烷烃降解菌的筛选、鉴定及优势菌株的降解特性

以正庚烷为唯一碳源,从长期受到石油污染的土壤中筛选获得可利用正庚烷的微生物14株.通过形态观察和16S rDNA序列比对,鉴定G2、G9、G14为红球菌属,G3、G27为人苍白杆菌属,G4、G7为芽孢杆菌属,G5、G10、G15、G25为节杆菌属,G16为缺陷短波单胞菌,G17、G22为嗜麦芽寡养单胞菌属.通过考察其降解烷烃的能力,确定Rhodococcus sp.G2为烷烃降解优势菌株.该菌株可代谢庚烷获得最大菌体浓度D600 nm=7.51.同时该菌对不同碳链长度的烷烃,如十二烷、十六烷、煤油和二甲苯均具有较强的降解能力,以十二烷为碳源的最大比生长速率为0.37 h-1,最高菌体浓度为D600 nm=12.00,在正十六烷中生长,最大比生长速率为0.23 h-1,在煤油中生长,最大比生长速率为0.14 h-1,在以二甲苯为唯一碳源时,D600 nm也可达到1.00左右.研究表明该菌株对于石油污染土壤的生物修复有很大的应用前景.图6表2参9     

油水双相体系中分枝杆菌降解植物甾醇产9-羟基雄烯二酮的工艺

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-羟基-雄烯二酮,9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,主要用于糖皮质激素类和性激素类药物的生产,可由微生物转化法降解植物甾醇而得.植物甾醇在水中的溶解度极低,生物可利用度不高,严重制约了微生物对植物甾醇底物的利用效率.为进一步提高目的产物9α-OH-AD的摩尔得率,以前期诱变筛选的Mycobacterium sp.LY-1作为出发菌株,考察不同HLB值的表面活性剂对9α-OH-AD摩尔得率的影响,筛选得到最适表面活性剂,并建立高效的油水转化体系(油水体系的HLB=7.3).结果表明,HLB值为15的表面活性剂Tween-80有利于提高9α-OH-AD的摩尔得率,当添加4.0g/L Tween-80时,9α-OH-AD的摩尔得率达到38.5%.在该工作基础上,发现添加促溶剂100.0 g/L的大豆油对分枝杆菌转化植物甾醇生成9α-OH-AD具有促进作用.同时,添加4.0 g/L Tween-80和100.0 g/L大豆油时,当植物甾醇质量浓度为30 g/L时,9α-OH-AD摩尔得率为36.9%,9α-OH-AD质量浓度达到8.17 g/L,较对照提高了324.1%.本研究表明建立的油水转化工艺体系在一定程度上增加了底物质量浓度,提高了菌体的转化能力,结果可为甾醇生物转化体系的研究提供重要的参考信息.(图3表2参17)     

1株高效油脂降解菌株的筛选及其降解特性研究

从学校餐厅污泥中分离得到7株油脂降解菌。以芝麻油为唯一碳源,通过驯化培养、初筛和复筛得到1株芝麻油降解优势菌株。菌种特性研究表明其为好氧菌,降解芝麻油的最适温度为30~37℃左右,pH值为8.0;在最佳生长环境下,该菌株在含20g·L-1芝麻油的培养基中72h内对油脂的降解率达80%以上。     

氯氰菊酯降解菌的筛选鉴定及其降解特性研究

从农药厂废水排放口附近的污泥中分离到1株能降解氯氰菊酯的细菌LQ-3.根据其形态、生理生化特征和16S rDNA(GenBank Accession No.FJ222585)序列分析,将该菌株鉴定为Starkeya sp..LQ-3菌株只能以共代谢方式降解氯氰菊酯,在有酵母粉、蛋白胨、葡萄糖等营养物质存在的条件下,5 d内对20 mg·L-1氯氰菊酯的降解率达到72.1%.LQ-3菌株降解氯氰菊酯的最适温度为30 ℃左右,pH值为7～8.LQ-3菌株还能降解功夫菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯和溴氰菊酯.酶的定域试验表明,LQ-3菌株降解氯氰菊酯的酶属于胞外酶.     

