温度两阶段控制策略发酵生产重组角质酶

为进一步提高重组Bacillus subtilis WSHB06-07发酵生产角质酶的产量和生产强度,在pH两阶段控制策略的基础上,考察了温度(27～40℃)对菌体生长和产酶的影响.研究发现,37℃适于菌体生长而30℃适于菌体产酶.通过分析发酵过程中菌体比生长速率及产物比合成速率的变化,确定了温度两阶段控制策略,即0～4 h时控制温度37℃,4 h后将温度调至30℃.通过采用这一优化策略,角质酶酶活和生产强度分别可达312.5 U/mL和13.02 kU L-1 h-1,相比恒定温度37℃控制模式下分别提高了83.4%和10.9%.图6表2参13     

灵芝深层发酵生产胞外多糖和灵芝酸的动力学分析

利用Sigmoidi函数构建了灵芝深层发酵生产胞外多精和灵芝酸的非结构动力学模型,并根据Boltzmann拟合求解出模型参数,模型预测值能够较好地吻合实验所测值.细胞最大比生长速率цmax为4.63x10-2 h-1,葡萄糖最大比消耗速率qs,max为6.70x10-2 h-1,胞外多糖最大比合成速率qEPs,max为4.65x10-3h-1,灵芝酸最大比合成速率qGA,max为9.09xlO-4 h-1.灵芝胞外多糖的合成与细胞的生长呈现部分偶联关系;灵芝酸的合成与细胞的生长呈现偶联关系,偶联系数αGA为0.020 4 g g-1.胞外多糖对葡绚糖的最大得率系数(YEPS/S)为O.214 g g-1;灵芝发酵40～80 h代谢碳流迅速从菌体自身生长迁移至胞外多糖合成,用于合成胞外多糖的最大碳流为23.60/0.     

平菇原生质体的高效制备及再生优化条件

以杂优1号平菇为出发菌株,对其原生质体制备、再生的各关键因子及条件进行比较研究,结果表明,其原生质体制备的优化条件为:以0.6 mol/L MgSO4为稳渗剂配制浓度为15 mg/mL新鲜溶壁酶液,菌丝与酶液比w/V=1mg:8μL,取培养6 d的菌丝200 mg,自然pH下28℃小平板酶解6 h,原生质体得率可达2.80×107个/mL.原生质体再生实验结果表明,50 U/mL链霉素能有效控制平菇原生质体再生的杂菌污染.孟加拉红对平菇原生质体再生具强抑制作用,抑制率达93%.进一步研究证实,0.6 mol/L的MsSO4、KCI等无机盐稳渗剂对原生质体制备的得率较高,而0.6 mol/L的蔗糖作为稳渗剂的平菇原生质体再生率较高.图4表3参23     

产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB)的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260 U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40 g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5 g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.图6表1参18     

基于途径分析促进α-酮戊二酸过量积累的数学模型技术

在详尽分析α-酮戊二酸(α-KG)合成途径的基础上,结合数学模型,对光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019过量合成α-KG的合成途径及其调控因素进行全面分析与优化.全因子实验表明,硫胺素(B1)和CaCO3是影响α-KG过量积累的关键因素.在此基础上,采用最速上升实验得到α-酮戊二酸积累的最大响应区域为B10.016 mg/L、CaCO3 84 g/L附近.采用中心组合设计及响应面分析确定最优培养基组分为:硫胺素(B1)0.02 mg/L、生物素(Bio)0.05 mg/L、CaCO3 82 g/L和乙酸钠4 g/L.在最优培养基中,α-KG产量达到26.8 g/L,提高了34%.α-酮戊二酸发酵过程动力学分析表明,采用最优培养基使发酵延滞期缩短6 h,菌体比生长速率和α-KG比产物生成速率分别提高了45.4%和8.64%.图2表3参12     

绿僵菌液体培养的条件及其对马尾松毛虫的毒力

在不同温度和不同光照条件下对3株金龟子绿僵菌和1株贵州绿僵菌的液体深层培养研究表明，光照对菌丝生长和液生分生孢子产量均无显著影响。但培养温度显著影响菌丝生长和液生分生孢子的产出率，25-28℃为液体深层培养绿僵菌的适宜温度，其中以28℃最佳，对3-4龄马尾松毛虫幼虫的室内毒力测定表明，绿僵菌液生分生孢子的毒力略低于气生分生孢子。     

