用单个特异引物扩增桃ACC氧化酶cDNA及其在大肠杆菌中的表达

用单个特异引物和通用引物ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５从桃受伤叶片ｃＤＮＡ中扩增出１．３ｋｂ左右大小的片段．将该扩增产物克隆并对重组克隆作酶切分析发现至少可分为３类．用桃ＡＣＣ氧化酶基因组ＤＮＡ为探针进行点杂交表明,４,７,９,１０,１１,１２重组质粒能与之杂交,其中７,９,１０,１１,１２号重组质粒酶切图谱与已报导的桃果实成熟相关的ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ基因基本一致,而４号克隆则不同．ＤＮＡ序列分析和ＰＣＲ鉴定表明,插入片段均由５′端特异引物单个引物扩增出来,对７号重组克隆插入片段ＤＮＡ全序列分析表明,７号重组克隆插入片段全长１１４６ｂｐ,包含了除启始密码子外的全部编码区和１９２ｂｐ的３′端非编码区．通过补上起始密码子ＡＴＧ构建重组表达载体,在大肠杆菌中表达出３５×１０３的非融合蛋白     

大熊猫基因组微卫生DNA的分离与序列分析

以pBS^ 为克隆载体,构建圈养大熊猫基因组DNA的小插入文库,分别用生物素标记的（CAC）5和γ-^32P-dATP标记的（CA）15寡核苷酸为探针,对重组质粒进行斑点杂交,获得15个阳性克隆,并测定了插入片段的DNA序列,其中有一部分序列已被分析,本文对剩余的8个DNA序列进行分析,发现它们大小不一,从259bp-881bp,有6个序列含有不同重复单位的一、二、四核苷酸的完整串联重复,斑点杂交和Southern杂交证明,这些序列均来自大熊猫基因组,上述结果为利用PCR技术研究大熊猫遗传多样性和了解大熊猫基因组结构积累资料。     

邻苯二酚1,2—双加氧酶（C120）基因的定位,克隆和表达

放射性同位素标记ｔｆｄＣ基因片段作探针,Ｓｏｕｔｈｅｒｍｂｌｏｔ杂交定位Ｌ１菌株的邻苯二酚１,２－双加氧酶基因位于ＰｓｔＩ的Ｉ片段和ＢａｍＨＩ的Ｍ和Ｎ片段。     

大鼠类Alu重复序列的克隆及其在染色体DNA突变分析中的应用

从大鼠低Ｃｏｔ值ＤＮＡ文库分离到一种类Ａｌｕ的重复序列,命名为ＲＡＬＲＳ－１。对ＲＡＬＲＳ－１克隆并进行了测序,长度为２８３ｂｐ,发现其中含有单一的微卫星（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）序列ＡＧ,ＡＧＧ和ＡＧＧＧ。ＲＡＬＲＳ－１ＤＮＡ序列在大鼠单倍体基因组中的拷贝数为１５００００～３３００００。依ＲＡＬＲＳ－１中的一段序列合成了一２８寡核苷酸探针（ＡＧＧＧ）７,对大鼠正常组织和肿瘤组织ＤＮＡ指数谱     

青稞β—1，3—葡聚糖酶Ⅱ基因启动子的克隆分析及表达载体的构建

根据本实验室克隆并公布的藏青稞β—1，3—葡聚糖酶Ⅱ(BGH Ⅱ)基因序列，以藏青稞QB09基因组DNA为模板，构建DNA步移文库，并通过步移技术克隆出BGH Ⅱ起始密码子上游调控序列BGHP．鉴定和分析表明，BGHP具备大多数高等植物启动子的保守元件，预测它对BGHⅡ基因的表达具有一定的作用．为鉴定BGHⅡ基因的基本启动子元件，将基因5′侧翼序列做缺失片段分析，利用PCR方法从BGHP中得到3个不同大小两端带有Hind Ⅲ、BamH I酶切位点的片段BGHP1、BGHP2和BGHP3，定向插人载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP)中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报告基因GFP的植物表达载体BGHPVl、BGHPV2和BGHPV3，用于大麦的遗传转化，为进一步研究其功能奠定了基础．图5表1参15     

