苏云金芽胞杆菌生物活性成分研究进展

自1901年Ishimata从家蚕(Bambyx mori)中分离出第1株苏云金芽胞杆菌淬倒亚种(Bacillus thuringiensis subsp.sotto)以来,对苏云金芽胞杆菌研究已有百年的历史.现在国际上确认的苏云金芽胞杆菌菌株已有69个血清型[6],近40000株. 由于苏云金芽胞杆菌的巨大经济利益,不断地引起了广大科研人员和产品开发商的极大兴趣.到目前为止,科学家们已     

对甘薯茎线虫具有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌筛选及特性鉴定

为筛选对甘薯茎线虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株,提取12株供试Bt菌株的晶体蛋白,溶解后加入到甘薯茎线虫悬浮液中,统计3 d和7 d后甘薯茎线虫的死亡率.经初筛和复筛后得到一株对甘薯茎线虫具有高毒力的Bt菌株YBT-008,其对甘薯茎线虫的LC50值为203.76μg/mL.研究了YBT-008的生物学特性,结果表明,YBT-008在LB培养基上培养约12 h后进入稳定期,并且伴随芽胞的形成产生卵圆形的伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明YBT-008可产生多种待鉴定的晶体蛋白类型,质粒检测显示该菌株有5条质粒条带.YBT-008的获得为利用Bt防治甘薯茎线虫提供了新型菌株和基因资源.     

苏云金芽胞杆菌苏云金素缺失突变株的筛选及特性研究

利用高温和SDS对苏云金素高产菌株CT-43-1c进行了质粒消除,筛选得到一株不产苏云金素的无晶体突变株BMB0806;并通过SDS-PAGE、高效液相色谱(HPLC)和脉冲电泳(PFGE)分析了野生型菌株CT-43、出发菌株CT-43-1c和突变株BMB0806杀虫晶体蛋白的组成、苏云金素的产量和质粒图谱之间的差异.结果表明,突变株BMB0806与菌株CT-43和CT-43-1c相比,分别缺失了3个和2个大质粒,从而不再产生苏云金素和由cry1B基因编码的分子量为140×103的杀虫晶体蛋白.进一步分析三者质粒图谱后发现,突变株BMB0806中苏云金素的缺失和cry1B基因所在的大质粒A直接相关.图5参12     

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶的分离纯化及酶学性质

以苏云金芽胞杆菌为材料 ,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE - 32离子交换柱层析初步纯化 ,获得比活力为15 0 .5Umg-1的酶制剂 .研究酶催化胶体几丁质水解的反应时间和酶量对酶活力的关系 ,探讨酶催化胶体几丁质的最适条件 .温度和 pH对酶活力的影响和酶的热稳定性及酸碱稳定性的结果表明 :酶催化胶体几丁质水解的的最适pH为 5 .6、最适温度为 5 8℃ .该酶在pH 4 .5～ 6 .5区域稳定 ,而在pH >8能很快失活 ;在 5 5℃以下处理 30min ,酶活力保持不变 ;高于 5 5℃ ,酶快速失活 .图 5参 11     

苏云金芽胞杆菌聚γ-谷氨酸-明胶微胶囊剂制备及其抗逆性

晶体蛋白是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)的主要杀虫成分,其抗热处理能力及抗紫外照射能力差,造成在生产及使用过程中易失活,防效不稳定,残效期短.为改良Bt剂型,探讨了以聚γ-谷氨酸(γ-PGA)-明胶为囊壁材料的复凝聚相分离法制备Bt微胶囊剂的加工工艺,并对制得的Bt微胶囊剂进行了抗热及抗紫外能力分析,比较了Bt成囊前后的杀虫活性和芽胞存活率.结果表明,经紫外(30 w)照射4 h,Bt微胶囊和Bt原粉对棉铃虫3龄幼虫的相对致死率分别是53.57%和16.60%,芽胞存活率分别是46.63%和6.90%;于80℃处理100 min后,对棉铃虫3龄幼虫的相对致死率分别是43.42%和26.11%;于100℃处理15 min,Bt微胶囊和Bt原粉的芽胞存活率分别是72.53%和25.50%.Bt微胶囊化可显著提高Bt对热处理及紫外照射的抗逆性.图4表2参13     

苏云金芽胞杆菌YBT-1520中SigL及其增强子结合蛋白的结构与功能分析

为揭示SigL及其增强子结合蛋白(EBPs)在苏云金芽胞杆菌(Bt)中的调控功能,在全基因组测序的基础上,采用生物信息学方法,对YBT-1520菌株的SigL及其EBPs的结构和功能进行深入分析.结果表明,YBT-1520基因组中存在1个SigL和6个EBPs,而且EBPs在结构上具有丰富的多样性,包含了EBPs的所有可能的结构域组织类型.SigL所调控的基因涉及11个假定的COG代谢途径,其中包括能量代谢、氨基酸代谢、翻译与细胞周期等.根据EBPs在基因组的位置推测,YBT-1520的EBPs参与γ-氨基丁酸代谢途径、精氨酸代谢途径、支链脂肪酸降解途径、多糖分解代谢等代谢途径的调控.本研究将为揭示Bt杀虫晶体蛋白大量表达的调控机制提供新的思路.     