呋喃丹降解菌CFDS-1的筛选鉴定及降解特性

为有效治理呋喃丹的污染,从受呋喃丹长期污染的土壤中分离筛选到一株高效降解呋喃丹的菌株CFDS-1,经形态、生理生化、16S rDNA(GenBank accession No.AY702969)同源性及系统发育地位等分析,将其初步鉴定为Sphingomonas sp.当接种量为5%时,CFDS-1能在48 h内降解100 mg L-1的呋喃丹,对于高达300 mg L-1的呋喃丹依然有降解效果;CFDS-1对呋喃丹的降解率与起始接种量呈正相关;降解呋喃丹的最适pH是8.0～9.0;在20～42℃范围内,温度对CFDS-1降解呋喃丹没有显著影响;该菌在250 mL三角瓶中装液量为100 mL时,对呋喃丹的降解效果最好.土壤实验表明,该菌株同样能有效地降解土壤中的呋喃丹残留.     

原油高效降解真菌的筛选、鉴定及降解酶活性

原油开采、加工和运输过程中会造成环境污染.为获得原油高效降解真菌,以采集自内蒙古、广西和北京的56株真菌为材料,开展高效降解菌筛选、鉴定及降解酶研究.通过原油耐受性初筛和愈创木酚、α-萘酚、苯胺蓝平板复筛,获得目标菌株JY-11.结合形态与分子鉴定,确定该菌株为硬毛香菇(Lentinus strigosus),其菌丝体...     

一株氰氟草酯降解新菌株Sphingopyxis sp.WP9的分离鉴定及降解特性

氰氟草酯是应用于稻田的一种除草剂,其广泛使用给水生生态带来了一定威胁.利用连续富集培养的方法,从农药厂活性污泥中筛选出一株氰氟草酯高效降解菌WP9.采用16S rRNA基因序列分析并结合菌落菌体形态和生理生化特性,将菌株WP9鉴定为鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis).在以100 mg/L氰氟草酯为唯一碳源的无机盐培养基中,菌株WP9在120 h内可将其降解97.03%.菌株WP9降解炔草酯的最适温度和pH分别为30℃和7.0;当菌株WP9的接种量≥5%时,其对100 mg/L氰氟草酯的降解效果较好;当氰氟草酯浓度≤100 mg/L时,菌株WP9对氰氟草酯的平均降解速率随着底物浓度的增加而呈指数增长.通过超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS)鉴定降解产物为氰氟草酸和氰氟草酚,推测氰氟草酯首先通过酯键水解生成氰氟草酸,然后氰氟草酸通过醚键水解生成氰氟草酚.本研究关于鞘氨醇盒菌对氰氟草酯降解的报道结果,可为开展氰氟草酯污染环境的生物修复提供新菌种和理论基础.(图8参30)     

菲降解菌的筛选鉴定及其降解酶基因的研究

经过富集从活性污泥中筛选出两株菲降解菌WSCII和WSCIII,经16SrDNA鉴定,它们分别属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp. )和假单胞菌属(Pseudomonassp. ),在28℃下4d内对菲( 0. 6g/L)的降解率分别达到了70. 9%和78. 1%;在LB、萘和菲为碳源的培养条件下,测得菌体的双加氧酶比活力不同.在菲的诱导下,两株菌的双加氧酶比活力最高,而以LB和萘为碳源时酶的比活力较低,其中WSCII在萘中不能生长;这表明该酶在两菌中皆为底物诱导表达.以其它菌的萘双加氧酶基因大亚基片段做模板制备异源探针,与两菌总DNA进行斑点杂交;结果表明,这两株菌可能含有不同的菲双加氧酶基因.利用简并引物进行PCR扩增菲双加氧酶,结果仅能从WSCIII的总DNA中扩增得到目的片段,序列分析证明,该基因与已报道的(P. putidaNCIB9816 -4, AF491307 )双加氧酶同源性最高为98%. 图5参10     

原油降解细菌ODB01的筛选、鉴定及降解特性

从长庆油田被原油污染土壤中筛选出1株以原油为唯一碳源的菌株ODB01。经菌株生理生化特征及16S r DNA序列分析,鉴定为肠杆菌属(Enterobacter sp.)细菌;运用响应曲面法优化细菌ODB01对原油的降解条件为p H值为8.91,w(NaCl)为1.19%,油菌比为1∶4.12,温度为36.78℃,在该条件下细菌ODB01对原油的降解率为34.6%;分别添加w=0.05%土温80(Tween 80)和w=0.05%辛基苯基醚(Triton X-100)后,细菌ODB01对原油降解率分别达到42.5%和46.1%。结果表明,细菌ODB01对原油具有一定的降解能力,有望作为一种微生物修复剂进行开发。     