石油烃降解酶及其基因的结构、功能和表达调控

研究烃降解酶及其基因是进行石油微生物分子检测和工程菌构建的重要基础.本文对目前烃降解酶及其基因的结构、功能和调控机制的最新研究进展进行了总结.催化烷烃好氧降解的起始酶有几类加氧酶,膜整合甲烷单加氧酶、萘-1,2-双加氧酶和异丙苯双加氧酶的晶体结构已经被解析.烷基或芳基琥珀酸合酶催化烃厌氧代谢的主要起始反应,而Azoarcus sp.乙苯厌氧代谢起始反应由乙苯脱氢酶催化.在细菌中,烃代谢相关基因主要通过形成操纵子进行表达调控,基因转录受烃或类似物诱导,并受细胞全局调控.一些微生物由于存在多种烃代谢途径而可能具有复杂的基因调控机制.此外,生态学研究表明,环境中烃降解基因的诱导动态与实验室内纯培养分析不同.在分析石油降解工程菌构建有待解决问题的基础上,提出了烃代谢综合调控和环境中相关酶及基因诱导研究的重要性,并对未来烃降解酶及其基因在有毒物降解理论研究和生物修复上的应用进行了展望.     

DNA同源性分析最终确定新疆中华根瘤菌（Sinorhizobium xinjiangensis）为一独立种

针对S.xinjiangensis分类地位的争议,从新疆再次分离获得34株快生大豆根瘤菌,在16SrDNAPCR-RFLP分析和SDS全细胞蛋白电泳分群的基础上,进行了16SrDNA全序列相似性和DNA同源性分析.所测4个菌株和S.fredii模式菌株USDA205的16SrDNA全序列有很高的相似性.而DNA同源性分析说明新分离的菌株代表与原定的S.xinjiangensis为一个DNA同源群.其模式菌株CCBAU110与S.fredii的2株参比菌株USDA194、2048之间的DNA同源性分别为31.5%和28.7%.S.fredii的模式菌株USDA205与新分离的菌株代表及原定的S.xinjiangensis的模式菌株和2个参比菌株之间的DNA同源性为20.8%～39%,远低于70%.属于种水平上的差异.按照国际细菌分类委员会以DNA同源性≥70%且△Tm≤5℃作为定种的标准,S.xinjiangensis是Sinorhizobium属中不同于S.fredii的一个独立的种.表3参20     

马氏甲烷八叠球菌S－6的一个染色体区段的表达、序列分析和结构分析

用一组多克隆抗体对马氏甲烷八叠球菌（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｍａｚｅｉ）Ｓ－６菌株的基因组ＤＮＡ文库进行了筛选．仅选出ｐ６０Ａ克隆能对马氏甲烷八叠球菌中可发生细胞形态学变化菌株的抗血清发生阳性反应．对ｐ６０Ａ克隆的双链ＤＮＡ进行了序列分析．识别出一开式阅读框架（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅＰ，ＯＲＦＰ）．表达的蛋白是ＯＲＦＰ编码的蛋白的３倍，并得到ＯＲＦＰ蛋白的三聚体，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中表现出整体蛋白的迁移行为．同时，此表达蛋白抗１０％ＳＤＳ，６ｍｏｌ／Ｌ尿素及热处理．基因结构分析表明，ＯＲＦＰ具有与Ｍ．ｂａｒｋｒｉｍｃｒＡ有同源性的核糖体结合位点和一个与甲烷细菌启动子共有序列相似度达７７％的启动子序列．使用参照序列分析表明，由ＯＲＦＰ演绎的氨基酸序列，具有高密度的带电荷的氨基酸和占优势的β－层迭构型．对此表达蛋白作了Ｎｅｕｒｏｓｒｏｒａｃｒａｓｓａ的ｐｏｒｉｎ蛋白抗血清试验，以研究其可能功能．检验了Ｍ．ｍａｚｅｉＳ－６细胞的蔗糖梯度制备物，对此原细胞中的ＯＲＦＰ蛋白作了定位．结果表明，ＯＲＦＰ蛋白可能是一种古细菌Ｐｏｒｉｎ，其在Ｍ．ｍａｚｅｉＳ－６中的表达，可能象大肠杆菌那样与渗透压调节有关．     

