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利用AFLP对DNA碱基序列分辨率高的特性,研究纯培养条件下染料对黄孢原毛平革菌(P. chrysosporium)菌株DNA的损伤效应.在对黄孢原毛平革菌(P. chrysosporium)AFLP最佳引物筛选的基础上,通过分析最佳引物扩增结果中DNA相似性、染料浓度与DNA相似性关系以及构建UPGMA相似性树状图,评价染料对P. chrysosporium DNA损伤效应.结果表明, AFLP法可较好反映染料对DNA损伤效应,在优选的3种引物组合中, E-AAC/M-CAA引物组合AFLP扩增效果最好,共获得35条DNA扩增条带,其中有12条具有特异性,多态性比率34.3%;在进行DNA相似性分析和UPGMA法聚类分析后发现, AFLP技术较好地表达了DNA相似性与染料浓度的正相关关系,并且显示P. chrysosporium对染料损伤效应敏感,染料浓度不宜高于50mg/L,当染料浓度达到300mg/L即可对P. chrysosporium产生较大损伤作用,使之基本丧失原有的处理功能. 相似文献
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以大肠菌群的lacZ基因为靶基因,建立一种快速、稳定、灵敏、特异的微滴数字聚合酶链式反应(Droplet Digital Polymerase Chain Reaction,ddPCR)定量检测方法。对ddPCR反应体系中试剂浓度、退火温度等条件优化筛选的同时,考察了方法的线性范围、精密度和定量限。最终确定反应体系中的最佳引物和探针浓度分别为0.2和0.5μmol/L,最佳退火温度为56℃。大肠菌群lacZ基因组DNA浓度范围为3.95~7.80×10~4拷贝(copies)/20μL ddPCR反应液时,方法的线性关系良好(R~2=0.999)。文章所建立的方法可检出每微升单个拷贝数的大肠菌群lacZ基因组DNA,且具有快速测定、灵敏度高、特异性强、重复性良好等特点,为建立水污染早期应急机制提供了重要的参考价值。 相似文献
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Real Time PCR研究进展及其在海洋病原生物检测中的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
Real Time PCR,即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法,目前已广泛应用于分子生物学研究的各个领域.Real Time PCR技术秉承及发展了普通PCR的快速、高灵敏度检出等优点,同时克服了普通PCR不能准确定量、容易污染等缺点,无需在反应结束后通过电泳操作确认扩增产物.目前,Real Time PCR可设计多对引物在同一反应体系中同时对多个靶基因进行扩增,实现多莺实时定量检测.Real Time PCR使PCR技术发生了质的飞跃,扩展了PCR技术的应用范畴,是一种具有划时代意义的技术.本文主要介绍Real Time PCR的主要原理、解析方法、技术发展趋势及其在海洋病原生物检测方面的应用. 相似文献
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研究不同引物对PCR-DGGE和PCR-RFLP技术分析污泥群落结构的影响,选取8对通用引物扩增16S rDNA不同可变区序列并对细菌多样性进行DGGE分析,也选取11对通用引物扩增16S rDNA片段并对细菌多样性进行RFLP分析.通过分析PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱、DGGE图谱和酶切图谱,评价不同引物的扩增效果及其对污泥群落多样性的表征能力.结果表明,采用不同引物进行污泥群落结构DGGE分析或RFLP分析时,污泥群落多样性差异显著.PCR-DGGE分析中,引物B341F/B534R(V3区)分析效果较好,条带较丰富,能够充分反映污泥群落多样性.PCR-RFLP分析中,引物27f/8f和1500R扩增效果较好,酶切位点较多,酶切图谱条带丰富,差异性显著,能够充分表征污泥群落多样性.因此,活性污泥细菌多样性分析时,PCR-DGGE分析较优的引物为B341F和B534R,PCR-RFLP分析较优的引物为27f/8f和1500R. 相似文献
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通用引物PCR方法在地表水病原菌检测中的应用 总被引:8,自引:4,他引:4
为了探索通用引物PCR方法在地表水病原细菌检测中的应用价值,利用16S rRNA基因的高度保守性,设计并合成细菌的通用引物,采用合成的引物扩增参考菌株及西安市区不同地表水样,并对PCR产物分别进行序列测定及序列同源性分析,同时检测水样中的细菌总数和粪大肠杆菌浓度.结果显示,通用引物扩增4种参考菌株,320 bp处均可得到清晰的电泳条带,其特异性通过序列测定及同源性分析得到进一步验证;通用引物PCR可检出250 ng/L的埃希氏大肠杆菌标准菌株DNA,其PCR检测的灵敏度可达0.275 CFU/mL;用通用引物对西安市区不同地表水样进行PCR扩增,其中■河、兴庆湖、大唐芙蓉园北湖、北石桥污水处理厂出水样品320 bp处都得到了清晰的电泳条带,而黑河水样没有条带;与之相对应的粪大肠杆菌群检测结果显示,只有北石桥污水处理厂出水和兴庆湖水样有粪大肠杆菌检出. 相似文献
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基于引物的湖泊沉积物氨氧化细菌PCR扩增策略比较 总被引:3,自引:2,他引:1
PCR扩增是检测环境中β-变形杆菌纲氨氧化细菌(β-AOB)群落的主要方法,但是引物的敏感性和特异性对结果具有关键影响.本研究首先比较了2组常用的β-AOB 16S rRNA基因引物,结果显示,在扩增一组不同性质湖泊沉积物样品时,βAMO引物均获得明亮的单一条带,但CTO引物则未能全部扩增.克隆及序列分析证实,βAMO引物扩增获得的序列均不属于β-AOB所在的Nitrosomonadales目,而CTO引物扩增获得的序列来自β-AOB中的Nitrosomonas europaea/"Nitrosococcus mobilis"分支.采用变性梯度凝胶电泳方法,对4种不同引物组合PCR策略扩增所得产物进行分析,发现以βAMO或16S rRNA通用引物结合CTO引物的巢式方案可以提高扩增的效率,且β-AOB的群落轮廓与CTO引物直接扩增方案高度相似.这些结果表明βAMO引物具有较高的敏感性但特异性较低,而CTO引物则相反.因此,特定巢式扩增方案既可提高扩增的效率,也能真实反映湖泊沉积物中β-AOB的群落轮廓,是较为理想的β-AOB研究方法. 相似文献