温度和发酵时间对厨余垃圾发酵产乳酸及其光学异构体的影响

通过间歇实验,探讨了温度和发酵时间对非灭菌的厨余垃圾发酵产乳酸及其光学异构体的影响.结果表明,控制温度在35℃时,发酵液中乳酸浓度远高于45℃和55℃,发酵120h后,总乳酸的产率和产量最大,分别达到0.59gL-1d-1和0.62gg(VS)-1,以有机碳表示的乳酸占发酵液中总有机碳的78%;控制发酵时间小于120h,L-乳酸在35℃、45℃和55℃三个温度条件下都是主要的异构体形式;35℃和55℃时,发酵72h后,随着发酵时间的延长,L-乳酸浓度在总乳酸中的比例呈下降趋势;45℃时,L-乳酸浓度随着发酵时间的延长逐渐增加,L-乳酸在总乳酸中的比例在发酵144h后达到97%.图4表1参21     

一种田头菇属真菌新记录种的生物学与产酶特性

田头菇是重要的经济食用菌类型,目前我国报道种仅有10个.为驯化栽培和开发利用新的田头菇属食用菌种质资源,以采集自北京延庆的我国新记录种菌核田头菇(Agrocybe tuberosa)GSM-12菌株为材料,研究了菌丝生长的最适碳源、氮源、C/N比、最适温度、最适pH值等生物学特性,以及菌丝体液体发酵产漆酶、蛋白酶、植酸酶和核糖核酸酶的特性.结果显示,菌丝生长的最适碳源为蔗糖,最适氮源为黄豆粉,最适C/N比为20/1-30/1,最适温度为24℃,最适pH为7.0.产酶特性研究显示,GSM-12菌株具有漆酶、植酸酶和核糖核酸酶活性,菌丝体中酶活较高,分别为(77.28±10.44)U/mg、(61.01±2.71)U/mg和(21.13±0.60)U/mg.本研究表明菌株GSM-12可以利用常规营养元素实现营养生长,同时菌丝体液体发酵具有良好的产酶特性.     

氮源及其添加模式对钝齿棒杆菌JDN28-75合成L-精氨酸的影响

氮源是微生物过量合成L-精氨酸的重要营养因子之一,不同氮源对钝齿棒杆菌JDN28-75合成L-精氨酸的影响研究结果表明,硫酸铵为合适的氮源.不同初始硫酸铵浓度对JDN28-75产L-精氨酸的影响研究结果表明,氮源浓度过高或不足,都会使最终L-精氨酸产量有所降低.低浓度的硫酸铵虽然有利于菌体生长,但对L-精氨酸的合成明显不利,同时糖酸转化率也较低;而高浓度的硫酸铵尽管不利于细胞的生长且造成发酵结束时残糖含量过高,却有利于细胞合成L-精氨酸且实际耗糖的糖酸转化率维持在一个较高的水平.初始硫酸铵浓度为60 g/L时,对JDN28-75菌体的生长有明显的抑制作用,最终发酵液中剩余的硫酸铵也较多(大于30 g/L),但高浓度的硫酸铵是L-精氨酸合成所必需的.在上述研究结果的基础上,确定了初始硫酸铵浓度为20 g/L条件下的补氮策略,比较了4种不同的硫酸铵补加模式对产L-精氨酸的影响,结果表明,在总的硫酸铵浓度相同的情况下,采取分批、低浓度添加氮源的方式既可以有效解除发酵前期高浓度硫酸铵对菌体生长的抑制作用,又可以有效维持发酵中后期体系中菌体合成L-精氨酸所需的较高比例的氮源.最后,在5 L全自动发酵罐中采用20 g/L的初始硫酸铵浓度,连续流加25%的氨水来控制发酵体系pH及补加氮源,L-精氨酸的产量可以达到31.7 g/L,较对照组的产酸量(26.0 g/L)提高了21.9%.图4表2参11     

铜绿假单胞菌(TBPY)降解对氯苯酚的特性

借助Vis-UV分光光度计、高效液相色谱(HPLC)仪和透射电镜(TEM),对铜绿假单胞菌TBPY的生长与降解对氯苯酚的性能进行了研究.结果表明:通过逐步增加对氯苯酚浓度和转接代数的驯化后,TBPY菌株降解对氯苯酚的能力有了很大的提高,原菌在4d内才能将浓度为100mg.l-1的对氯苯酚降解至85mg.l-1,降解率只有15%,而多次驯化后的TBPY只需2d就能将浓度为100mg.l-1的对氯苯酚完全降解,驯化能显著提高TBPY菌株的降解能力;并且,与驯化前相比菌体的形态发生了很大变化,由菌体周边整齐、直或稍弯、两端钝圆的均匀杆状变为不均匀的卵圆、短杆和直杆状,几乎每个菌的形态都呈"花生"状,且菌体周边出现半透明的膜状物质,TBPY有很好的自我保护能力.随着对氯苯酚浓度的增大,TBPY菌的生长迟滞期是逐渐延长的,当对氯苯酚浓度达到150mg.l-1时,生长迟滞期为6d,对氯苯酚浓度继续增加,TBPY几乎停止生长,TBPY可耐受150mg.l-1的对氯苯酚.温度在30℃左右时,对氯苯酚的初始降解速率最大;菌株TBPY在培养基初始pH值为7.0—8.0的范围内,降解对氯苯酚的能力较强,以pH7.5的降解效果最好,对氯苯酚的初始降解速率高达1.51 mg.l-.1h-1;当pH6.5和pH8.5时,对氯苯酚的初始降解速率均较低为0.513 mg.l-.1h-1和1.061 mg.l-.1h-1.该菌优化降解条件为:温度30℃、培养基初始pH7.5、接种量2.0%;在该条件下,发酵1d后100mg.l-1对氯苯酚的降解率达99%以上.     