利用 S-层蛋白CTC在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白PMGA1.2的可行性及其免疫原性,为研制能常温长期保藏和运输的禽用口服疫苗奠定基础.用部分pmga1.2基因(pmga1.2p)代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段,构建了2个融合基因ctc-pmga1.2p和csa-ctc-pmga1.2p(csa表csaAB操纵元,其与S-层蛋白牢固地锚定到细胞表面密切相关);将含融合基因的重组质粒电转化入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中,获得了2个重组菌株BCCG(含ctc-pmga1.2p和携带csaAB操纵元的质粒)和CG(含csa-ctc-pmga1.2p).血凝和血凝抑制试验结果显示,2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组蛋白PMGA1.2P;小鼠免疫学实验证实,2个重组菌株所展示的重组蛋白均具有免疫原性,其中,重组菌株CG的免疫效果优于BCCG.结果表明,苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可被用来研制热稳定性禽用口服疫苗.     

两种启动子对聚γ-谷氨酸降解酶基因在地衣芽胞杆菌中的加强表达效果

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种应用前景良好的生物高分子材料.比较了蔗糖诱导的枯草芽胞杆菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)启动子和地衣芽胞杆菌α-淀粉酶基因启动子对γ-PGA降解酶基因ywtD在地衣芽胞杆菌中加强表达的影响.分别用SacB基因启动子和α-淀粉酶启动子构建了穿梭表达载体pHY300-SYT和pHY300-PYT,通过电转化地衣芽胞杆菌WX-02获得重组子SYT和PYT.酶活测定结果显示SYT和PYT中γ-PGA降解酶基因ywtD得到加强表达,摇瓶发酵结果显示两个重组菌株的γ-PGA相对分子质量都由1 000 000~1 200 000降低为800 000~900 000,PYT的γ-PGA产量较对照菌株PLK提高了33%,由13.50 g L-1提高到17.97 g L-1,而SYT的γ-PGA产量则降低为10.85 g L-1.因此,α-淀粉酶启动子更适合于在地衣芽胞杆菌WX-02菌株中表达γ-PGA降解酶基因,从而获得高产低分子量γ-PGA的工程菌.     

我国土壤中苏云金芽孢杆菌的分离与基因型的鉴定

从我国20个省市采集176份土壤中分离出苏云金芽孢杆菌51株.以cry1,cry2,cry3,cry4,cry-n,cry7,cry8,cry11,cry13和cyt的引物作PCR分析.结果表明:4株含有cry4,12株含有cry7,4株含有cry8,4株含有cry1,2株同时含有cry1和cry2,27株无PCR产物.未检测到其它基因型.经电镜扫描伴胞晶体形态多种多样,主要有菱形、球形、方形、多边形和不规则形.图3表3参15     

地衣芽孢杆菌2709和 6816碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及序列分析

用PCR方法从地衣芽孢杆菌 2 70 9和 6 816中扩增了碱性蛋白酶基因 (apr1和apr2 ) ,扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体 pET -2 8a中 ,构建成重组分泌型表达载体pAPR1、pAPR2 .pAPR1、pAPR2中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM 10 9(DE3)中得到表达 .SDS -PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为 30 .5× 10 3 ,同核酸序列测定所推导的值相符 .表达产物分别占细胞总蛋白的 8.0 %和 7.5 % .2 70 9重组菌所得酶活为 12 10u/mL ,6 816重组菌所得酶活为 1175u/mL .研究发现 ,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时可能存在前肽自动脱落的现象 .同时 ,对地衣芽孢杆菌 2 70 9碱性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析 ,发现与地衣芽孢杆菌 6 816碱性蛋白酶基因的同源性为 98% .图 5参 11     

