石斛不同极性成分的提取及其对肺癌细胞的抑制作用

为探究石斛(Dendrobium)的不同极性成分对人肺癌细胞抑制作用的差异,寻找到石斛抗癌活性成分高效提取的方法,采用极性不同的溶剂和方法对金钗石斛(D.nobile)、迭鞘石斛(D.denneanum)的药用成分分别进行提取以及层析柱纯化,以CCK-8实验检测不同极性提取物对人肺癌细胞和正常细胞的抑制作用,同时采用傅里叶变换红外光谱仪分别对石斛的乙醚和乙醇提取物成分进行检测和比较.结果显示,石斛的不同极性成分抑癌作用差异显著,石斛的抑癌成分极性较小,易溶于乙醚.经石油醚预洗后的石斛乙醚提取物对肺癌细胞的抑制作用较强,100μg/mL的金钗石斛与迭鞘石斛提取物对肺癌A549细胞的24 h抑制率分别为45%和40%.而传统中药成分提取中常用的水和乙醇对石斛抗癌成分的提取效率较低.红外光谱分析亦显示石斛的乙醚提取物与乙醇提取物化学成分上存在较大差别,因此对于石斛抗癌成分的提取应采用极性较小的乙醚等溶剂.此外,发现金钗石斛的特定极性组分C具有较强的抑制肺癌细胞作用,其100μg/mL的浓度对肺癌A549细胞的24 h抑制率达到97%,可作为石斛抗癌新药筛选的来源.因此,金钗石斛和迭鞘石斛的抑癌成分具有特定的极性,结果可为石斛抗癌成分及抗癌作用的进一步研究和利用提供参考.     

迭鞘石斛抗肿瘤作用研究

体外培养SMMC-7721和HL-7702细胞,以不同浓度的迭鞘石斛多糖、醇提物、水提物作为药物组,并设生理盐水组作为阴性对照,5-Fu组作为阳性对照,MTT法分别测定处理24h、48h、72h后的吸光度值,计算药物对细胞生长的抑制率.荷瘤小鼠分别腹腔注射迭鞘石斛3种提取物,连续注射10d,d11眼眶静脉取血,测定血清中MDA含量及SOD活力变化.体外实验发现浓度为160μg/mL的迭鞘石斛多糖作用48h,对SMMC-7721细胞的生长抑制作用最强,且对HL-7702细胞的毒害作用较小.体内实验发现,迭鞘石斛多糖能显著增强荷瘤小鼠血清中SOD活力(P<0.01),降低MDA含量(P<0.01).研究表明,迭鞘石斛多糖是一种具有潜力的抗肿瘤天然药物.图1表2参8     

不同LED光质对迭鞘石斛生理及品质的影响

设置6种光质,自然光(对照,N5)、100%红光+0%蓝光(R5)、100%蓝光+0%红光(B5)、80%红光+20%蓝光[RB(4:1)]、60%红光+40%蓝光[RB(3:2)]、40%红光+60%蓝光[RB(2:3)],测定不同处理时间迭鞘石斛的生理指标以及多糖、黄酮的含量.结果显示光质对迭鞘石斛生理及品质有较为明显的影响.B5处理组的超氧化物歧化酶含量最高;R5处理组的丙二醛含量最高.RB(3:2)处理组的叶绿素含量最高,RB(2:3)处理组的可溶性糖、可溶性蛋白、多糖含量都最高;N5处理组的黄酮含量最高.R5处理组的叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白、多糖和黄酮含量都较低,说明纯红光并不利于迭鞘石斛生长.此外,不同处理天数下丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖、多糖和黄酮含量整体上呈现上升趋势;超氧化物歧化酶活力整体下降趋势;叶绿素含量整体上呈现先下降后上升的趋势.本研究说明红蓝光配比有利于迭鞘石斛生长发育和次生代谢物质积累,对迭鞘石斛组培苗的光控培养和品质改良具有生产上的指导意义.     