厌氧条件总磷还原为磷化氢种泥筛选及功能菌株鉴定

厌氧除磷是一种高效、节能、低耗的方法。获取经济、方便、高效的种泥是实现该方法的前提,种泥中产生磷化氢功能菌株的组成及特性是提高处理效能和开发新工艺的基础,目前此研究未见有关报道。本研究依据厌氧除磷理论,利用厌氧培养反应瓶、筛选培养基和微生物筛选、分离、鉴定的方法。以A2/O厌氧池、污泥浓缩池污泥、养殖场新鲜猪粪、鸡粪、牛粪及鸭粪为研究种泥,通过跟踪厌氧培养过程培养液中总磷的去除率和吸收液中磷化氢的生成量筛选出最佳种泥,并对最佳种泥的菌株进行筛选、分离和鉴定。结果表明,6种泥中鸡粪的厌氧除磷能力最强,鸭粪能力最弱,浓缩池中的污泥和猪粪次之,牛粪及厌氧池污泥有一定的作用。本试验条件下鸡粪是厌氧除磷的最佳种泥。经过3个周期的厌氧培养,6种泥培养液总磷的去除率和吸收液中磷化氢的含量随培养时间增长都有不同程度增加。鸡粪的最佳培养时间为5d。鸡粪培养液经21d培养后分离到1株芽孢杆菌属、1株假单胞菌属及2株肠杆菌科,明确了2株肠杆菌科中1株为埃希氏菌属另1株为柠檬酸杆菌属。     

硝基芳香烃降解菌株的分离、鉴定和应用

从被二硝基甲苯(DNT)和三硝基甲苯(TNT)污染的土壤中分离到5个高效降解硝基芳香烃类化合物的菌株TD1、TD2、TD3、TD4和TD5。16S rDNA序列分析表明,TD1、TD2、TD3和TD4属于节杆菌属(Arthrobacter),TD5属于不动杆菌属(Acinetobacter)。菌株复配试验表明,TD1、TD2、TD3、TD4和TD5的体积比例为2:2:2:1:1时对含有DNT和TNT的炸药废水的CODC r去除率最好。最佳复配的菌液投加到装有合适填料载体的生物反应器中用于处理炸药废水,运行47d后出水CODC r不超过200 mg/L,硝基苯类化合物的浓度在2 mg/L以下。     

不对称还原丙酮酸乙酯菌株的筛选及鉴定

以丙酮酸乙酯为底物,从成都某化工厂污水池及其附近土壤中分离到36株可将丙酮酸乙酯不对称还原成(S)-乳酸乙酯的菌株.经过多次复筛,最终获得了一株具有较高催化活性的酵母菌BTY18-6.在以该菌株静息细胞为催化剂,催化不对称还原丙酮酸乙酯合成(S)-乳酸乙酯的反应中,底物浓度为60 mmol/L时,底物转化率为86.9%,产物(S)-乳酸乙酯的ee值为88.7%.通过对其形态学、生理生化特征及其26S rDNA Dl/D2区域的分析表明,BTY18-6为胶红酵母.     

一株同时降解3种邻苯二甲酸酯降解菌的筛选鉴定及降解特性

选择邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(DnBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)作为目标污染物,采用富集驯化法从设施菜地土壤中筛选出1株可同时降解DMP、DnBP和DEHP的细菌MB1.经形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析,初步鉴定为微杆菌属(Microbacterium sp.).通过正交试验研究了该菌株的最优降解条件以及最优条件下该菌株的生长曲线和降解曲线,最后在培养条件下研究了该菌株对人工污染土壤中邻苯二甲酸酯的降解特性.结果表明,菌株MB1的最优降解条件为:pH值为8,温度为25℃,接菌量为5%,每种邻苯二甲酸酯浓度为300 mg·L~(-1).在此最优条件下该菌株呈S型曲线增长,7 d后无机盐培养液中DMP、DnBP和DEHP的降解率分别为99.62%%、99.65%和55.26%.人工污染土壤中空白试验和投加菌株试验结果为:在不添加菌液的处理中,灭菌土壤21 d时DMP、DnBP和DEHP的降解率分别为3.86%、4.19%和2.01%;未灭菌土壤21 d时对DMP、DnBP和DEHP的降解率分别为4.82%、5.99%和3.44%.在添加菌液的处理中,21 d时土壤灭菌处理中DMP、DnBP和DEHP的降解率分别达94.45%、95.65%和39.21%;而土壤未灭菌处理中DMP、DnBP和DEHP的降解率分别达94.93%、95.99%和41.16%.该结果表明:土壤中土著微生物仅能降解微量PAEs,菌株MB1对土壤中DMP、DnBP和DEHP等3种PAEs污染物具有较为高效的降解能力,未灭菌土壤中邻苯二甲酸酯的降解效果略高于灭菌土壤.     