棉铃虫核多角体病毒基因组限制酶酶切分析及其多角体基因的定位

应用１１种限制性内酶ＢａｍＨⅠ、ＢｓｔＥⅡ、ＥｃｏＲⅠ、ＥｃｏＲⅤ、ＨｉｎｄⅢ、ＫｐｎⅠ、ＰｓｔⅠ、ＳａｌⅠ、ＳｓｔⅠ、ＸｂａⅠａⅠ和ＸⅠⅠ和ＸｈｏⅠ分别将中国棉铃虫核多角体病毒（单粒包埋ＨａＳＮＰＶ）湖北株基因组Ｄ组ＤＮＡ酶切为１０、１２、２２、２１、１３、６、６、４０、６、２１、６个片段，并求得基因组大小平均为１什什Ｍｒ≈７９．１×１０６．以家委核多角体病毒ＢｍＮＰＶ多角体基因为探针，利用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术将病毒多角体基因定位在ＳａｌⅠ４．２×１０３ｂ左右的片段上．与棉铃虫核多角体病毒其它株系酶切图谱比较结果表明，本株病毒与上海等株系及美洲棉铃虫核多角体病毒ＨａＳＮＰＶＥｌｋａｒ株系酶切图谱相似，它们之间的条带数和大小差异较小，而与已发现的所有多粒包埋型病毒ＨａＳＮＰＶ酶切图主谱差异较大．据此认为ＨａＳＮＰＶ和ＨａＭＮＰＶ属于基因型不同的两类病毒，而ＨａＳＮＰＶ不同分离株的同源性很高     

慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)聚羟丁酸合成酶基因(phbC)的克隆和序列测定

以苜蓿根瘤菌Rm1021的phaC基因突变体菌株Rm11144 (phaCTn5-233)为受体菌,通过功能互补,成功地从构建的Bradyrhizobium japonicum USDA110基因文库中,筛查到能与Rm11144互补,使之恢复在以乙酰乙酸为唯一碳源的M9培养基(M9-AA)平板上5 d形成明显可见菌落,以及在MOPS平板上形成粘液型菌落的表型的重组粘粒pDC2; 经证实,该粘粒带有phbC基因.完成了该基因的全序列测定并已在GenBank登记,登记号为AY077580.B.japonicum phbC基因由1803碱基对组成,GC含量61.8%,AT含量38.2%;编码600个氨基酸,Mr=66.95×103. 图3 表3 参13     

地衣芽孢杆菌2709和 6816碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及序列分析

用PCR方法从地衣芽孢杆菌 2 70 9和 6 816中扩增了碱性蛋白酶基因 (apr1和apr2 ) ,扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体 pET -2 8a中 ,构建成重组分泌型表达载体pAPR1、pAPR2 .pAPR1、pAPR2中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM 10 9(DE3)中得到表达 .SDS -PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为 30 .5× 10 3 ,同核酸序列测定所推导的值相符 .表达产物分别占细胞总蛋白的 8.0 %和 7.5 % .2 70 9重组菌所得酶活为 12 10u/mL ,6 816重组菌所得酶活为 1175u/mL .研究发现 ,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时可能存在前肽自动脱落的现象 .同时 ,对地衣芽孢杆菌 2 70 9碱性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析 ,发现与地衣芽孢杆菌 6 816碱性蛋白酶基因的同源性为 98% .图 5参 11     

芜菁花叶病毒杭州株P1基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

通过反转录ＰＣＲ，克隆得到１．２ｋｂ的ＴｕＭＶＨ１的Ｐ１片段，并在大肠杆菌表达载体ｐＧＥＭＥＸ－１中得以表达，表达产物为可融性融合蛋白，Ｍｒ≈６×１０４．     

朱■的随机扩增多态DNA分析与种内亲缘关系研究

利用随机扩增多态ＤＮＡ技术对朱（Ｎｉｐｐｏｎｉａｎｉｐｐｏｎ）８个个体进行了随机扩增多态ＤＮＡ分析．用２０个１０ｂｐ的随机引物对每只朱的基因组ＤＮＡ进行扩增,共得到１６８个扩增片段,其中共有片段为１０２个．根据聚类分析所得到的树状图确定了８只朱的亲缘关系,这为进一步构建全部朱个体的谱系关系图打下了基础,有利于制定更有效的朱保护计划     