苏云金芽孢杆菌无质粒突变株BMB171的转化和表达性能

研究了苏云金芽孢杆菌无质粒突变株ＢＭＢ１７１的转化性能和表达ｃｒｙ１Ａｃ和ｃｒｙ１Ｃａ基因的性能．用ｐＨＴ３１０１、ｐＢＭＢ３０５、ｐＢＭＢ１７３６、ｐＢＭＢ６７１、ｐＢＴＬ１和ｐＨＶ１２４９等６种外源质粒电转化无质粒突变株ＢＭＢ１７１,其转化频率分别是Ｂｔ４Ｑ７、Ｂｔ４Ｄ１０和Ｂｔｉ．ＩＰＳ．７８／１１等３种常用受体菌相应最高转化频率的１０００、６．７、１２．５、６６．７、３５００和２倍,其每μｇＤＮＡ的最高转化子数达１０７．导入ＢＭＢ１７１的外源质粒的稳定性与其复制子类型和质粒大小有关．无质粒突变株ＢＭＢ１７１表达ｃｒｙ１Ａｃ基因的表达量高于对照受体菌Ｂｔ４Ｑ７,略低于Ｂｔ４Ｄ１０和Ｂｔｉ．ＩＰＳ．７８／１１,而ＢＭＢ１７１表达ｃｒｙ１Ｃａ基因的表达量高于这３种受体菌;对小菜蛾３龄幼虫和甜菜夜蛾初孵幼虫的毒力测定结果表明,ＢＭＢ１７１表达ｃｒｙ１Ａｃ基因的杀虫毒力高于Ｂｔ４Ｑ７和Ｂｔ４Ｄ１０,略低于Ｂｔｉ．ＩＰＳ．７８／１;而表达ｃｒｙ１Ｃａ基因的毒力高于这３种受体菌     

味精工业高浓度有机废水培养苏云金芽孢杆菌的研究

利用味精工业发酵废水进行了培养苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）以生产生物农药的实验研究.经过对废水成分分析和预处理、Bt菌种驯化、摇瓶机发酵配方正交优化实验和生物毒性测定,探讨了一条经济可行的工艺路线.该工艺在利用发酵废水生产生物农药时不会产生二次污染问题,具有较高的工业应用价值,对于其他发酵工业废水的资源化处理也有一定参考价值.     

BACILLUS SP. BT-7木聚糖酶基因克隆与鉴定

报道了从一株有较高半纤维素酶活性的Ｂａｃｉｌｕｓｓｐ．ＢＴ７克隆内切木聚糖酶基因的结果．以大肠杆菌ＸＬ１ｂｌｕｅ为宿主菌,采用水解圈检测法,在含有ＲＢＢ木聚糖（４氧甲基Ｄ葡萄糖苷Ｄ木聚糖Ｒｅｍａｚｏｌ亮蓝Ｒ）的平板上分离到能水解ＲＢＢ木聚糖的阳性克隆３个,对它们进行的限制酶作图和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明,它们属于３种不同的内切木聚糖酶基因     

有机溶剂对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶的影响

以苏云金芽孢杆菌(Bt)的发酵液为材料,经硫酸铵分级分离、DEAE-32离子交换柱层析分离,获得部分纯化的Bt几丁质酶(EC3. 2. 1. 14)制剂.研究了几种有机溶剂对Bt几丁质酶的影响.结果表明,甲醇、丙三醇、甲醛和戊二醛对几丁质酶有抑制作用;乙醇、丙醇、乙二醇和二甲亚砜在低浓度时对酶有激活作用,随着浓度的升高表现出抑制作用;二氧六环的浓度低于 5%时,对酶的影响不明显,而高于 5%时,对酶则有激活作用;丙酮对酶有激活作用. 图 1参 10     

短小芽孢杆菌A—30耐碱性木聚糖酶基因的分子生物学研究

采用PCR方法对短小芽孢杆菌A－30菌株的耐碱性木聚糖酶基因进行克隆。在木聚糖选择平板上用刚果红染色法筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的重组质粒进行酶切鉴定和测序。该基因在大肠杆菌中表达,过夜培养物胞外、胞内和周质空间的木聚糖酶酶活分别为0．159IUmL^-1、0.322IUmL^-1和0.007IUmL^-1。此木聚糖酶表现出较宽的pH作用范围,最适作用pH7左右,在pH9时仍有60％以上的酶活性。图4参14     

大凉疣螈脑源性神经营养因子(BDNF)基因的克隆与序列分析

大凉疣螈 (Ｔｙｌｏｔｏｔｒｉｔｏｎｔａｌｉａｎｇｅｎｓｉｓ)属于两栖纲有尾目蝾螈科 ,仅分布在我国四川省西南部 ,活动范围狭窄 ,数量有限 ,是我国二级保护动物[1] .两栖动物在生物进化中是承上启下的关键动物 ,它们开启了脊椎动物登上陆地的历史 ,而且是真正陆生脊椎动物—爬行动物的祖先 ,其生理、结构等方面与鱼类和爬行类都有着明显的差别 .脑源性神经营养因子 (ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＢＤＮＦ)是神经营养因子家族的一员 ,ＢＤＮＦ在脊椎动物胚胎神经系统的发育、分化及在成体神经系统维…     

解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达

利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸测序结果完全一致 ,说明克隆到的基因确实是豆豉溶栓酶基因 .同源性分析表明 ,DFE成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为 80 .0 %和 86 .5 % ,这提示豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶 .将表达质粒pET Nde转化E .coliBL2 1(DE3)中 ,IPTG可诱导表达大量的DFE融合蛋白 ,占菌体可溶性蛋白的 4 0 % ,主要以包涵体的形式存在 .图 3表 1参 19