地衣芽孢杆菌2709和 6816碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及序列分析

用PCR方法从地衣芽孢杆菌 2 70 9和 6 816中扩增了碱性蛋白酶基因 (apr1和apr2 ) ,扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体 pET -2 8a中 ,构建成重组分泌型表达载体pAPR1、pAPR2 .pAPR1、pAPR2中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM 10 9(DE3)中得到表达 .SDS -PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为 30 .5× 10 3 ,同核酸序列测定所推导的值相符 .表达产物分别占细胞总蛋白的 8.0 %和 7.5 % .2 70 9重组菌所得酶活为 12 10u/mL ,6 816重组菌所得酶活为 1175u/mL .研究发现 ,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时可能存在前肽自动脱落的现象 .同时 ,对地衣芽孢杆菌 2 70 9碱性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析 ,发现与地衣芽孢杆菌 6 816碱性蛋白酶基因的同源性为 98% .图 5参 11     

利用枯草芽孢杆菌株间原生质体融合进行差异表型遗传重组…

枯草芽杆菌Ｄ１００和枯草芽孢杆菌ＴＮ１７９同为枯草芽孢杆菌Ｋｉ－２－１３２的两个不同菌株，具有明显的表型差异－它们的融合子Ｄ２７９兼有两亲本的遗传性状，能够在常规培养条件下稳定遗传，但经过ＥＭＳ处理后，即产生形状与各自亲本相似，且伴随菌落颜色，菌体形状和一些主要变化的分离物，从这些分离物的表型改变，得出了基因及连锁的一些遗传信息。     

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶的化学修饰

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶(QDAPr)具有良好的低温适应性,且与常见的增稠剂及表面活性剂有良好的配伍性.因此该蛋白酶在日用化学领域,尤其是低温洗涤领域,具有广泛的应用价值.为研究其结构与功能之间的关系,用EDC、PMSF、N-AI、2,3-丁二酮等8种化学修饰剂修饰该低温碱性蛋白酶,然后检测残余酶活力,借以研究酶分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系.结果表明,羧基、丝氨酸、ε-氨基、巯基等残基与酶活性无关;而色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度下降,说明色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基是酶活力所必需的基团.精氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的轻微下降,说明精氨酸对酶活性具有一定贡献,但不处于活性中心.图5表2参18     

原生质体电诱导融合构建去除重金属的高效菌

研究了采用原生质体电融合技术构建高效的重金属去除菌;对影响电融合效率的几个参数,以及融合子的生长条件、除铬性能和遗传稳定性等方面进行了考察;确定了进行电融合的最佳条件,并选出 1株最好的融合株R32. 实验结果表明:R32不论是在处理低浓度还是高浓度的铬液时,其去除率和还原率都明显高于 2株亲本菌,处理低浓度含铬废水时,去除率和还原率可达到 100%;处理高浓度含铬废水(200mgL-1 )时,还原率仍可达 50%以上. 经过多次传代后,R32的除铬能力保持稳定. 当投菌量>10gL-1 (湿重)时,其去除率和还原率都在 80%以上. 正交实验结果显示,pH和Cu2 浓度对R32的生长影响都不大,这些特点都有利于R32在实际含铬废水处理中的应用. 图 4表 3参 14     

原生质体转化构建有机磷农药降解工程菌

降解有机磷农药甲胺磷、敌敌畏和对硫磷的菌株地衣芽孢杆菌 Ｐ１２（ Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ） 经溶菌酶处理获得原生质体,加入降解乐果的供体菌 Ｇ１ Ｄ Ｎ Ａ,经ρ（ Ｐ Ｅ Ｇ６ ０００） ＝ ３００ ｇ Ｌ－ １ 诱导,在液体再生培养基中振荡培养ｔ＝ ２０ ｈ ,使其恢复细胞壁后,离心收集菌体,涂布于含乐果的基础培养基上,经筛选得一转化子 Ｊ Ｐ Ｚ．其菌落形态明显不同于出发菌株,乐果平板连续传代１０ 次,性状保持稳定．在θ＝ ３０ ℃,１００ ｒ／ｍｉｎ 的培养条件下,３ ｄ 内对ρ（ 甲胺磷） ＝ ０ ．５ ｇ Ｌ－ １ ,ρ（ 敌敌畏） ＝ ０ ．２ ｇ Ｌ－ １ ,ρ（ 对硫磷） ＝ ０ ．１ ｇ Ｌ－ １ ,ρ（ 乐果） ＝ ０ ．３ ｇ Ｌ－ １ 的降解率分别为 Ｒｄ ＝ ７９ ．１ ％ ,４６ ．７ ％ ,２９ ．４ ％ 和４６ ．４ ％ ．     

