青霉素G酰化酶突变体酶催化合成顺式头孢丙烯工艺优化

头孢丙烯作为第二代头孢菌素类抗生素,广泛应用于治疗敏感菌所致的上、下呼吸道感染,皮肤和皮肤软组织感染.酶法合成头孢丙烯与化学法相比更加绿色环保.本研究利用来源于大肠杆菌的青霉素G酰化酶(EC 3.5.1.11)野生型WT、突变体βF24A和αF146Y/βF24A合成顺式头孢丙烯(cis-cefprozil).通过比较不同突变体催化顺式头孢丙烯的合成效率,发现突变体βF24A具有较高合成活性及低水解活性.以顺式7-氨基-3-丙烯基-4-头孢烷酸(cis-7-APRA)和对羟基苯甘氨酸甲酯(D-HPGME)为底物合成顺式头孢丙烯.基于水相体系中合成条件优化,最适温度为25℃,最适pH为6.0,底物配比M_(D-HPGME):M_(cis-7-APRA)=3:1,酶用量2.6 U/mL,在此最佳条件下转化率可高达99%.突变体βF24A的固定化酶合成顺式头孢丙烯的转化率为99%,固定化酶连续使用60批次后,活性仍保持52%.本研究对突变体的筛选和酶催化条件的优化,为酶法合成顺式头孢丙烯奠定了基础.     

睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因插入失活突变体构建及降解特性分析半

睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)是革兰氏阴性菌,能够以各种类固醇化合物作为唯一碳源和能源,生物信息学分析发现睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因编码蛋白属于LuxR-type转录调控蛋白.利用同源重组原理构建teiR基因插入失活突变体C. mut,初步研究TteiR基因在类同醇代谢途径中的作用,以及对睾丸酮丛毛单胞菌关键降解酶3a-HSD/CR的表达影响.结果发现,teiR基因插入失活突变体C.mut在LB培养基中的生长速率不受影响,突变体C.mut抑制了teiR基因和关键降解酶3a-HSD/CR的表达,同时突变体C. mut丧失了以睾丸酮作为碳源进行生长的能力.结果表明teiR基因调节睾丸酮丛毛单胞菌类因醇代谢,同时teiR基因表达对3a-HSD/CR基因的表达是必需的.图7参14     

提高天冬氨酸β-脱羧酶在酸性环境中催化活力的分子改造

克隆了德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonas dacunhae)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶基因(Asd),实现其在Escherichiacoli中的异源表达,但该酶在酸性环境中活性较低,不利于工业生产.为通过定点突变技术提高该酶在酸性环境中的活力,选择底物通道区域内的5个氨基酸残基作为突变位点,构建6个突变体,随后分析突变体的酶学特性.结果表明,相比于野生型Asd,大多数突变体的比酶活显著下降,只有突变体N34D比酶活(71.67 U/mg)比野生型(65.95 U/mg)略高;另外,突变体N34D在3.5 pH 5.5酸性环境中的酶活力与野生型Asd相比均得到了提高,其中pH5.0条件下突变体N34D相对酶活达到82%,而野生型Asd相对酶活只有50%左右;而在pH 5.5-8.5范围内突变体N34D的酶活力与野生型相当.最后将突变体N34D应用于催化合成L-丙氨酸,在最适催化条件(pH 5.5)下,突变体N34D催化合成L-丙氨酸的产量是野生型Asd的1.5倍.本研究通过对德阿昆哈假单胞菌来源的N34位点进行突变,成功提高了天冬氨酸β-脱羧酶在酸性环境中的酶活力,并提高了其合成L-丙氨酸的能力,这对酶法生产L-丙氨酸具有重要的指导意义.     

