杏鲍菇转录组数据SSR位点的生物信息学分析

为了开发杏鲍菇分子标记,利用前期高通量测序技术获得的杏鲍菇转录组数据,采用生物信息学软件Trinity拼接,然后通过MISA软件检索并分析杏鲍菇转录组简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR)位点.共获得45 833条unigene,在其中的3 256条unigene中检测到3 811条符合软件参数的SSR序列,发生频率为8.31%.SSR位点平均长度为15 bp,平均分布频率是1/15.91 kb.在杏鲍菇转录组的SSRs中,单核苷酸与三核苷酸重复基元为主要重复类型,分别占总SSRs的45.24%和35.53%.SSR基元的重复次数为5-24次,其中5次或10次重复是发生频率最高的,SSR重复基元共有85个类型,其中A/T是最常见的重复基元,比例为38.97%,其次为AG/CT,比例为8.24%.对3 811个SSR位点设计出3 644对SSR引物,随机选择20对引物进行PCR扩增,其中9对在3个杏鲍菇品种中表现出多态性.本研究表明杏鲍菇转录组SSR位点多态性丰富,具有较高的应用潜力.     

基于山桐子转录组序列的SSR分子标记开发

为研究山桐子遗传多样性,对山桐子转录组数据进行分析,开发SSR分子标记技术.将山桐子高通量转录组测序获得的84 213条Unigene进行简单重复序列(SSR)位点挖掘和分析,并结合引物验证,初步证明其可行性.通过软件分析,共获得含SSR位点的序列数23 077,出现频率为27.40%,涉及序列数量为29 953条,发生频率为35%.SSR序列中包括1 620种重复基元类型,其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型,SSR位点数分别为9 782(32.67%)、6 921(23.11%)和5 420(18.10%).单核苷酸中A/T类型比例最高,为9 630(32.15%),二核苷酸和三核苷酸中以类型AG/CT(4 679;15.62%)和AAG/CCT(1 220;1.53%)为主.SSR位点重复次数差别较大,主要是3次(4 748;15.70%),其次为6次(3 707;12.25%)和5次(3 475;11.60%).运用多态性分析的方式初步验证SSR位点在不同地区山桐子标记中的可行性.同时,利用Primer 5.0进行引物设计,随机筛选100对引物进行验证,31对引物可以扩增出条带,19对引物扩增出预期大小的条带,8对引物能特异性区分宜宾、资阳、宁强、成都4个不同地区的山桐子.本研究通过分析山桐子高通量转录组序列的SSR信息,筛选出8对引物验证不同地区山桐子的遗传多样性,将有助于山桐子基因挖掘、分子标记育种和资源保护等后续工作的开展.     

浮萍转录组数据SSR位点的生物信息学分析

为开发浮萍分子标记技术,采用高通量测序技术获得浮萍转录组原始实验数据,经过生物信息学软件Trinity拼接后,获得74 797条unigene.进一步采用生物信息学分析软件MISA对所有的unigene进行SSR位点数据挖掘.共计搜索出14 250个SSR位点,分布在12 707条unigene中,出现频率为19.05%,SSR平均长度为19 bp,平均分布频率是1/6.57 kb.在浮萍转录组的SSRs中,二核苷酸与三核苷酸重复序列为主要重复类型,分别占总SSRs的70.74%和25.37%.浮萍转录组数据中SSR序列共包括185种重复基元类型,二核苷酸重复基元AG/CT和三核苷酸重复基元CCG/CGG是优势重复基元,分别占总SSRs的69.19%和8.84%.综上表明浮萍SSRs位点具有极大的可开发性.     