迭鞘石斛多糖降血糖作用研究

研究了迭鞘石斛多糖对动物血糖的调节作用.采用尾静脉注射四氧嘧啶造成高血糖动物模型,按高剂量(300mg/kg)、中剂量(100 mg/kg)和低剂量(30 mg/kg)的迭鞘石斛多糖分别灌胃给药,同时设阳性对照组和阴性对照组,测定血糖水平.结果表明,迭鞘石斛多糖能显著降低四氧嘧啶高血糖小鼠空腹血糖,增强四氧嘧啶高血糖大鼠的糖耐量,而对正常小鼠空腹血糖和正常大鼠糖耐量没有明显影响.研究表明,迭鞘石斛多糖具有明显的降血糖作用,是一种值得开发利用的降糖植物多糖.表6参10     

卡瓦胡椒素B对人非小细胞肺癌A549细胞的抑制作用

卡瓦胡椒素B是药用植物卡瓦胡椒根中的一种天然查耳酮类化合物,研究了其对人非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制作用及其诱导细胞凋亡的分子机制.实验结果显示,卡瓦胡椒素B能显著抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖,且随着药物浓度的增加、处理时间的延长其抑制作用呈明显的剂量时间效应;同时,卡瓦胡椒素B能显著诱导A549细胞凋亡、细胞周期阻滞于G2-M期;分子机制研究表明,卡瓦胡椒素B能通过活化JNK激酶活性、下调凋亡抑制蛋白survivin的表达以及激活PARP活性从而导致其对A549细胞的增殖抑制作用.结果表明卡瓦胡椒素B对人非小细胞肺癌的预防与治疗可能具有潜在价值.     

汽油尾气对人肺腺癌A549细胞的氧化损伤效应研究

为研究汽油燃烧汽车尾气(简称汽油尾气)的氧化损伤效应及其可能的毒作用机制,以人肺腺癌A549细胞为研究对象,采用MTT试验测试汽油尾气对细胞的毒性作用;通过测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性了解细胞在汽油尾气作用下抗氧化水平的改变;并用彗星试验检测汽油尾气对细胞DNA氧化损伤及修复的影响．结果显示汽油尾气在浓度≥0．0625L·mL-1时即显示出明显的细胞毒性;汽油尾气作用下A549 细胞SOD及GSH-Px活性均下降,在一定的浓度范围内与对照组比较有统计学差异(p<0．05)．汽油尾气可诱导 A549细胞不同程度的DNA氧化损伤,且细胞拖尾率和DNA迁移长度均随着汽油尾气浓度的增加而增加;损伤后 A549细胞修复发生较快,3小时内基本修复完全．提示汽油尾气具有明显的细胞毒性作用,可影响A549细胞抗氧化酶活性,并可导致DNA的氧化损伤．     

蛋白质组学在环境毒理学中的研究进展

蛋白质组学是系统生物学的重要组成部分,它以整体、动态和定量的原则来研究各种蛋白质的功能,系统地分析生物体内蛋白质表达,蛋白-蛋白相互作用和翻译后修饰等特征,已成为后基因组时代不可或缺的分析工具。蛋白质组学技术具有高通量的特征,能实现对蛋白质的高效快捷的定量分析。将蛋白质组学技术应用于环境毒理学研究,可从蛋白水平上研究外源性化合物对机体的毒性作用机制,并从中筛选出具有较高特异型和高灵敏度的蛋白标志物,为污染物的健康风险评估提供新的技术手段。本文综述了蛋白质组学技术的主要研究方法、研究策略和在环境毒理学研究中的应用,重点讨论了蛋白质组学技术在重金属和有机化合物尤其是持久性有机污染物(POPs)毒性评估中的应用。     

