麻疯树RAPD分析的影响因素

麻病树（Jatropha curcas L.）是一种具有广泛潜在用途的植物，为获得有重复性的RAPD分析结果，以对麻疯树的遗传多样性进行研究，本文作者对影响RAPD扩增结果的多个因素，包括缓冲体系成分，Taq酶、引物、模板浓度，PCR循环数等进行了研究，确定了反应的最适条件范围。     

从麻疯树胚乳中提取总RNA的快速方法

以麻疯树胚乳为材料,建立了一种适合于提取富含油脂、蛋白及多酚、多糖等次生物质的植物总RNA的方法.其中,提取液Ⅰ在1.5%SDS和400 mmol/L NaCl盐溶液条件下能快速有效破壁,酸酚/氯仿促进了细胞裂解以及油脂、蛋白的分离.而基于异硫氧酸胍法的提取液Ⅱ进一步强烈抑制Rnase的活性,确保RNA不被降解,并以5 mol/L高浓度NaCl溶液除去植物组织提取液中的多糖、多酚等次生物质,得到质量较好的总RNA样品.     

麻疯树种质资源遗传多样性的ISSR分析

采用ISSR分子标记技术对大戟科属麻疯树9个自然居群的遗传多样性水平和遗传结构进行了研究.用10个引物对9个居群共135个样品进行了扩增,共获得169条清晰的扩增位点,其中多态性位点164个.POPGENE分析结果表明,麻疯树居群具有丰富的遗传多样水平(多态百分率PPB=97.04%,Neis遗传多样性H=0.2357,Shannon信息指数I=0.3760).AMOVA分析表明,9个自然居群间遗传多样性出现了较大的遗传分化(Gst=0.5398)可能与其有限的基因流(Nm=0.4667)和遗传漂变有关;而居群内有限的遗传分化可能是由于麻疯树自交、近交占主导方式的繁育方式有关.并进行了麻疯树居群的聚类分析.图3表4参19     

凉山州金沙江干热河谷麻疯树群落结构

运用群落学调查方法对凉山州金沙江干热河谷的麻疯树群落进行了调查,依据气候、立地环境、海拔等因子划分了19个群落类型,分析了其种类组成和群落结构特征,并对其分布格局进行了探讨.结果表明:麻疯树天然林以高郁闭林分为主,分枝多,大多旱从状生长,天然更新良好,该区域是麻疯树的适生区域.图1表4参12     

麻疯树叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶基因的克隆和鉴定

根据几个已知的植物ω3脂肪酸脱饱和酶基因序列,利用RT-PCR和RACE技术从麻疯树中克隆了一条编码叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶的cDNA序列．对该序列的分析表明,该cDNA的编码区长1368bp,编码一个长度为455个氨基酸的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量（Mr）大小为52．1×10^3．同源分析显示,推测的氨基酸序列与其他植物叶绿体脂肪酸脱饱和酶具有很高的相似性．RT-PCR分析表明,该基因在麻疯树叶片中有着稳定的表达．此外,还通过酵母表达系统鉴定了该基因编码的酶的功能．对转基因酵母的脂肪酸组成分析发现,α亚麻酸在转基因酵母中积累．上述结果表明,该麻疯树cDNA编码了一个叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶．图4表2参21     

麻疯树胚乳类F-盒蛋白基因的克隆和载体构建

通过随机测序从本实验室构建的麻疯树胚乳cDNA文库中获得了一条与多种植物、动物F-盒家族(F-box)序列相似的EST序列,并进一步克隆得到含有完整编码框的cDNA全长和基因组序列(Jc-Fbl1).Jc-Fbl1cDNA全长1672bp,开放阅读框为1224bp,编码的蛋白质含有407个氨基酸残基.Jc-Fbl1推导的氨基酸序列与拟南芥、水稻中的同源F-box蛋白相似性分别为52%和75%;与人、斑马鱼、线虫等动物的F-box蛋白的相似性达到48%~56%.应用Pfam Search寻找功能结构域,发现其除了含有F-盒家族类结构域外,还有富含亮氨酸重复单位(leucine-rich repeats,LRRs).比对Jc-Fbl1的基因组序列和cDNA序列,发现Jc-Fbl1有两个长度分别为331bp和893bp的外显子和一个长362bp的插入序列,符合内含子的GT-AG法则,认为是Jc-Fbl1的内含子.水稻、拟南芥基因组中的同源序列也出现了这种两个外显子、一个内含子的结构,且内含子位置较为保守.为了进一步研究麻疯树F-box蛋白的功能,构建了同时含有Jc-Fbl1完整开放阅读框序列和绿色荧光蛋白标签的真核表达载体pBI121-Jc-Fbl1-GFP,并经酶切鉴定构建成功.     