大麦EST-SSR分子标记开发及特征分析

大麦是一种古老的栽培作物,也是分子遗传学研究中常用的模式植物,为满足大麦基因作图、遗传多样性、种质资源鉴定和分子辅助育种等研究的需求,拟在NCBI公共数据库基础上,开发基于表达序列标签(EST)的简单序列重复(SSR)分子标记.从NCBI数据库中获得了525 781条大麦EST序列,将这些序列进行聚类和去冗余后共获得61 902个Unigene,随后通过MISA软件搜索Unigene中的SSR位点,并设计引物9 659对,最后通过电子PCR(E–PCR)和普通PCR对引物进行验证.结果显示:(1)61 902个Unigene中含有SSR位点24 648个,其中复合SSR位点5 843个,约占3.42%,单纯SSR位点23 805个,约占96.58%;(2)经E-PCR验证后发现9 659对SSR引物中有1 060对(11%)能够成功扩增出产物;(3)随机选取的11对引物经普通PCR验证发现,这些引物都能在2份野生大麦品种、2份栽培大麦品种及1份小麦、硬粒小麦、荆州黑麦和节节麦中成功扩增.本研究表明日益丰富的EST公共数据库是大麦SSR分子标记的重要来源;利用EST公共数据库、SSR搜索软件,结合E–PCR验证是开发SSR分子标记省时高效的手段.     

濒危植物厚朴SSR引物筛选及反应体系优化

探索适宜厚朴(Magnolia officinalis)简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)-聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的最佳条件.在SSR引物筛选基础上,利用正交试验设计对影响PCR反应的5个因素(模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和Taq酶催化活性浓度)进行4个水平的优化,并通过温度梯度试验优化引物退火温度.在厚朴及其近缘物种的70对引物中,筛选出13对扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物.PCR各因素在不同水平下对反应体系的影响由大到小依次为引物浓度、Taq酶催化活性浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和模板DNA浓度.PCR最佳优化体系:25 μL体系中,模板DNA质量浓度为2 ng·μL-1,引物浓度为0.6μmol·L-1,Mg2+浓度为2.0 mmol·L-1,dNTPs浓度为0.5 mmol·L-1,Taq酶催化活性浓度为0.03 U·μL-1(1U=16.67 nkat).最佳扩增程序:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,48.0～59.0℃(退火温度随引物不同而定)退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环后72℃延伸10 min.上述结果可为利用SSR-PCR技术研究濒危厚朴群体遗传学和分子生态学提供技术参数.     

柚类资源及其近缘种SSR标记的分子评价

采用31对SSR引物对122份柚类种质资源及其近缘种的遗传多样性进行了研究.31对SSR引物可以检测到335个等位基因变异,平均每个位点可检测到9.85个等位基因.每个位点多态性信息指数(PIC)平均值为0.7085.从这些引物中有效地筛选出21对高信息量SSR引物,与31对引物在122份柚类资源间遗传关系达到极显著相关(r=0.99104).柚类资源及其近缘种等位基因平均数(A)、平均杂合位点百分比(P)、SSR表型杂合度(H0)分别为2.8、83.54%、0.524.用UPGMA方法将122份研究材料分成7个组群,110个柚类品种在相似系数0.712时可细分成18个亚组,分类结果有利于今后有目的地利用这些丰富育种材料的遗传背景.图3表2参21     

中国大麦育成品种(系)的遗传多样性

为了解我国大麦育成品种(系)的遗传基础现状,利用位于大麦7个连锁群上不同位置的25对SSR引物对来自国内不同区域的大麦推广和新育成品种(系)的遗传多样性及其亲缘关系进行分析.结果表明,25对SSR引物在73个大麦品种间均有多态性扩增,每一对引物检测到的等位基因数目在2-6之间,平均为3.92个.SSR引物的多态性信息含量(PIC)变幅为0.252-0.780,平均为0.569.遗传多样性分析发现,我国不同大麦产区的皮大麦品种(系)间遗传相似性系数(GS)变化范围为0.661-0.767(平均值0.714),青藏高原地区青稞品种(系)间遗传相似性系数变化范围为0.533-0.925(平均值0.699),表明目前国内皮大麦和青稞的遗传多样性均较差、品种遗传背景单一.通过聚类分析,在遗传相似系数0.671水平处,42份皮大麦材料聚为2大类;在遗传相似系数0.618水平处,31份青稞材料聚为5大类,来源地相同的材料通常聚在同一大类或亚类,材料聚类结果与其地理来源有一定相关性.本研究表明SSR标记具有较好的遗传变异检测能力,对大麦品种(系)间的遗传多样性评价可为我国大麦育种过程中亲本材料的选择和利用提供重要依据.     