大气中细颗粒物对肺癌细胞A549迁移和侵袭作用的影响

采集大连城区大气中可吸入性细颗粒物(PM_(2.5)),研究其对肺癌A549细胞迁移、黏附和侵袭力的影响,利用明胶酶谱法检测细胞分泌的基质金属蛋白酶活性,利用Western blot法测定A549细胞中转移相关蛋白的表达。结果表明,在无明显细胞毒性浓度下,PM_(2.5)可增加A549细胞的迁移速率;细胞与细胞外基质的黏附率增加;细胞侵袭实验结果表明PM_(2.5)可增加A549细胞穿透基底膜的能力;用明胶酶谱法检测发现PM_(2.5)可使A549细胞分泌的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活性增强。转移相关蛋白——细胞钙粘蛋白-N(N-cadherin)的表达量升高,而钙粘蛋白-E(E-cadherin)的表达量下降,实验结果表明,PM_(2.5)可增强A549细胞的侵袭性,大气中的可吸入性颗粒可能导致肺癌转移发生率增加。     

拟茎点霉属Phomopsis sp.S4菌株发酵产物对稻瘟病菌细胞膜的抑制作用

内生真菌拟茎点霉属真菌Phomosis sp.S4菌株发酵次生代谢产物对多种植物病原菌具有良好的抑菌效果,在防治农作物病害上具有应用前景.为探究S4菌株发酵产物对植物病原真菌的抑制机理,以稻瘟病菌为研究材料,通过普通抑菌实验、扫描电镜、荧光定量PCR以及生理实验,检测S4菌株发酵液提取物对稻瘟病菌细胞膜的作用情况.扫描电镜实验显示经S4菌株提取物处理的稻瘟病菌菌丝严重变形,菌丝表面出现大量褶皱,表明提取物对稻瘟病菌细胞膜和细胞壁的完整性造成破坏.荧光定量PCR检测到细胞膜中重要组成成分麦角甾醇合成途径中相关基因的变化情况,麦角甾醇合成途径中ERG1、ERG11、ERG6基因分别下调了2.0、1.40、2.7倍,ERG7基因上调了1.38倍.随后的生理实验也表明经过S4提取物处理的稻瘟病菌确实存在细胞内容物泄露的情况.本研究表明S4提取物通过抑制麦角甾醇合成而破坏细胞膜的完整性导致细胞内容物泄露,从而达到抑制真菌生长效果.     

甲醛所致DNA-蛋白质交联修复的研究

为了探讨机体对甲醛所致DNA-蛋白质交联的修复能力,采用KCl-SDS沉淀法检测甲醛染毒后不同时间段HepG2细胞和小鼠肝细胞中DNA-蛋白质交联的修复情况.实验结果表明,采用75μmol·L-1甲醛染毒HepG2细胞,在染毒18h和24h后,细胞内的DPC水平较染毒结束时发生了显著下降(p<0.01),且与空白对照组相比无显著差异;由3.0mg·m-3气态甲醛产生的DNA-蛋白质交联在12h内可以得到明显修复(p<0.01),并在24h内恢复到空白对照水平;经20mg·kg-1液态甲醛染毒后,18h时DPC含量与空白组相比有显著性升高(p<0.01),在24h时DPC含量与18h时相比有显著的下降(p<0.05),且与空白组相比无显著差异.以上结果显示:甲醛所致肝细胞DNA-蛋白质交联能够得到修复,且24h内能够修复完全.     

毛兰素诱导结肠癌SW480细胞凋亡的分子机制

毛兰素是名贵中药材石斛的活性化合物之一,研究了其对人结肠癌SW480细胞的增殖抑制作用及其诱导的细胞凋亡分子机制.实验表明,毛兰素能显著抑制结肠癌SW480细胞的增殖,且随着药物浓度与时间增加,抑制率呈明显的剂量时间效应,48 h半数抑制浓度IC50为24.5 nmol/L;毛兰素能显著诱导结肠癌SW480细胞凋亡,并诱导细胞周期阻滞于G2-M期;分子机制研究显示,毛兰素通过下调XIAP、Bcl-xL蛋白表达以及激活Caspase-9、Caspase-7、Caspase-3和PARP活性从而诱导SW480细胞凋亡.结果表明毛兰素可能对结肠癌的防治具有潜在药用价值.图6参17     