麻疯树胚乳愈伤组织诱导及其污染消除

经过比较分析各种消毒方法,获得了较为理想的麻疯树(Jatrophacurcas)胚乳愈伤组织,并动态观察其类型、形态特征、增殖速率和形态发生能力,为麻疯树胚乳植株再生及愈伤组织和细胞培养生产药用成分奠定了基础.以麻疯树成熟胚乳为外植体进行愈伤组织的诱导,测试0.4mg/L的分裂素(BA、KT与TDZ)与2.0mg/L的生长素(IAA、IBA、NAA与2,4D)搭配组合的诱导效果.结果表明,对胚乳愈伤诱导效果而言,2.0mg/L的2,4D效果最好,NAA的效果次之,IBA又次之,IAA的效果最差.BA和KT诱导效果差异不显著,TDZ的添加可促进胚乳愈伤组织的诱导.选择适宜的消毒剂(种类、浓度)和消毒(处理)时间对胚乳外植体的接种成功具有至关重要的作用.在本试验所采取的灭菌方式中,用70%酒精处理30s,然后用10%NaClO处理25min,灭菌效果最佳,同时对胚乳外植体的生长影响最小.图3表1参23     

不同抗生素种类及浓度对麻疯树培养的影响

以麻疯树(jatropha ctrcas)的子叶、真叶、根及其对应的愈伤组织作为实验材料,研究各种抗生素对其生长的影响;在MS培养基中添加不同浓度和不同种类的抗生素,比较其对麻疯树不同外植体及对应愈伤组织生长的影响.方差分析和总体观察的结果表明,用于筛选转化植株的最佳抗生素是卡那霉素,其最佳抗性筛选浓度范围为10～25mg/L.表9参10     

麻疯树酰基载体蛋白的基因克隆、表达分析及原核表达

从麻疯树胚乳cDNA文库中筛选分离了一个编码酰基载体蛋白的cDNA序列,全长为806 bp,其开放读码框(ORF)长度为393 bp.编码130个氨基酸,该序列在GenBanl澄录号为EF179617,命名为JcACP.该基因编码的蛋白质相对分子质量(M)约为14.4×103,等电点为5.2,具有酰基载体蛋白的典型特征--含有4'-磷酸泛酰巯基乙胺辅基的结合位点.RT-PCR试验结果表明,该基因在麻疯树的叶、茎和种子中表达,以种子中的表达量最高,在根中不表达,种子萌发后其表达量随萌发进程递增,在96 h时表达量达到最高.结果表明,JcAcP在种子中的高度表达可能与种子萌发时的代谢活动有关.同时,将其在大肠杆菌中成功进行了原核表达.     

酶联免疫吸附法测定麻疯树核糖体失活蛋白

建立了一种检测麻疯树核糖体失活蛋白(Curcin)的简便、快速的酶联免疫吸附测定法(ELISA).ELISA条件优化试验结果显示:最佳条件为costar酶标板在紫外线下照射45 min后进行包被;抗原最适稀释度为1:640倍(2.5μg/mL);curcin抗血清最适稀释度为1:12 800倍;2%封闭用山羊血清封闭120 min;二抗最适稀释度为1:5 000倍.在此试验条件下检测curcin含量,得到回归方程y=31.722x+106.88,相关系数R2=0.993 3.Curcin浓度在0.08～11μg/mL之间,曲线呈良好的线性关系.本方法的最低检测限为0.08μg/mL.高、中、低3个浓度的添加回收率分别为95.56%、102.27%、98.40%,平均回收率为98.74%.板内和板间的平均变异系数分别为4.78%和6.71%.Curcin抗血清与2种大戟科同类蛋白均无交叉反应.利用本方法成功检测了麻疯树种仁及脱毒饼粕中的curcin含量.     