基于中华猕猴桃“红阳”转录组序列开发EST-SSR分子标记(英文)

为开发猕猴桃EST-SSR标记,了解28个品种猕猴桃间的遗传多样性和遗传关系,对中华猕猴桃"红阳"的转录组序列进行分析,并根据分析结果设计SSR引物.之后采用CTAB法提取28个品种猕猴桃的DNA作为SSR-PCR的扩增模板,并根据扩增结果进行聚类分析.研究中共得到包含SSR的序列21 848条,其中重复单元为单碱基、双碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的序列分别为1 642、15 965、3 141、248、368和484条,随机选择其中46条序列设计SSR引物.根据初步的PCR扩增,筛选出32对条带较少且明亮的引物分别对28个品种猕猴桃的DNA样本进行扩增,并对引物对应的SSR序列进行定位.结果显示,32对引物对应的序列中有19条能够得到完整的所在基因、染色体以及染色体中具体位置的信息.这些引物中有26对具有多态性,共统计到等位基因120个,每对引物得到1-11个等位基因,平均3.75个.28个猕猴桃品种之间的遗传相似性系数在0.53-0.97之间,在遗传相似系数为0.72的水平上,可将它们分为5大类,分类结果与传统形态学的划分基本一致.本研究揭示的各样本间的遗传关系可为未来猕猴桃的种质改良提供依据.图4表5参33     

胡枝子叶片转录组特征分析及其EST-SSR标记开发（英文）

胡枝子(Lespedeza bicolor)系豆科胡枝子属植物,性耐旱,是防风固沙及水土保持的优良植物.报道胡枝子的转录组序列,对其进行注释,并开发一系列EST-SSR标记用于进化研究.主要研究结果如下:(1)采用二代测序技术对胡枝子叶片进行转录组测序,得到120 913 unigenes,其平均长度为608 bp,N50的长度是978 bp.(2)分别在KEGG和KOG等数据库中对unigenes进行注释,总共注释72 613(60.05%)unigenes的功能.(3)筛选识别13 551个潜在的EST-SSR标记;根据重复单位的核苷酸数目以及重复次数的多少,从中选择173个EST-SSR标记进行引物设计.(4)对胡枝子和其他9种近缘种植物进行PCR扩增实验,最后得到56对引物可全部成功扩增出条带并表现出一定的多态性.本研究获得了较高质量的胡枝子转录组数据库,可进一步用于比较和功能基因组研究以及胡枝子及其近缘类群的基因表达研究;开发的EST-SSR标记将提供一个强大的工具,可用于研究遗传多样性和种群结构、构建DNA指纹图谱数据库、生成遗传图谱、预测分子标记辅助育种和保存遗传信息.     

黄连木居群遗传多样性的SSR标记分析

为系统揭示黄连木天然居群在遗传多样性水平上的差异及遗传分化状况,采用SSR(Simple sequence repeats)分子标记对其8个居群进行遗传多样性分析.在建立良好的反应体系基础上,从已有的阿月浑子SSR引物中筛选出9对适合进行黄连木遗传分析的引物,在8个黄连木居群中共检测到43条等位基因,位点平均等位基因数为4.78,平均多态位点百分率达90.28%.各居群内平均有效等位基因数为2.08,平均期望杂合度(He)为0.472,说明各居群的遗传多样性处于中等水平.按检测到的有效等位基因数(Ne)和期望杂合度(He),各居群的遗传多样性由高至低依次为安康唐县顺平辉县略阳栾川林州涉县.居群间的遗传分化系数(FST)平均为0.319,说明居群内变异是黄连木变异的主要来源,并根据遗传距离将8个居群分为三大类.     