铁皮石斛多酚和黄酮含量及与抗氧化活性的相关性

通过测试ABTS、DPPH和羟自由基的清除活性和还原能力,研究铁皮石斛不同极性提取物的体外抗氧化活性及其与多酚和黄酮含量的相关性.采用溶剂提取法制备4个不同极性铁皮石斛提取物(EE、CE、EAE、NBE),以Vc为阳性对照.结果显示,样品CE中总酚含量为40.96 mg/g,黄酮含量为104.48 mg/g,在各样品中含量最高.体外抗氧化实验显示,样品CE浓度为375μg/mL时对ABTS自由基的清除率达到100%,其IC50为88.82μg/mL;CE浓度为1 500μg/mL时对DPPH自由基的清除率达到78.45%,IC50为394.62μg/mL;CE浓度为1 500μg/mL时还原能力为62.29%,随浓度增大到3000μg/mL时还原能力达100%,其IC50为905.06μg/mL.相关性研究显示各提取物对ABTS、DPPH清除能力以及还原性与黄酮含量相关性较强,相关系数分别为0.845、0.902和0.994.而各提取物的还原能力及对羟自由基的清除能力与样品中的多酚含量明显相关,其相关系数为0.521.研究表明,铁皮石斛4个不同极性提取物均具有较强的体外抗氧化活性,且各提取物抗氧化活性与总酚含量和总黄酮含量之间有明显的相关性,表明铁皮石斛抗氧化活性的物质基础可能就是酚类或黄酮类成分.     

不同方法对甘薯块根可溶性蛋白的提取效果

为建立一套适宜甘薯块根蛋白质组学分析的双向电泳体系(2-DE),采用匀浆法、丙酮沉淀法、TCA-丙酮沉淀法和酚提取法来制备甘薯块根可溶性总蛋白,并分别通过蛋白质定量、SDS-PAGE和2-DE技术来评估这4种蛋白制备方法提取甘薯块根蛋白质的优劣.结果显示,每0.5 g鲜薯块根,经Bradford方法测定蛋白质的得率分别为1.6 mg、2.4mg、1.2 mg、1.9 mg.SDS-PAGE的结果表明,匀浆法、丙酮法制备的蛋白质分离到的条带较少,且在约M r20×103处的储藏蛋白含量较高;TCA-丙酮法和酚提取法制备的蛋白质分离到的条带则明显多于前两种方法,且M r20×103处储藏蛋白的相对含量也明显减少.2-DE结果显示,匀浆法制备的蛋白质在进行双向电泳分析时,几乎不能完成聚焦过程,仅在凝胶的碱性端出现少量的蛋白质斑点,丙酮法和TCA-丙酮法要优于匀浆法,但是蛋白质斑点数量仍然较少,酚提取法提取的蛋白质在进行双向电泳时分离到的蛋白质斑点数最多,为1 120个,且在凝胶上均匀分布,背景清晰.综上所述,酚提取法是适宜甘薯块根蛋白质双向电泳样品制备的最佳方法.     

土壤宏蛋白质组学蛋白质提取方法及其应用

土壤宏蛋白质组学在揭示土壤微生物功能、代谢与环境相互作用方面具有广阔的应用前景,但由于土壤样品的特殊性,土壤蛋白质提取步骤是限制土壤宏蛋白质组学大规模应用的瓶颈之一.本文从样品制备、提取方法、影响因素等方面综述了土壤蛋白提取方面的研究进展.一般来说,根据实验目的、蛋白种类及后续研究方法设计相应的分组成收集策略才能取得较好的提取效果.土壤总蛋白、胞内蛋白与胞外蛋白分别有不同的提取方法.总蛋白提取一般采用直接提取法;胞外蛋白不需要裂解;胞内蛋白提取方法有直接提取法和间接提取法等.裂解、浓缩、去除腐殖质的方法以及提取液、pH值的选择等也会影响提取效果.此外,简单介绍了土壤宏蛋白质组学的应用,并对今后的研究工作提出展望.表1参36     