扩展细胞色素P4502A6对大位阻底物的适应性

细胞色素P450酶(P450)的分子改造及其催化的生物转化是当前的两个研究热点.本研究以扩展P450 2A6的底物适应性为目标,通过尝试对P450 2A6酶进行N-端修饰提高表达量、筛选随机突变库以及点突变改变活性位点重要氨基酸残基等手段,在两个随机突变体中未筛选到功能突变体,但通过点突变重要氨基酸残基获得了新的突变体P450 2A6 (N297Q/I300A).该突变体具有比野生型和已报道的其它突变体更广泛的底物适应性,能够催化氧化大位阻底物6-苄氧基吲哚(6-OBzl-indole)生成蓝绿色物质.该物质经质谱测定为靛蓝类二聚体化合物.实验表明,其中两个氨基酸残基的变化都是关键突变,此结果与最新的P450 2A6突变体晶体结构研究相符.计算机模拟显示,I300A突变导致活性口袋在铁卟啉环的垂直和水平方向都增大,使其能接纳在两个方向都有位阻的底物;而297位的天冬酰胺是一个功能保守的残基,N297Q的变化可能与氢键等弱作用有关.图4表1参29     

Dietzia菌随机插入突变体文库的构建及功能基因筛选

Dietzia属菌具有很好的烃类降解和良好的高盐、高碱耐受能力.为研究Dietzia属降解烷烃和耐受盐碱的分子机制,以Dietzia sp. DQ12-45-1b为研究菌株,利用双质粒系统p Tip-istAB-sacB和pRTSK-sacB,成功构建库容为30 720的随机突变体文库.随机挑选的突变克隆及突变克隆传代20次后的Southern blot结果表明:转座序列插入的随机性较好,均为单插入突变,并且具有较好的遗传稳定性,可用于长期筛选功能基因.在此基础上,分别以高盐培养和正十六烷为单一碳源培养,利用高通量基因筛选,成功获得了一个耐盐突变体M9G和5个降解利用正十六烷相关突变株M6A、M6B、M7A、M9A、M81C.与野生型相比,5个降解利用正十六烷相关突变株的降解率下降范围为16.67%-84.35%.插入位点分析结果显示,M9G、M6A、M6B、M7A、M9A和M81C的插入基因分别预测为丝氨酸蛋白酶、铁氧化还原蛋白、假定蛋白、铁氧化还原蛋白还原酶、ABC转运蛋白和细胞色素P450类CYP153烷烃羟化酶.其中除了预测假定蛋白外,有些基因与传统上确定的功能存在差异,暗示着其可能具有新的功能.Dietzia菌随机插入突变体文库的构建及筛选可为研究Dietzia菌的抗逆和烷烃降解机制奠定基础.(图6表3参28)     

盐生杜氏藻CPD光裂合酶FAD结合结构域Gln336在逆境胁迫下的修复活性

为了解盐生杜氏藻环丁烷嘧啶二聚体(CPD)光裂合酶的作用机制,通过定点突变的方法对其黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域α13中保守氨基酸残基Gln336进行突变,并比较野生型菌株PGEX-4T-1-Ds PHR2(WT)和突变菌株PGEX-4T-1-Ds PHR2-Q336H(Q336H)表达的光裂合酶在体内外的光修复活性及其在不同盐浓度下修复光损伤的效果.结果显示:采用Dpn I法定点突变,成功获得盐生杜氏藻CPD光裂合酶突变体Q336H的基因,构建表达载体并导入到大肠杆菌BL21(DE3)中,构建了突变菌株Q336H.体内外活性研究发现,野生型菌株的CPD光裂合酶的活性显著大于突变菌株Q336H(P0.05).在不同盐浓度条件下,野生型菌株存活率基本没有变化,而突变菌株Q336H随着盐浓度增加存活率迅速下降.在体外修复实验中,甘油浓度对突变酶Q336H活性影响显著大于对CPD光裂合酶活性影响(P0.05).甘油浓度增加导致突变酶Q336H修复活性逐渐下降,而CPD光裂合酶活性变化趋势是先增加后下降.因此,Gln336对盐生杜氏藻CPD光裂合酶活性具有重要影响,而且可能是该酶在盐胁迫下发挥功能的关键氨基酸残基.     

