进剂对秸秆干发酵的影响.结果表明,秸秆经菌剂预处理后的产气量比不加菌剂预处理(对照)提高29.54%;在菌剂预处理过的秸秆中加入促进剂,其产气量比对照提高35.28%,比单纯菌剂预处理提高4.43%.另外,菌剂预处理过的秸秆的TOC降解率和纤维素降解率分别比对照高136.32%和47.68%;秸秆经菌剂预处理后再添加促进剂的TOC降解率、纤维素降解率分别比对照高169.58%和49.62%,比单纯菌剂预处理高14.07%和3.36%.图2表1参8     

产甘油假丝酵母补料发酵中的甘油合成衰减

为揭示产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes补料发酵后甘油合成衰减机理,以指导甘油合成及菌株改造,对补料发酵后甘油的生成情况、葡萄糖的消耗情况、细胞内的代谢流量变化以及代谢途径关键酶活力变化进行了研究.结果表明,补料发酵后葡萄糖的代谢流量分布发生变化,流向HMP途径和甘油合成途径的流量分别降低48%和33%,更多的碳流通过EMP途径形成副产物;胞浆3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)的活力下降,而丙酮酸激酶(PYK)活力上升.补料发酵后甘油合成关键酶ctGPD酶活力低下,流向甘油合成途径的碳流减小,还原力供给受影响,这些因素共同作用引起了补料发酵后甘油合成的衰减.     

固定化枯草芽孢杆菌发酵生产捷安肽素

采用吸附固定化细胞技术发酵生产捷安肽素.首先对7种不同的吸附性固体载体进行筛选,发现木屑作为载体效果最好;然后通过正交优化实验和单因素实验确定载体木屑的最佳条件为:粒度0.5～0.6 mm,添加浓度10 g L-1发酵液.为避免吸附法固定的菌体细胞从载体上脱落,尝试在木屑固定化细胞体系中加入粘稠剂以增强吸附性能,运用单因素实验确定了粘稠剂的种类和浓度,即为15 g L-1海藻酸钠.最后应用响应面方法优化固定化细胞发酵培养基及培养条件,结果表明:接种量为10%、黄豆粉水解液总氮浓度为1.7 g L-1发酵液、葡萄糖浓度为33.7 g L-1发酵液时捷安肽素的生物效价最大,达到7 282.08 U,比非固定化细胞培养提高了53.9%.图3表7参17     

酿造污泥的农业利用对地下水的影响

本文通过模拟渗滤实验对酿造残渣(NovoGro)在天津地区农业利用可能产生的环境影响-氮素对地下水的潜在污染———进行了比较系统的研究。结果表明,氮素(主要是NO3-)在土壤中的迁移和积累行为在不同作物和土壤条件下是有差异的。在水田中施用NovoGro,不会引起水体的氮素污染问题;旱田(小麦)表层土壤和下渗水中NO3--N的含量则随NovoGro的施用量的增加而增加,当施用量达到45t/hm2时足以造成地表径流和地下水的NO3--N污染。     

米曲霉产氨基酰化酶条件及部分酶学性质研究

通过单因子和多因子摇瓶正交优化试验,确定了米曲霉液态发酵产氨基酰化酶的最佳发酵条件.优化发酵培养基组成(ρ/gL-1):葡萄糖40,蔗糖10,可溶性淀粉20,蛋白胨2.5,马铃薯液1000mL,pH自然.培养基装量50mL/250mL三角瓶,接种量4%.培养温度30℃,转速100r/min,发酵时间42h.每50mL培养物的总酶活由优化前的2627u提高到7338u,是优化前的2.79倍.研究了米曲霉氨基酰化酶的部分酶学性质.该酶催化反应的最适pH为7.0,最适温度为40℃,低浓度的Co2 (5×10-4mol/L)对酶活激活作用显著.图5表2参8