PM_(2.5)对人肺癌细胞A549迁移、侵袭能力的增强作用

为探讨PM_(2.5)(particulate matter 2.5)对人肺癌细胞A549迁移、侵袭能力的影响并探讨相关机制,采用含有不同浓度PM_(2.5)的无血清及抗生素培养液对A549细胞培养72 h,利用MTT法检测A549细胞的增殖抑制率。根据MTT实验结果,选择适当的PM_(2.5)暴露浓度用于后续实验,以细胞划痕实验检测细胞迁移能力,transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力,Western Blotting法检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、转录因子snail和slug、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)及胞核内β-链蛋白(β-catenin)的蛋白表达水平。结果显示:细胞划痕实验结果显示10μg·m L-1PM_(2.5)组A549细胞划痕创面愈合率为(46.34%±5.19%),与对照组比较显著增高(P<0.05);transwell小室法迁移和侵袭实验结果显示10μg·m L-1PM_(2.5)组穿膜细胞数平均为(165.67±6.62)个和(47.83±2.04)个,与对照组比较显著增多(P<0.05);Western Blotting实验结果显示PM_(2.5)(10μg·m L-1)可显著上调A549细胞cyclin D1、snail、slug、MMP-2、MMP-9和胞核内β-catenin蛋白表达水平。因此,PM_(2.5)可通过提高Wnt/β-catenin通路活性及其下游cyclin D1、snail、slug、MMP-2和MMP-9的蛋白表达而增强A549细胞的迁移、侵袭能力。     

四川石斛野生资源及其保护研究

回顾了四川石斛资源的开发历史,叫川石斛早在宋朝就有记载,过去资源十分丰富,而现在流失严重,已近枯竭.资源危机的原因有自身的生物学特性、生态环境的破坏以及长期的过度采挖等.讨论了保护石斛野生资源的意义.进一步介绍了作者在石斛保护生物学方而所开展的一些研究以及取得的阶段性工作进展.迄今为止,报道四川有野生石斛12种,附生在树上或岩石上,分布几乎遍及全川.本文首次报道万源有曲茎石斛,盐源有细茎石斛分布.共收集石斛野生资源15种,分别引自四川、云南、贵州等省份,同时开展了驯化和新品种选育,目前已筛选到2个优良株系.通过快速繁殖,已对石斛优质种源进行工厂化生产,并进行离体种质保存研究.药理实验结果表明,迭鞘石斛多糖具有降血糖和抗肿瘤作用.     

纳米硫化镉对A549细胞的损伤研究

研究纳米硫化镉(Nano-Cd S)材料对肺癌细胞系A549的毒性及氧化损伤作用。培养A549细胞,经传代后接种于6孔板中,每孔2 m L完全培养基,接种次日进行染毒。用直径20~30 nm、长度80~100 nm的Nano-Cd S进行染毒,染毒浓度分别为0、5、10、20、40和80 mg·L~(-1)。染毒24 h后用MTT检测细胞存活率,以存活率在80%左右的浓度为后续实验染毒浓度。应用流式细胞技术,用荧光探针法检测A549细胞的活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,PI-Annexin-V法检测细胞凋亡情况;用试剂盒检测细胞中超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,判断细胞氧化损伤情况。不同浓度Nano-Cd S处理细胞24 h之后,细胞存活率随剂量的增加而下降,浓度为10、20、40和80μg·L~(-1)时,存活率分别为(88.71%±0.80%)、(81.93%±3.06%)、(75.23%±1.13%)和(70.66%±5.63%),且各组间差异均具有统计学意义(P0.05)。以浓度为10和20 mg·L~(-1)的Nano-Cd S染毒24 h后,胞内ROS含量和细胞凋亡率随染毒剂量的增加而增加(P0.05);浓度为10 mg·L~(-1)时,细胞凋亡率为(6.26%±0.44%)。与对照相比,各染毒组SOD和CAT活性和MDA含量升高,20 mg·L~(-1)染毒组SOD和CAT活性和MDA含量高于10 mg·L~(-1)染毒组(P0.05)。研究表明,纳米硫化镉能引起A549细胞的氧化损伤和细胞凋亡,具有明显的细胞毒性。     

