多聚磷酸盐激酶基因在污水生物除磷中的功能

为验证多聚磷酸盐激酶基因(ppk)在污水生物除磷中的功能.采用Red敲除系统,以p KD4质粒为模板,设计同源短臂,扩增外源线性DNA片段,将外源线性DNA片段电转化整合入已导入p KD46的大肠杆菌ATCC25922野生型菌株.获得重组菌E.coli/ppk~-Kan~+.将p CP20导入大肠杆菌E.coli/ppk~-Kan~+以消除卡那霉素抗性基因,通过负抗性筛选及正反向引物验证,构建无抗生素抗性的ppk基因缺失工程菌株E.coli/ppk~-Kan~-.比较工程菌株和野生型菌株的生长特性,并比较两者在缺磷诱导/富磷及多次厌氧/好氧诱导条件下的除磷性能.结果表明采用Red重组系统,通过无痕敲除,成功构建了大肠杆菌ppk基因缺失菌株E.coli/ppk~-Kan~-.敲除后的工程菌株和野生型菌株生长整体没有差异,但是4 h前对数期工程菌株生长快于野生型菌株,8 h后稳定期工程菌株生长慢于野生型菌株,表明ppk影响菌体的生长;缺磷诱导/富磷条件下,工程菌株并未表现出因ppk缺失而影响其除磷能力;经过5次厌氧/好氧诱导,两菌菌体含磷量保持在1%~2%,没有因诱导次数的增加而表现出菌体含磷量增加的趋势,也未发现厌氧有PHB好氧有聚磷颗粒生成,表明ppk基因的缺失并没有引起菌体除磷能力的下降.ppk并未表现出明显的与污水生物除磷相关的功能.     

焦化废水中苯酚降解菌筛选及其降解性能

焦化废水中苯酚类及其衍生物的降解率高低是焦化废水COD是否达标排放的关键.采用不同培养基和菌种驯化方法,从焦化废水厂活性污泥中分离筛选获得4株苯酚降解菌,经生理生化和16S rDNA分子鉴定,A1为球杆菌属Sphaerobacter,C1为鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii;D2为睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosterone;D3为Novosphingobiumnaphthalenivorans.4株降酚菌均具有较高的苯酚耐受力和降解效率,是生物法处理酚类污染废水优质的种质资源.菌株D2不仅对苯酚具较高耐受力达到2 000 mg.L-1、且在48 h内可将初始浓度为1 000 mg.L-1的苯酚完全降解.环境因子考察研究表明,pH为7.5～8.5,温度为30～40℃范围内,转速为150 r.min-1,是菌株D2的最优降解条件,本研究结果为构建高效处理焦化废水基因工程菌提供了微生物基础.     

菌株WYT降解还原蓝4的关键基因

以印染厂活性污泥中筛选出的WYT菌株为研究对象,探索其对还原蓝4（VB4）染料降解脱色的关键基因.采用全基因组测序分析方法和同源重组法,确定染料代谢的可能关键基因.对该基因进行敲除,构建载体进行基因回补,设计表型验证实验验证基因的脱色效果.结果表明,该可能关键基因属于染料过氧化物酶基因中的B型,命名为DyP.敲除后的菌株对VB4没有脱色效果,基因敲除成功.WYT菌株与敲除载体发生双交换,获得回补株.在降解实验中,回补株对VB4的脱色率为96.04%,野生株的脱色率为96.95%,回补株恢复了对VB4的降解脱色能力,而敲除株几乎失去对VB4的降解能力,DyP基因是VB4降解脱色的关键基因.     

沼泽红假单胞菌phbC-hupL双突变株构建及产氢测定

利用湖底淤泥分离的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CQU01和该菌株的吸氢酶基因hupL缺失菌株CQU012作为出发菌株,分别构建聚羟基丁酸酯合成酶基因phbC单突变株及聚羟基丁酸酯合成酶基因phbC与吸氢酶基因hupL双突变株,以提高其在光照培养条件下的产氢量.以同源重组双交换方法构建含有Em抗性基因的自杀载体,通过接合转移转化R. palustris CQU01菌株,经PCR扩增以及测序验证,成功获得了沼泽红假单胞菌phbC单突变株R. palustris CQU013及phbC-hupL双突变株R. palustris CQU014.相同条件下测定突变菌株与野生菌株的生长和产氢特性,结果显示,突变菌株生长曲线与野生菌株有明显差异,两株突变菌株的产氢量分别是原始菌株的1.31和1.76倍,达到454mL/L和604mL/L.双突变菌株产氢能力较phbC基因和hupL基因单突变菌株的产氢能力有明显提高,说明phbC和hupL基因对菌株R. palustris 的产氢代谢有着显著的影响.     