通过原生质体技术提高泰乐菌素产生菌的产量

从泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌０２８－３菌株出发，通过ＮＴＧ多次诱变，获得一株泰乐菌素产量提高２倍以上的突变株Ｈ１８８．再以原生质体再生和原生质作诱变后再生的手段，经过连续两轮处理，获得两株突变株：Ａ１１７和Ｄ８５．在最佳发酵培养基条件下，它们的泰乐菌素产量比Ｈ１８８分别提高６．５倍和５．５倍以上．     

利用枯草芽孢杆菌株间原生质体融合进行差异表型遗传重组分析的研究

枯草芽孢杆菌D100和枯草芽孢菌TN179同为枯草芽孢杆菌Ki－2－132的两个不同菌株，具有明显的表型差异．它们的融合子D279兼有两亲本的遗传性状，能够在常规培养条件下稳定遗传．但经过EMS处理后，即产生形状与各自亲本相似，且伴随菌落颜色、菌体形状和一些生理变化的分离物．从这些分离物的表型改变，得出了基因及连锁的一些遗传值息．     

红豆草与苜蓿原生质体融合过程中小泡的形成

通过高钙离子浓度、高pH值方法结合PEG处理诱导红豆草羟脯氨酸抗性系和苜蓿根癌农杆菌转化系原生质体融合,融合机制表现为两种形式,第一种为相连膜在中间部位形成一个大的小泡,第二种为随相连膜的解体产生很多较少的泡状结构,融合过程中形成的小泡直接来自凝集膜,而不是亚显微小泡相互融包的产物,温度明显影响原生质体融合的频率和速度,甘油和二甲基亚砜可以防止膜破裂,从而促进原生质体融合,培养20d以后,在选择培养基得到含10－20个细胞的细胞团。     

抗真菌多肽——捷安肽素高产菌的选育

从新疆棉株上分离得到一株细菌ZK ,经培养物性状和生理生化鉴定 ,确定该菌为芽孢杆菌属 (Bacillussp.)菌 ,其代谢产物为一种抗病原真菌的肽类物质———捷安肽素 .以此株菌作为出发菌株 ,进行紫外线、微波和亚硝基胍诱变 ,诱变处理后获得高产突变株Mv2 8,在摇瓶试验中 ,该变异株产捷安肽素活性比出发菌株提高 31.6 % .图 5表 5参 12     

芽孢杆菌发酵产碱性果胶酶温度控制策略

采用自行筛选获得一株产碱性果胶酶芽孢杆菌WSH03-09,在小型发酵罐中研究了不同温度对碱性果胶酶分批发酵的影响,结果表明,在恒定39℃条件下,可获得最高酶活5．39u／mL,各温度条件下的菌体干重相差不多,最终均能达11．5g／L左右;在发酵前期,控制温度41℃时最有利于菌体的生长,而在产物合成期,控制37℃有利于获得较高的产物合成比速,在此基础上,提出分阶段温度控制策略,采用此温度控制策略进行碱性果胶酶的发酵,碱性果胶酶酶活达5．99u／mL,比采用单一温度下的最大值提高了11％,其它各项指标也有较大提高．图6表1参6     

一株碱性果胶酶高产细菌的分离、系统发育分析和产酶条件的初步优化

从腐烂的苹果表皮筛选到一株碱性果胶酶的高产菌株,命名为WSHB04-02.分离菌株为革兰氏阳性细菌,有芽孢,菌落颜色为乳白色.分离菌株WSHB04-02的16SrDNA全序列分析表明,该菌株与Bacillussubtilus具有99%的相似性,并与其他13株产碱性果胶酶菌株的16SrDNA结果进行同源性分析,并构建系统发育树.发现菌株WSHB04-02在不含果胶类物质与Mg2 的培养基上能高产碱性果胶酶,在优化的培养条件下,碱性果胶酶的酶活达到34U/mL,在国内还未见报道.图6表2参15     

根际微生物耦合降解系统的构建及其对蒽污染土壤的修复

摘要将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的黄麻土生根际优势菌Tu-1B分别与葸高效降解菌An-2和生物表面活性剂产生菌P7-50进行原生质体电融合，得到两株具有荧光标记的融合子Tu-An和Tu-P．将二融合子接种于植物根际土壤，构建根际微生物耦合降解系统，：在40d时该系统的最大降解率为96％．对根际土壤中的Tu-An融合子进行了检测，结果表明融合子在根际能稳定旺盛生长．图3表4参18