烷烃降解菌SY16的筛选、鉴定及降解能力测定

油田生产和运输中经常发生原油落地以及漏油现象,造成大量的石油进入地表土壤,从而产生环境污染。针对原油对土壤产生的环境污染问题,对微生物降解烷烃的能力进行了研究。在以正十六烷为唯一碳源的HDM培养基中,从扶余油田东区采油三厂经常被含油废水浸泡的土壤中,分离、筛选出一株高效降解正烷烃的菌株SY16。经形态学观察和生理生化特征研究,鉴定为施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)。通过摇瓶试验得出两菌株的最适生长条件为30℃,培养基初始pH 8.0,摇床转速为180 r/min,接种量为1.0%。在最适生长条件下,分别对不同初始质量浓度烷烃进行降解率试验。结果表明,两菌株降解正烷烃的能力显著,当培养基中初始正烷烃含量为50 mg/L时,24 h能全部降解。当混合烷烃中各烷烃的初始质量浓度为50 mg/L时,在24 h对正十烷、正十二烷、正十六烷和正十八烷的降解率分别达到47.0%、42.6%、38.8%、36.2%。     

偶发分枝杆菌发酵断甾醇侧链积累9α-羟基雄烯二酮

利用偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)CICC 10279发酵断甾醇侧链进行定向菌株筛选;对选出的具有较高甾醇降解活性的菌株,借助TLC法开展多批次生物降解实验过程研究;并重点对积累9α-羟基雄烯二酮(9α-OH-AD)化合物的菌株稳定性及转化过程进行考察;在此基础上利用选出的22号菌株分别进行底物为胆固醇和植物甾醇的半微量制备实验.结果显示,分离的样品具有高纯度,HPLC分析为95.7%;TLC、HPLC、MS、1H N M R、13C N M R、i.r.等光谱数据分析结构确证其为9α-OH-A D;半微量制备实验以胆固醇或植物甾醇为底物,9α-OH-A D重量收得率分别可达34.0%和30.8%.本研究可能为高效含卤(氟,氯)皮质激素药物工业生产提供了一种很有用处的中间体.     

一株高效邻苯二甲酸二丁酯降解菌的筛选、鉴定及其降解特性研究

从活性污泥中分离出1株以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)为碳源和能源生长的高效降解菌DP-2,经形态观察、生化鉴定及16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为不动杆菌(Acinetobacter sp.).采用单因素试验研究了不同试验条件(接种量、DBP浓度、NaCl浓度和碳源)对菌株DBP降解特性的影响,结果表明:接种量大于10%时,菌株DP-2在3 d内对初始浓度为10 mg·L~(-1)的DBP降解率可达到90%以上;DBP初始浓度为5—50 mg·L~(-1)时,菌株在6 d内对DBP降解率均能达到90%以上,但高浓度DBP会影响菌株DP-2生长,DBP浓度为1000 mg·L~(-1)时,DBP降解率仅为26.88%;菌株降解DBP的最佳NaCl浓度范围为0—20 g·L~(-1);此外,醋酸钠、蔗糖、葡萄糖添加对于菌株降解DBP均有一定的促进作用,其中葡萄糖效果最为明显.在此基础上,采用响应曲面法优化了菌株降解DBP的培养条件并进行了试验验证,在盐度为5 g·L~(-1),接种量为17.14%,底物浓度为9.81 mg·L~(-1),菌株对DBP的降解率为85.86%.     