用SSR标记检测杂交籼稻三系亲本的遗传差异

随机选用分布于水稻(Oryza sativa L.)12条染色体上的110对引物,共筛选出26对具有多态性的SSR引物,对24份杂交籼稻三系亲本材料进行遗传多样性和亲缘关系分析.全部24份亲本中共检测出116对等位基因,每个SSR引物可检测到的等位基因数目为2～7个不等,平均每对引物可以检测到4.4个等位基因.多态信息量(PIC)的变动范围为0.068 9～0.803 6,平均PIC值为0.603 4;期望杂合度(He)的变动范围为0.081 6～0.829 8,平均值为0.616 9;多样性指数(1)变幅为0.173 2～1.791 3,平均为1.160 0.对供试亲本材料根据遗传距离进行UPGMA聚类分析,结果表明,SSR微卫星标记可以将24份亲本材料分为3个大群,各组亲本间的遗传差异较大.通过分子标记辅助育种,可以有效地鉴定供试亲本材料之间的亲缘关系,分析预测新种质材料的遗传差异,可作为选育强优势组合杂交水稻的重要参考指标之一.图2表3参24     

藜属植物叶绿体基因组结构与系统进化

高等植物的叶绿体基因组主要遗传自母本,具有基因组小、结构简单、序列高度保守等特点.利用系统的生物信息学方法,对4种藜属植物的叶绿体基因组进行编码基因组成、基因组结构、重复序列、变异位点在内的比较基因组学研究,以及基于叶绿体基因组序列的藜亚科植物的系统进化研究.结果表明,4种藜属植物叶绿体基因组平均大小为151936bp,平均GC含量为37.16%,具体基因的拷贝数和总的基因数目差异很小,非常保守.除灰绿藜以外,其余3种藜属植物叶绿体基因组的LSC、SSC和IR区域的边界几乎完全一致,没有表现出明显的扩张与收缩.基因组的重复序列中,相较于SSR,长重复序列片段的比例更高.相比较IR区域,4种藜属植物的LSC和SSC区域之间存在更大的核苷酸位点差异;52-59 kb的基因组区域为4种藜属植物间核苷酸位点变异最大的区段.基于全基因组和LSC+SSC序列,分别构建了包括4种藜属植物在内的藜亚科植物的系统进化树,进化关系完全一致.本研究结果揭示了藜属植物叶绿体基因组的进化特征,可为藜属植物系统进化研究提供优良的候选分子标记.（图4表4参28）     

一种改进的SON-PCR基因扩增方法

单侧寡聚核苷酸嵌套PCR(single oligonucleotide nested PCR,SON-PCR)是一种简便易行的由已知序列克隆其侧翼序列的方法,但该法的第二轮PCR反应引发效率低,而且得到的产物两端含相同的引物序列,不可直接测序.针对该问题,将第二轮PCR改进为两段式扩增,即先以单侧嵌套引物引发5′端做选择性线性扩增,然后再加入第一轮引物特异引发3′端,使特异性和效率都得到很大提高,并可用PCR产物直接测序.分别用已报道的和改进的SON-PCR法克隆Botrytis cinerea羟甲基戊二酰CoA还原酶基因侧翼序列,后者获得期望结果,证明改进的SON-PCR方法行之有效.国内外尚未见同类报道.图4参7     

微卫星位点TUT1的性别连锁检验(英文)

微卫星位点TUT1曾被认为位于松鸡科鸟类的常染色体上,只是多态性低于期望值,然而最近发现存在空基因现象.通过在45只斑尾榛鸡(Tetrastes sewerzowi)亲本和5巢双亲已知的幼鸟上扩增,发现TUT1在异配体的雌性中为纯合体,在84%的雄性中为杂合体,而且可从父本遗传给雌性和雄性后代,但从母本只能遗传给雄性后代.通过BLAST查询,含TUT1位点的序列(460 bp)与鸡Z染色体的序列最相似,分值329,期望值8e-87.以上结果表明TUT1位点位于松鸡科鸟类的Z染色体上;提示微卫星位点的空基因现象可能来自性别连锁,因此,在发表和应用微卫星位点时应当进行性别连锁检验.表1参17     