蚯蚓粪对铁皮石斛抗氧化能力及次生代谢产物的影响

在盆栽条件下使用不同含量蚯蚓粪的基质(蛭石)栽种一年生铁皮石斛(Dendrobium officinale),并在栽种的第15、30、45天时,分析石斛抗氧化能力和次生代谢产物含量的变化.结果表明:含有蚯蚓粪的栽培基质能提高铁皮石斛的超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化物酶(POD)比活力、丙二醛(MDA)含量、根系活力、可溶性蛋白含量以及茎中黄酮和多糖含量(P0.05),蚯蚓粪含量不同效果有所差异.其中,蚯蚓粪含量为60%时,第45天石斛SOD活力和POD比活力较之对照分别增加了29%和156%;蚯蚓粪含量为80%时,在栽种45 d后石斛根系活力、可溶性蛋白含量以及多糖和黄酮含量较之对照分别增加了235%、37%、102%和97%;蚯蚓粪含量为20%、40%、60%和80%时石斛体内MDA含量均显著降低(P0.05).综上,人工栽培中使用适宜含量的蚯蚓粪能提升铁皮石斛品质,80%为提高其药用品质的最适含量,60%为提高其抗氧化能力的最适含量.     

宏蛋白质组学在活性污泥研究中的应用

宏蛋白质组学作为研究微生物群落的一种新兴技术,主要是对特定微生物群落所表达的全部蛋白进行宏观、高通量的分析研究.本文综述了宏蛋白质组学研究的技术路线,主要包括蛋白的提取和纯化、分离和鉴定,以及宏蛋白质组学在强化生物除磷的活性污泥、活性污泥胞外多聚物和比较不同处理工艺活性污泥的差异等方面的研究.活性污泥的宏蛋白质组学研究完善了强化生物除磷活性污泥的厌氧和好氧阶段的代谢模型,揭示了活性污泥胞外多聚物在污染物降解过程中的主要作用和表现,阐述了不同活性污泥在污水处理过程中宏观特性与微观功能之间的关系,对于污水的生物处理有着重要的指导意义.宏蛋白质组学在活性污泥研究领域仍处于起步阶段,没有统一、有效的蛋白提取方法,数据库匮乏,成为活性污泥宏蛋白质组学发展的主要阻碍.随着各种新兴仪器、方法的应用以及数据库的不断完善,活性污泥宏蛋白质组学将会在污染物生物降解机制分析、鉴定功能蛋白等方面展现其巨大的优势.     

羟丙基-β-环糊精对新金色分枝杆菌合成ADD蛋白质组的影响

新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum JC-12)可降解植物甾醇合成药物中间体雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD),由于植物甾醇的溶解度较低,因此在转化体系中添加羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为助溶剂.本次研究在HP-β-CD存在与否条件下利用二维凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOFMS)分离和鉴定新金色分枝杆菌蛋白质表达量的差异;再使用反转录实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对挑选出的5个与ADD合成相关的蛋白质编码基因进行转录水平分析.结果表明,2-DE图谱及质谱结果共鉴定到12个具有显著差异表达量的蛋白质点.其中,参与植物甾醇降解合成ADD途径的乙醇脱氢酶、烯酰-Co A水合酶、乙酰-Co A乙酰基转移酶、3α,7α,12α-三羟基-5β-胆甾-24-烯酰-Co A水合酶和4,5-9,10-双断裂-3-羟基-5,9,17三氧雄甾-1(10),2-二烯-4-酸酯水解酶的蛋白质表达量在羟丙基-β-环糊精存在条件下显著提高;参与糖、脂、氨基酸和核酸类物质代谢的乙二醛酶、3-氧代酰基-ACP合酶、3-酮脂酰-ACP还原酶、分支酸合酶、氮调节蛋白P-II和DNA结合蛋白的蛋白质表达量也有一定的提高,但磷酸甘油酸变位酶的蛋白质表达量有所下降.通过RT-q PCR分析的转录水平的变化情况与2-DE得到的蛋白水平的结果相符.综上所述,羟丙基-β-环糊精可促进降解植物甾醇合成ADD代谢途径及糖、脂、氨基酸和核酸类物质代谢途径相关酶的表达量.