鸡贫血病毒(CAV)vp1基因的克隆及与其他CAV vp1基因的比较

把一个新鸡贫血病毒(CAV)的vp1基因通过PCR扩增，然后克隆到质粒载体pUC18上．vp1基因包含1347个碱基对，并且推定的VP1蛋白氨基酸序列含有449个氨基酸．通过DNA BLAST软件把该基因的序列数据与在GenBank中发表的其他vp1基因比较显示，克隆的vp1基因与已发表的其他vp1基因之间存在许多核甘酸差异．核甘酸的变异导致其编码蛋白质的某些氨基酸发生改变．氨基酸的改变主要集中在VP1蛋白的29、75、125、141、144、251、254、447位．在这些变异中，许多氨基酸的电荷和／或疏水性发生了改变，例如：Gly→Glu、Val→Glu、Ala→Thr、Leu→Gln、Cys→Trp、Leu→Arg、Arg→Ala、Gly→Ser、Ser→Ala、Glu→Gly、Gly→Thr等．通过CLUSTAL X软件比较了6个不同的vp1基因．该vp1基因已被GenBank登录(登录编号：AF448446)．VP1蛋白是CAV的唯一衣壳蛋白，因此VP1的氨基酸变异可能影响该蛋白质的抗原特征．对该vp1基因进一步进行免疫学研究具有重要意义，并且有可能应用该基因构建CAV基因工程疫苗．图1表3参20     

邻苯二酚1,2-双加氧酶(C12O)基因的定位、克隆和表达

射性同位素标记ｔｆｄＣ基因片段作探针,Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交定位Ｌ１菌株的邻苯二酚１,２双加氧酶基因位于ＰｓｔⅠ的Ｉ片段和ＢａｍＨⅠ的Ｍ和Ｎ片段．低熔点琼脂糖回收ＰｓｔⅠ的Ｉ段,直接克隆至表达载体ｐＫＴ２３０上,获得重组子ｐＫＴ２３０ｐ．重组子转化不具开环酶活性的甲胺磷降解菌Ｐ２,获得高效的Ｃ１２Ｏ酶活     

湖流域土壤微生物基因组总DNA分离纯化及其质粒文库的初步构建

采用研磨／冻融和SDV蛋白酶K热处理以及CTAB处理等理化方法，直接从太湖流域土壤样品中抽提得到微生物总基因组DNA，所得粗DNA用透析袋法以及Nucleaotrap suspension DNA纯化试剂盒进行了纯化，纯化过的DNA能够满是常用限制性内切酶酶切、细菌16S rDNA通用引物和随机引物进行PCR扩增的要求，将所得纯品DNA经过EcoRI部分酶切之后与酶切并脱磷酸的pSK^ 空载体连接，再以大肠杆菌JM109为宿主细胞初步构建了土壤微生物基因组文库，图6参7     

CMS高粱保持系叶绿体基因ps1A1和ps1A2片段的克隆与序列比对

以15种包括同质异核和同核异质高粱材料的总：DNA为模板进行RAPD分析，196个随机引物中，引物Y-19扩增得到一个很有规律的差异片段SAY-192300。该片段只出现在4个保持系(B)和3个恢复系(R)中，而不出现在6个不育系(A)和2个杂种F1中，进一步对cms—Al、cms—A2两套8个材料(A／B／R／F1)的总DNA、mtDNA和cpDNA用引物Y-19进行扩增，发现片段SAY-192300仅在cpDNA得到，Southern杂交结果证实了片段SAY-192300的叶绿体来源，同时也表明在cms胞质中该片段所在区未发生插入、缺失等大的结构变异,DNA序列测定结果表明，该片段为叶绿体ps1A1和ps1A2基因的部分序列。图6表2参19。