海洋石油降解菌的筛选与降解特性

用采自山东胜利油田的石油污染水体,以原油为唯一碳源,经人工海水培养基富集培养,得到lO株细菌.通过降解率的测定,发现其中一株细菌HB-1具有较强的石油降解能力,200 r/min振荡培养6 d,其原油的降解率达54.74%.根据菌落特征、菌体形态、生理生化特性和16S rDNA序列分析,确定HB-1为不动杆菌属(Acinetobacter sp.).进一步实验表明,该菌株最适宜牛长和降解石油的条件为:温度25～32℃,初始pH值6.5～7.5,盐度3%,此条件符合实际海洋环境的要求.图6表2参22     

麦草畏降解菌株Ochrobactrum sp.3-3的分离鉴定及其降解特性

麦草畏是理想的抗除草剂转基因工程的靶标除草剂;发掘新的麦草畏高效降解菌株和基因具有非常重要的理论和应用价值.从南京土壤样品中分离到一株麦草畏高效降解菌株,命名为3-3.根据生理生化特征和16S r DNA序列相似性分析,将其初步鉴定为苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.).菌株3-3在48 h内完全降解100 mg/L的麦草畏.该菌株降解麦草畏的最适温度为30℃,最适p H为7.0.代谢产物高效液相和质谱鉴定结果表明该菌株降解麦草畏的起始步骤是脱甲基,形成没有除草活性的3,6-二氯水杨酸(DCSA).菌株粗酶液只在NADH存在时才有麦草畏脱甲基酶活性.PCR扩增和该菌基因组生物信息学分析表明该菌株没有已报道的麦草畏脱甲基酶基因DMO、Mtv及Dmt或其同源序列.总之,本研究首次分离筛选到苍白杆菌属的麦草畏降解菌,且该菌可能存在一个新的氧化酶类麦草畏脱甲基酶基因.     

麦草畏降解菌株Sphingobium sp.Dca-5的分离、鉴定及降解特性

麦草畏是一种广谱高效除草剂,随着抗麦草畏转基因作物的推广和使用,麦草畏的使用量急剧增加.为研究麦草畏的微生物降解机制,发掘新的麦草畏高效降解菌株和基因资源,从农药厂排污口土壤中筛选到一株以麦草畏为唯一碳源生长的鞘酯菌属(Sphingobium sp.)细菌Dca-5.该菌株48 h内完全矿化2.0 mmol/L的麦草畏,并检测到代谢产物3,6-二氯水杨酸,表明该菌株通过脱甲基起始麦草畏降解.Dca-5粗酶液在添加NADH时具有麦草畏脱甲基酶活性,但加入细胞色素P450抑制剂1-氨基苯并三唑、增效醚或马拉硫磷后酶活受到显著抑制.在Dca-5基因组中找到两个3,6-二氯水杨酸降解基因簇但未发现DMO和dmt同源基因.结果表明菌株Dca-5中的麦草畏脱甲基酶是一个新的细胞色素P450类单加氧酶.本研究为阐明麦草畏的微生物降解代谢机制,获得新的麦草畏脱甲基酶基因提供了菌株材料和理论依据;并且Sphingobium sp. Dca-5能快速矿化麦草畏,在麦草畏污染土壤的微生物修复方面具有良好的应用前景.(图8表1参27)     

杀草丹降解菌Bacillus sp. T2的筛选、鉴定及降解特性

为研发稻田除稗剂杀草丹污染环境的生物修复技术和探究杀草丹微生物降解代谢机制,通过微生物驯化与富集技术,从长期施用杀草丹水稻田土样中分离纯化一株能够以杀草丹为唯一碳源生长的高效降解菌株T2,在36 h内对0.4 mmol/L的杀草丹降解率达到98.3%以上.根据其形态、生理生化特征及16S rRNA基因序列相似性分析,将其初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.T2).通过GC-MS鉴定产物为对氯苄硫醇、对氯苯甲醛和对氯苯甲酸;依据产物鉴定结果推测菌株T2通过硫酯键水解的方式起始杀草丹的降解,首先将其转化为对氯苄硫醇,随后进一步被氧化为对氯苯甲醛和对氯苯甲酸,该降解途径可能是一种新的杀草丹微生物降解代谢途径.因此菌株Bacillus sp.T2对杀草丹具有非常高的降解效率,在污染环境的微生物修复方面具有很好的应用前景;本研究结果也为揭示土壤中杀草丹微生物降解代谢过程及机制提供了研究材料和理论依据.