来自Bacillus circulans WZ-12的二氯甲烷脱卤酶基因dcmR的克隆和表达

通过PCR方法从Bacillus circulans WZ-12中分离到二氯甲烷脱卤酶基因dcmR,构建具T7强启动子的pET28b(+)-dcmR质粒,电击转化Escherichia.coli BL21(DE3),构建了二氯甲烷生物降解基因工程菌BL21[pET28b(+)-dcmR].重组菌经IPTG诱导后,表达蛋白占总蛋白的32%.表达蛋白的酶活最高可达25.78 U/mL,酶的比活(以蛋白计)为88.86 U/mg.重组菌周质中酶活2.92 U/mL,胞内酶活22.86 U/mL.重组菌产生的酶的活力和比活较原降解菌株高1~2倍.对工程菌的生长特性和降解特性的研究表明,工程菌在LB培养基中的生长特性与原始菌株没有差别,生长至对数期A600 nm值都可达2.4左右.重组菌株dcmR-1在25 h的降解率达90%以上,降解效率比原降解菌株有明显提高.该基因工程菌的构建对二氯甲烷生物降解机制研究以及复合污染环境的生物修复和工程应用具有实际意义.     

4-甲基喹啉的微生物降解研究

从处理油制气废水的活性污泥中分离得到一株可降解喹啉的菌Q10，经鉴定为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)。该菌还可以降解4——甲基喹啉，本文着重研究了该菌在好氧条件下对4——甲基喹啉降解特性。实验结果表明，该菌在碱性条件下比在酸性条件下更有利于4——甲基喹啉的降解；温度为30℃时降解较快；振荡速度对降解没有明显影响；在适当的细菌浓度和底物浓度水平上，4——甲基喹啉具有较高的降解效率。实验也表明，菌Q10是一株喹啉衍生物广谱降解菌，具有重要的实用价值。     

三苯基甲烷类染料氧化酶基因(tpmD)在大肠杆菌中的无诱导表达

为了解决嗜水气单胞菌DN322对鱼类的潜在致病性问题,有必要克隆表达该菌的三苯基甲烷染料脱色酶基因tpmD.通过PCR方法获得该基因,并与脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子和用于荧光标记的编码CCPGCC的碱基序列融合,将有启动子和无启动子的融合基因片段分别连接到质粒pMD18-T中,转化大肠杆菌E.coli DH5α和E.coli BL21.结果发现,有启动子的融合基因能被E.coil在不加诱导物IPTG的条件下高效正确表达,脱色酶活性甚至超过基因供体菌DN322.将上述两株大肠杆菌工程菌株在自然水体中进行孔雀石绿污染小试处理,60d内在每个350mL反应体系中累积共投加大于10000mg的孔雀石绿,脱色率一直保持在92%以上;细菌数量最后增加了5～10倍.研究结果证明,基因工程菌在不加营养物的条件下也有很强的脱色活性和长期的存活能力;在tpmD基因3'端加入的用于螯合双砷荧光染料的18bp编码氨基酸碱基序列不影响此基因的表达和酶的脱色活性,这将赋予此工程菌可示踪性.     

萘降解菌N19-3的分离、鉴定和萘双加氧酶基因的检测

从石油污染土壤中分离到一株高效降解萘的N19-3菌株. 经形态观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析等鉴定其为丛毛单胞菌属（Comamonas sp.）. 该菌株能在30 ℃,30h内将1 000mg/L的萘完全降解. 降解萘的适宜温度为20～30 ℃, 适宜pH为7.0～9.0. 0.1mmol/L的Ca2+和Fe3+对N19-3菌株降解萘有较强的促进作用, 0.1 mmol/L的Mn2+和Zn2+对N19-3菌株的生长和萘的降解也有一定的促进作用, 而0.1 mmol/L的 Cu2+则完全抑制了N19-3菌株的生长和萘的降解. 通过PCR方法在N19-3菌株中扩增出分别与C. testosteroni H菌株的萘双加氧酶铁硫蛋白大亚基基因（pahAc）与双加氧酶铁硫蛋白小亚基基因（pahAd）高度同源的核苷酸片断.      

地杆菌中基因Gmet＿1513对其产电及生物膜形成的影响

Geobacter metallireducens GS-15中存在Gmet＿1513基因可编码具有自动诱导结合域的LuxR家族转录调控因子，使GS-15借助N-酰基高丝氨酸内酯促进产电及生物膜形成成为可能.而目前有关地杆菌群感效应的相关研究大多基于投加化学信号分子或信号分子淬灭剂的手段，缺乏靶向性与精确性.本研究构建了Geobacter metallireducens GS-15的Gmet＿1513基因缺失突变株（Δgmet＿1513），研究Gmet＿1513在GS-15菌株发挥电活性过程中的功能.实验结果表明，Δgmet＿1513与野生型菌株相比产生群感效应信号分子的能力减弱，Δgmet＿1513外膜蛋白种类减少，生物电化学系统的启动时间延长且电流输出减弱.与此同时，激光共聚焦图像对比结果表明Δgmet＿1513无法形成成熟致密电活性生物膜，EPS成分显示Δgmet＿1513的蛋白质含量低，多糖、脂质含量高，使其电子产量低且转移困难，无法进行AHLs的识别及结合导致电子传递相关蛋白无法表达，电子传递多重受阻.本研究为今后以Gmet＿1513基因为靶标，利用群感效应相关蛋白表达调控地...     