利用纤维二糖的酵母工程菌构建

以扣囊复膜孢酵母染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增到其β-葡萄糖苷酶基因bgl1,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切并和经相同酶切的穿梭表达载体pYX212连接,构建了重组质粒pYX-sbgl,转化酿酒酵母W 303-1A,bgl1基因获得了活性表达,β-葡萄糖苷酶活力为0.504 IU/mL.转化子能以纤维二糖为唯一碳源生长,并能应用于同时糖化和发酵纤维素底物生产乙醇,使乙醇产量较宿主酵母有了一定的提高.图6表1参14     

通过理性设计在体内获得具有分子间剪切潜力的锤头型适体酶

锤头型适体酶目前已广泛用于基因表达调控,为了维持锤头型核酶高效自剪切的Loop Ⅰ和Loop Ⅱ之间的三级结构互作,现有的锤头型适体酶都是基于其stem Ⅲ或stem Ⅰ发展而来.为增加锤头型适体酶的多样性和通用性,探索基于stem Ⅱ的锤头型适体酶,通过理性设计基于stem Ⅱ的锤头型适体酶的链接体,基于毒蛋白基因ibsC报告体系,结合宿主的生长推测锤头型适体酶响应小分子调控的情况.设计了 10种不同长度、不同碱基互补配对程度的链接体.其中7种链接体对应的锤头型适体酶无法发生自剪切;2种可以发生自剪切,但是不受茶碱调控;最终获得一个基于stem Ⅱ的锤头型适体酶T4,其链接体由4对完全互补配对碱基对组成,这表明由4对完全互补配对碱基对组成的链接体可能更容易获得小分子依赖的锤头型适体酶.在茶碱存在时,含有T4的宿主生长,而茶碱不存在时,其宿主不能生长,这表明锤头型适体酶T4的自剪切活性是受茶碱调控的,成功实现了利用小分子控制大肠杆菌中毒蛋白基因的表达.本研究表明T4是基于stem Ⅱ的依赖茶碱的锤头型适体酶,表明以锤头型核酶的stem Ⅱ也可以发展锤头型适体酶;此外,T4具有分子间剪切潜力,有望发展成为利用小分子调控内源性基因表达的工具.(图7表2参39)     

邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、定位和高效表达

采用特异性引物，以菲、芘降解菌株ZL5的代谢性质粒为模板，扩增出邻苯二酚2，3—双加氧酶(C23O)基因，将该基因和表达载体pET—30a( )连接，转化E.coli JM109(DE3)，获得了高效表达的转化子，SDS—PAGE结果表明，转化子的C23O蛋白不仅在细胞内存在，而且能被分泌到胞外，薄层扫描显示，转化子细胞内和细胞外表达蛋白总量占细胞总蛋白的42％，酶活分析表明，分布在转化子细胞内、外的表达蛋白都具有较高的C23O比活力，Southern杂交将菌株ZL5的C23O基因定位在内生质粒的不同酶切片段上。图5表1参12。     

响应面法优化漆酶基因lac1338表达漆酶的发酵条件

为提高Escherichia coli BL21(DE3)中漆酶基因lac1338的表达水平,采用响应面法对其发酵条件进行优化.首先用Plackett-Burman法筛选出3个影响较大的重要因素,分别为温度(Q1)、诱导时间(Q3)以及诱导前菌体浓度OD600 nm(Q4).继而结合响应面分析,建立以漆酶酶活为响应值的二次回归方程模型,即Y=75.33+3.30A+9.35B+5.35C-1.69AB+0.80AC+11.50BC-25.97A~2+1.83B~2-4.66C~2,从中获得最优的发酵条件:诱导温度为31℃,诱导时间为20 h,诱导前的菌体浓度OD600 nm值为1.8.采用该发酵条件,供试菌株的漆酶比酶活达到22.8 U/mg,较优化前漆酶的表达量(10.7 U/mg)提高了2.13倍,其试验值与预测值基本相符.说明预测模型可靠性高,可应用于漆酶发酵条件的优化.     

黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、表达及快速酶活检测体系的建立

阿魏酸酯酶是参与半纤维素降解的重要酶类. 为了提高阿魏酸酯酶的活性和其它性能,本文作者采用RT-PCR技术从黑曲霉CIB 423.1中克隆了编码阿魏酸酯酶A的cDNA,构建了外泌表达的质粒,并将其转化到毕赤酵母GS115进行表达. 通过检测培养液上清中的酶活,表明阿魏酸酯酶已成功在这一体系表达. 同时,本文还建立了快速、稳定的酶活检测体系,为后续对阿魏酸酯酶酶突变体活性进行高通量筛选奠定了基础. 图5 参17     

黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、表达及快速酶活检测体系的建

阿魏酸酯酶是参与半纤维素降解的重要酶类.为了提高阿魏酸酯酶的活性和其它性能,本文作者采用RT-PCR技术从黑曲霉CIB 423.1中克隆了编码阿魏酸酯酶A的cDNA,构建了外泌表达的质粒,并将其转化到毕赤酵母GS115进行表达.通过检测培养液上清中的酶活,表明阿魏酸酯酶已成功在这一体系表达.同时,本文还建立了快速、稳定的酶活检测体系,为后续对阿魏酸酯酶酶突变体活性进行高通量筛选奠定了基础.图5参17     

多点突变提高DhaA对芥子气的活性和热稳定性

为提高烷基卤脱卤酶Dha A对芥子气的活性和热稳定性,采用Autodock软件计算Dha A突变前后与芥子气的结合情况,利用重叠延伸PCR和DNA无缝拼接结合的方法,改变Dha A活性空腔进出口通道的大小,构建包含5个位点的Dha A突变体(Ile135Phe+Cys176Tyr+Val245Phe+Leu246Ile+Tyr273Phe);将Dha A及其突变体构建在p ET-28a载体上后,在Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达,比较纯化后的野生型与突变体在酶学性质方面的变化情况.Autodock分子对接结果显示,突变后的Dha A与芥子气的结合能、结合效率和抑制常数均小于野生酶,突变体对芥子气的比活性提高了1.4倍,对10 mg/m L芥子气的降解率提高了近20%.热稳定性实验发现,Dha A突变体在50℃水浴1 h后残余酶活为76%,比野生型Dha A提高了19%.Dha A突变体的Tm值为56℃,比野生型Dha A提高了6℃.综上表明改变Dha A活性空腔内的进出口通道可以提高Dha A的热稳定性和对芥子气的催化活性.     

拟南芥蛋白磷酸酶PPH1的结构预测与功能分析

拟南芥PPH1属于蛋白磷酸酶2C(PP2C)家族,主要参与捕光色素复合物LHCⅡ蛋白去磷酸化调控与光系统的状态转移,与STN7蛋白激酶共同参与调控LHCⅡ的磷酸化与去磷酸化.为了解此酶的具体的催化机制和空间结构,使用生物信息学的方法对PPH1的疏水性、跨膜区、膜体和二级结构进行分析,构建系统进化树并通过同源建模的方法建立其核心结构域的三级结构,围绕蛋白磷酸酶的结构和可能的作用机制关系进行探讨.在以上分析的基础上选择特异位点合成多肽后,免疫家兔并成功制备抗体.蛋白印迹结果显示制备得到了PPH1特异抗体,证实此磷酸酶结构得以正确地预测.研究为今后进一步研究其结构和功能以及突变体的设计提供了理论基础.     

Eryxin通过抑制芳香化酶表达调控雌激素生物合成

雌激素水平与女性生理及心理健康密切相关,为探讨eryxin对雌激素生物合成的影响,采用Am-blue法检测eryxin对人卵巢颗粒细胞KGN细胞增殖的影响,磁微粒分离酶联免疫法检测雌二醇的合成,Western blotting检测KGN细胞芳香化酶蛋白表达水平,RT-qPCR检测KGN细胞芳香化酶基因及其启动子PromoterⅡ表达水平.结果显示,在1-150μg/mL范围内eryxin对细胞增殖没有影响,但是可以显著抑制KGN细胞中雌二醇的合成,且具有剂量依赖性;eryxin对芳香化酶过表达的HEK-293A细胞中雌二醇的合成没有影响;eryxin显著下调芳香化酶的mRNA和蛋白质表达水平,抑制芳香化酶启动子PromoterⅡ表达;降低eryxin中蛋白质含量可显著削弱其抑制雌激素合成的活性.本研究表明eryxin抑制人卵巢颗粒细胞雌激素的合成是通过其抑制芳香化酶mRNA及蛋白表达来实现的,结果可为进一步发现新型抗雌激素生物合成药物治疗相关相关疾病奠定基础.(图6表1参21)     