松毛虫遗传多样性研究中AFLP反应体系的建立

以油松毛虫为材料,对T4 DNA连接酶不同用量、预扩增中的Mg~(2+)浓度、dNTP浓度、引物浓度以及选择性扩增巾的预扩增产物稀释倍数、Mg2~(2+) 浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了比较分析.最终建立了适合松毛虫的AFLP反应体系.用优化的AFLP反应体系,以油松毛虫、赤松毛虫和马尾松毛虫为材料筛选引物,从81对引物组合中筛选出10对多态性高的引物组合.图9参17     

麻疯树种仁油粕脱毒

为获得经冷榨脱油后麻疯树油粕最佳的脱毒方法,采用超声提取,运用四因素三水平正交实验,考察了脱毒温度、脱毒时间、脱毒次数以及脱油后种仁与乙醇料液比对脱毒效果的影响.结果显示,最佳的脱毒方法为料液比8:1,40℃,超声3次,每次20 min.该方法处理后麻疯树油粕中佛波酯含量为0.011 mg g-1.脱毒后的麻疯树油粕对小鼠的急性毒性实验显示,小鼠无死亡,体重增长正常,未出现中毒症状,初步表明脱毒方法有效.图2表3参9     

麻疯树对铅胁迫的生理耐性研究

通过盆栽试验研究土壤中不同浓度（0、200、400、800、1 600和3 200 mg.kg-1）Pb胁迫对麻疯树生长、Pb吸收及相关生理指标的影响。结果表明,当土壤w（Pb）≥800 mg.kg-1时,麻疯树生长受到明显抑制;麻疯树植株不同部位Pb含量随土壤Pb浓度的升高而增加,且各部位Pb含量从高到低依次为根、叶和茎;当土壤w（Pb）≥800mg.kg-1时,麻疯树叶中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性,以及可溶性糖、脯氨酸和酸溶性巯基（SH）含量均显著提高,而谷胱甘肽（GSH）含量仅在土壤w（Pb）为3 200 mg.kg-1时才显著增加;可溶性蛋白质含量随Pb浓度的增加呈倒＂W＂型变化,当土壤w（Pb）为400 mg.kg-1时,其含量最大;上述生理指标的变化可缓解重金属Pb对麻疯树的毒害。主成分分析结果表明Pb胁迫处理的聚类结果与各处理麻疯树生物量及生理指标的变化规律相吻合,POD活性和可溶性糖含量对缓解重金属Pb毒害的贡献较大。可见,麻疯树在Pb污染土壤修复中具有一定的应用前景。     

麻疯树成熟胚乳再生植株及其气孔分析

对麻疯树成熟胚乳进行组织培养获得胚乳再生植株,并对其气孔进行分析.麻疯树成熟胚乳在25℃、12 h光照条件下培养7 d愈伤组织诱导完成,2,4-D浓度为2.0 mg L-1的MS培养基愈伤诱导效果最好,诱导率达89.29%.愈伤组织在含BAP的改良培养基上培养至黄绿色后转入分化培养基,在含IAA 0.25 mg L-1和ZT 1.5 mg L-1的WPM培养基上不定芽分化率达32.50%.将分化的不定芽从愈伤组织上剥离后转入含IBA、BAP和GA3的培养基上进行芽伸长培养.取胚乳不定芽叶片接种在含IBA 0.1 mg L-1、BAP 0.5 mg L-1和TDZ 0.5 mg L-1的MS培养基上诱导生芽后,再转入含IAA 0.25mgL-1、KT 0.5mg L-1、BAP 1.0 mg L-1和GA3 0.25 mg L-1的培养基上进行丛生芽的诱导,成芽率为85.2%.这些芽在含0.1 mgL-1 IBA的1/2 MS培养基上生根,大约有37.5%的芽生了根,平均有5.2条根系形成.与母本植株相比,再生的胚乳植株保卫细胞更大,且气孔密度减小.图2表6参24     

西南部分地区麻疯树种子油的理化性质及脂肪酸组成分析

从西南6个地区采集了麻疯树种子并分析比较了其生物学性状和种子油的理化性质及脂肪酸组成.所有样品的百粒重范围为41.80~71.39g,出仁率60.02%~81.43%,种仁含油率51.76%~57.93%,种子含油率31.07%~47.17%,不饱和脂肪酸含量74.89%~79.68%.其中永胜产麻疯树的种子品质最好,其出仁率为81.43%,种仁含油率57.93%,种子含油率47.17%,不饱和脂肪酸含量79.68%.攀枝花和宁南产麻疯树的种子品质次之.双柏和罗甸麻疯树的种子油酸值为0.81,在所有样品(0.81~9.46)中最低.对麻疯树种子及种子油性质的相关数据进行方差分析,结果表明,产地不同,麻疯树种子的生物学性质、种子油理化性质和脂肪酸组成都有一些差异.图2表3参18