一个新的mariner类转座子的鉴定

根据mariner类转座子转座酶的保守区设计简并引物,以曲阜灰飞虱的基因组DNA为模板,通过PCR扩增、回收、克隆和测序,得到长为493bp的片段,命名为qfclone493,提交GenBank数据库,获得注册号为EU542024.将qfclone493与19种有代表性的mariner类转座子核苷酸序列进行系统学分析,结果表明qfclone493属于mauritiana亚族,与此亚族已知mariner类转座子的核苷酸序列同源性最高为74%,认为qfclone493是mauritiana亚族的一个新的mariner类转座子,命名为lsmar1.序列分析表明,lsmar1的最大ORF仅编码141个氨基酸,不能表达完整的转座酶;与隶属于同一亚族、且具有完全自主活性的mos1相比,lsmar1所编码的氨基酸序列在核定位信号(Nuclear location signal,NLS)和D,D(34)D关键部位发生突变,因此推测lsmar1可能不具有转座活性.图4参23     

水稻花药特异表达启动子的克隆与活性检测

植物雄性器官特异表达启动子的克隆是作物杂种优势利用分子育种的基础.根据水稻花药特异表达RA8基因序列设计引物,从水稻(Oryza sativa L.)品种日本晴中克隆得到水稻花药特异表达基因RA8启动子Tsp2,该启动子为RA8基因翻译起始位点上游828 bp的片段,具有启动子特征序列TATA盒TATAAATA和真核生物启动子特征序列CAAT框,与RA8启动子的核苷酸序列同源性为97%.利用该启动子与报告基因GFP构建植物表达载体p1304-rap,采用基因枪法转化烟草花药,通过GFP的瞬时表达证明该启动子具有花药特异启动子活性. 图5 参9     

玉米两个功能未知转录因子基因的转录后加工

ZmBH、ZmWD是玉米中分别具有转录因子bHLH和WD重复蛋白结构的两个功能未知基因,在不同组织中及各种胁迫诱导条件下,这两个基因均发生不同程度的剪接,产生大小各异的转录本.序列分析发现其剪接方式与经典的mRNA剪接不同,即剪接位点的选择不符合GT-AG或AT-AC规则,而是在剪接位点具有短正向重复序列SDR(Shortdirect repeats).ZmBH的转录后加工导致序列发生移码而提前终止,而ZmWD则缺失了大部分结构域序列,经由这种方式产生的转录后加工产物可影响蛋白编码,因而可能是对这两个基因功能进行调控的一种方式.图6表1参18     

小麦高分子量谷蛋白亚基基因的PCR及AS-PCR标记

选用高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)在Glu-D1位点已知的 26个普通小麦品种,包括 15个 (TriticumaestivumL. )川育系列品种及其 11个亲本,根据其亚基Dx5和Dy10基因的特异序列设计引物.通过对Dx5基因的PCR扩增及对Dy10基因的AS-PCR扩增,结果表明,所设计的引物对Dx5和Dy10都能扩增出特异条带,而携有Dx5基因的材料同时也携有Dy10基因.说明用所设计的引物可快速有效的鉴定出普通小麦中是否带有优质的 5 10亚基.图 4参 15     

甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆

促使蔗糖进入各种代谢途径的关键酶之一是蔗糖合成酶,它也是蔗糖代谢关键酶中极其重要的一种酶.以甘蔗基因组DNA为模板,用PCR技术分段扩增并克隆了甘蔗蔗糖合成酶(Sucrose synthase)基因片段,并进行序列测序,表明该基因全长约为7.5 kb,与Lingle S.E等报道的甘蔗蔗糖合成酶(SuSy2)基因序列相似性达到99.5%,推导的氨基酸序列同源性达到100%.该序列包含约1.9 kb的上游启动子调控区域, 16个外显子, 15个内含子, 3'不翻译区等,开放读码框(ORF)编码802个氨基酸,氨基酸序列中存在糖代谢关键酶家族保守的14-3-3蛋白磷酸化位点Ser/Thr,为进一步在转录水平上阐明蔗糖合成酶的表达调控机制奠定了基础.