水稻不同亚家族SR蛋白的相互作用

精氨酸和丝氨酸富集蛋白(Arginine/ser ine-rich proteins,SR proteins)是剪切复合体中的重要成员.SR蛋白能够通过C端结构域相互作用并参与前体信使RNA的组成性剪切及可变剪切加工过程.为了揭示水稻SR蛋白间的相互作用网络,利用GAL4酵母双杂交系统,对来自不同亚家族的6个水稻SR蛋白进行相互作用分析.结果发现,来自两个不同亚家族的SR基因SCL30a和SC34共转化酵母能在相应缺陷培养基上生长,α-半乳糖苷酶活性约为对照的17倍,表明两者存在直接的相互作用关系,同时也暗示水稻可能通过SR蛋白直接相互作用,对重要基因的剪切加工及表达进行再次精细调控以应对外界复杂的环境变化.     

嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)RNA中通过RT-PCR克隆出β-葡萄糖苷酶基因bgl Ⅰ的全长序列,cDNA序列为2 672 bp.Genbank登录号为EU269025,将该片段插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K/bgl,经线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,在醇氧化酶AOXI基因启动子作用下,获得高效表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌株.经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组表达蛋白.SDS-PAGER测得该重组蛋白相对分子质量(M)约为120×103.经甲醇诱导,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达1.2 U/mg,小规模发酵量达0.45 mg/mL.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0.于70℃保温30 min仍保持80%的酶活力,具有较高的热稳定性,在pH 3.0～9.0的条件下酸碱耐受性强.图6表1参22     

朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的原核表达及其活性分析

乙酰胆碱酯酶(ACh E)在神经信号传导过程中起重要作用,是氨基甲酸酯类和有机磷类农药的主要作用靶标.对朱砂叶螨ACh E进行体外表达和纯化,并分析其活性.将朱砂叶螨ace基因序列插入到原核高效表达载体p ET-30a中,构建表达载体p ET-30a/ace,转入表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG诱导高效表达;镍柱纯化目的蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定目的蛋白;以纯化的螨ACh E为抗原制备抗螨ACh E特异性抗体;改良的Ellman法测定螨ACh E活性.结果获得了相对分子质量(Mr)约为68×103的较高纯度的螨ACh E蛋白,检测大部分为可溶性表达,酶活检测具有乙酰胆碱酯酶活性,并制备了107效价的抗螨ACh E特异性抗体.采用重组ACh E(IC50=5.4 mmol/L)检测毒扁豆碱抑制活性比螨粗酶液(IC50=58.7 mmol/L)灵敏度提高11倍.本研究构建了螨ACh E体外高效表达载体并获得了具有较好活性的重组螨ACh E,可为抗ACh E杀螨剂的体外高通量筛选和以ACh E为靶标的农药残留检测奠定基础.     

植物镉耐性/富集基因的筛选方法

植物耐受/富集镉（Cd）是一个复杂的过程,涉及转运蛋白家族、螯合蛋白家族、抗氧化系统等多个方面的参与。文章综述了植物Cd耐性/富集基因的筛选方法,包括抗性表达文库、Cd抗性突变体的图位克隆、基因差异表达、电子克隆。筛选Cd抗性植物cDNA酵母表达文库可鉴定与金属束缚、隔离及外排相关的膜转运蛋白;筛选重金属敏感拟南芥突变体和图位克隆突变基因可鉴定与谷胱甘肽和植物螯合肽合成相关的酶;第二代测序技术、基因差异表达分析则是鉴定Cd响应基因以及揭示金属型植物与非耐性植物表型差异分子基础的有效方法;电子克隆也被应用在模式植物中鉴定重金属转运蛋白家族的编码基因。在此基础上,简述了Cd耐性/富集基因在改良植物Cd耐性或富集上的应用。     

产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB)的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260 U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40 g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5 g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.图6表1参18