脱色酶TpmD在大肠杆菌中的高效表达及纯化

用PCR方法从嗜水气单胞菌DN322基因组中扩增出编码三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD的基因,与表达载体pET-22b(+)连接构建成重组质粒pET22-tpmD,转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组工程菌株.结果表明,经IPTG诱导,脱色酶基因可高效表达,粗酶液降解结晶紫、孔雀石绿、碱性品红、灿烂绿的比活力达到569.5,386.9,516.1,273.0U/g.表达产物经Ni-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度达94.05%.对4种染料的比活力分别达到1075.3,1042.8,903.9,484.3U/g,重组质粒稳定存在于工程菌中,便于规模化发酵生产.     

3,5-二硝基苯甲酸降解菌A3的分离及降解特性

 从硝基苯类化合物废水处理系统中分离到一株3,5-二硝基苯甲酸降解菌株A3,经形态特征、生理生化以及16S rDNA序列分析,初步鉴定为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni).该菌能以200mg/L3,5-二硝基苯甲酸为唯一碳源,12h的降解率可达95%以上,24h可溶性有机碳(DOC)由72.5mg/L降至10.2mg/L,表明3,5-二硝基苯甲酸被降解矿化而不是被转化成其他有机物.当A3以200mg/L3,5-二硝基苯甲酸为唯一碳、氮源时,将底物转化为一种黄色代谢产物,该产物不易进一步降解.A3降解3,5-二硝基苯甲酸的适宜温度为20～30℃,最适pH值为5～9.     

沼泽红假单胞菌高效产氢hupL缺失突变株的构建

利用湖底淤泥分离的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CQU01作为出发菌株,构建吸氢酶大亚基基因hupL缺失突变株,以提高光合细菌菌株的产氢效率.以PCR扩增的hupL两侧hupS 和 hupC基因为同源重组双交换臂,连入pMD18-T载体;再将hupS, hupC 和Kmr基因与经SalⅠ和HindⅢ双酶切的pSUP202,构建靶向自杀载体pBPZ.经接合转移转化R. palustris CQU01菌株,成功获得沼泽红假单胞菌吸氢酶活性缺失突变株R. palustris CQU012.测定突变株的吸氢酶活性及生长和产氢特性,结果表明,突变株的产氢量比野生菌株提高了约50%,而生长特性与野生菌株没有显著差异.R. palustris CQU012 吸氢酶缺失突变株可望为工业废水的生物治理提供高效产氢工程菌株.     

喹啉降解菌筛选及其对焦化废水强化处理

以喹啉为目标污染物,从焦化厂废水处理工段活性污泥中分离出1株能利用喹啉作为唯一碳源、氮源及能源的高效降解菌DQS-01,经16S rRNA基因分析鉴定为丛毛单胞菌科食酸菌属(Acidovorax sp.)菌株.通过考察不同培养条件下DQS-01降解菌的生物量及喹啉降解率随时间的变化,确定其最佳降解条件为接种量10%、摇瓶转速150 r·min-1、初始p H 8.0~10.0、温度35℃.应用Haldane方程对该菌在不同喹啉初始浓度下的生长动力学过程进行了模拟,拟合曲线与实验测定值相关性良好.将该菌与高效苯酚降解菌混合菌株用于焦化废水的生物强化处理,在移动床生物膜反应器(moving-bed biofilm reactor,MBBR)运行72 h后,对焦化废水COD的降解率达到87.4%.     

萘降解菌MQ合成靛蓝的研究

利用萘降解菌(丛毛单胞菌)MQ完整细胞对吲哚进行转化合成靛蓝,结果表明菌株MQ具有较好的靛蓝合成能力,靛蓝产量在4h左右即达到稳定.薄层色谱和高效液相色谱分析结果表明,合成的蓝色产物为靛蓝.考察了反应温度及摇床转速对靛蓝合成的影响,结果表明最适温度和转速分别为25℃和150r·min-1.随后,采用表面响应法确定了菌株MQ合成靛蓝的最优条件:菌株接种量OD6602.16,吲哚浓度200.55mg·L-1,pH=6.91.在最优条件下,菌株MQ合成靛蓝的产量为53.05mg·L-1,比初始条件下的产量提高了179%.     

睾丸酮丛毛单胞菌对喹啉的微生物降解途径的研究

从油制气废水的活性污泥中分离得到一株可以在好氧条件下利用喹啉作为唯一碳源和能源的睾丸酮丛毛单胞菌 (Co mamonastestosteroni,编号为Q10 ) .浓度为 2 5 0mg L的喹啉可被该菌完全降解 ,TOC去除率为 70 % .实验结果表明喹啉首先降解为 1H— 2 氧喹啉 ,然后继续转化为 6 羟基— 1H— 2 氧喹啉、5 ,6 二羟基— 1H— 2 氧喹啉和 5 羟基— 6 (2 羧基乙烯基 )—1H— 2 吡啶酮 ,由此提出该菌降解喹啉的一种可能途径 .样品中还发现少量的 8 羟基— 1H— 2 氧喹啉 ,表明菌Q10 对喹啉的降解可能是通过以一种途径为主的多种途径进行的 .     

三株菲降解细菌的分离、鉴定及降解特性的研究

从石油污染土壤中分离纯化到 3株能以菲为唯一碳源和能源生长的革兰氏阴性杆菌、好氧、不形成芽孢、端生或侧生单根鞭毛 ,分别命名为菌株ZX4、ZX6和EVA17.据部分片段长度的 16SrDNA序列比对分析和生理生化试验结果 ,确认此 3株菌均为鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonas)细菌 ,菌株ZX4为少动鞘氨醇单胞菌 (S .paucimobilis) ,菌株ZX6为溶芳烃鞘氨醇单胞菌 (S .aromaticivorans) ,菌株EVA17尚不能确定 .分析了各菌株在系统发育中的分类地位 .菌株ZX4在 14d内对含量为 10 0 0mg·L-1的菲降解率可达 98 74%.不同底物实验结果表明 ,菌株EVA17可能同时拥有两条菲降解途径 .     

绿色荧光蛋白基因在根际优势菌株中的高效表达

从人工模拟污染土壤中的黄麻根际分离得到两株优势菌株。通过PCR技术对增强绿色荧光蛋白基因与质粒载体pTnMod Ocm进行体外重组构建新的质粒 ,并转化分离得到的优势菌株。结果表明增强绿色荧光蛋白基因在黄麻根际优势菌株中高效表达     

绿色荧光蛋白标记阿特拉津降解基因工程菌的特性

通过转化绿色荧光蛋白基因质粒,对阿特拉津降解基因工程菌进行标记.转化后,绿色荧光蛋白在细胞内表达情况良好.在含抗生素的LB培养基中,绿色荧光蛋白的表达水平高于LB培养基和基础培养基.在细胞生长的稳定期,绿色荧光蛋白表达水平高于停滞期和对数生长期.绿色荧光蛋白基因质粒转化和表达,不会对基因工程菌原有的降解能力产生影响,而且绿色荧光蛋白的表达水平和降解活性存在接近线形的正相关关系.荧光蛋白标记细胞投加到反应器活性污泥中,会以2种状态存在:游离态和附着态,而且初期游离态细胞的数量大于附着态细胞的数量.     

质粒基因强化活性污泥系统对2,4–D的降解

以携带质粒pJP4[含编码2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)降解功能的基因片段]的基因工程菌Pseudomonas putida SM1443::gfp2x (pJP4::dsRed)为供体菌,通过半连续流实验研究了质粒基因强化对活性污泥系统的2,4-D的降解效应及菌群结构的影响.结果表明,以初始浓度约为320mg/L的2,4-D为唯一碳源,向活性污泥系统投加携带pJP4质粒的基因工程菌P. putida,运行初期,降解促进作用不明显;随着半连续流反应的进行,促进作用显著增强.与对照系统相比,降解速率之差最高为6.67mg/(L·h).从基因强化系统中筛选到1株占有优势的接合子,经鉴定为Alcaligenes sp.::pJP4. Alcaligenes sp.本身不具备降解2,4-D的能力,获得质粒pJP4后,对2,4-D降解能力大幅度提高,与野生型2,4-D高效降解菌Bacillus sp.相当. PCR-DGGE分析表明,在受到2,4-D冲击条件下基因强化的活性污泥系统较对照系统保持了相对更加稳定的菌群结构.     

镉对孕鼠胎盘激素合成功能的毒性效应

为探究孕期低剂量镉暴露对胎盘激素合成功能的毒性效应,选择雌三醇和孕酮激素作为研究对象,基于研究的孕期低剂量镉暴露小鼠模型,通过生物化学方法检测镉暴露小鼠的血液和胎盘中的雌三醇和孕酮激素含量及其合成底物浓度,并通过实时定量PCR法对胎盘中相关激素合成基因的表达水平进行检测.结果表明,孕期低剂量镉暴露可导致小鼠血清和胎盘中...