基于动力学分析提高黑木耳多糖产量的pH控制策略

为了实现黑木耳(Auriculariaauricula)深层发酵生产胞外多糖的高产量和高生产强度的统一,在7L发酵罐中研究不同pH对A.auricula分批发酵生产黑木耳多糖的影响.A.auricula细胞生长的最适pH为5.0,而黑木耳胞外多糖合成的最适pH为5.5.恒定pH有利于合成黑木耳多糖,但降低了黑木耳多糖的生产强度.发酵液中较高的pH不利于葡萄糖的消耗,使得发酵结束时的残余葡萄糖含量随pH的升高而升高.分析不同pH条件下A.auricula发酵生产黑木耳多糖动力学参数,发现较低pH有利于加快底物消耗,而较高的细胞生长速率则出现在pH5.0,pH5.5时细胞则具有较高的胞外多糖合成速率和对葡萄糖的得率.在此基础上提出了A.auricula发酵生产黑木耳多糖的两阶段pH控制策略:0~48h控制发酵液pH5.0,48h后控制pH5.5.实验结果表明,采用两阶段pH控制策略,A.auricula胞外多糖产量比控制pH5.5时提高了8.1%,残留葡萄糖含量降低了15.2%,产生最大胞外多糖的时间缩短至96h,且黑木耳多糖的生产强度比pH5.5时提高了35.1%.图4表1参21     

间甲酚降解Citrobacter farmeri 的降解特性及代谢途径解析

考察了在不同温度、pH值、摇床转速、氮源等环境和营养条件下,间甲酚降解菌Citrobacter farmeri对降解速率和降解过程中反应液的TOC值、紫外吸收及酶活的变化.结果表明,Citrobacter,farmeri降解间甲酚的最适温度为35℃,培养基初始pH值为6.5-8.0,摇床转速为170 r·min~(-1),无机氮比有机氮和氨态氮比硝态氮更利于Citrobacter farmeri对间甲酚的降解;当间甲酚初始浓度低于375mg·l~(-1)时,Citrobacter farmeri降解间甲酚符合零级动力学方程;间甲酚初始浓度约为60 mg·l~(-1)时约4 h完全降解,TOG的去除率8 h内可达到77%,之后几乎不变;Citrobacter farmeri可完全降解约600 mg·l~(-1)的间甲酚,表现出高效与强耐受能力的结合.对酶活的测定发现,儿茶酚1,2-双加氧酶有明显增大,初步判断Citrobacter farmeri以邻位裂解的途径对间甲酚进行降解.     

硫氧化菌Halothiobacillus neapolitanus筛选、鉴定及其脱硫性能

硫氧化菌是生物脱硫的关键因素,因此筛选耐受性强、脱硫效率高的菌株具有重要意义.以硫代硫酸钠为能源底物,从无锡市某污水处理厂硝化污泥中分离到一株硫氧化菌株,通过菌落形态、TEM电镜观察,并结合16S rRNA测序以及系统进化树分类等分子生物学分析,鉴定该菌为那不勒斯硫杆菌(Halothiobacillus neapolitanus),命名为LJN1-3.确定该菌的最适脱硫条件为pH 6.8,温度30℃,在该条件下,适量葡萄糖、蔗糖、乙醇等有机物以及Ni~(2+)可刺激细胞生长,该菌对酸类和Mn~(2+)、Pb~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)等金属离子呈现一定耐受性.该菌在内循环气升式反应器脱硫性能分析表明,其最大比生长速率和最大比消耗速率分别为0.38/h和6.5×10~(-4)g/h,24 h内硫代硫酸钠消耗率达99%,此时单质硫浓度0.88 g/L,呈现较强的脱硫潜力. SEM分析形成的单质硫表面呈现粗糙、不规则的形貌.本研究表明,H. neapolitanusLJN1-3硫代硫酸钠去除率高且具有较强的耐受能力,在生物脱硫等领域具有一定的应用价值.     

A/O中试工艺中亚硝酸氮积累现象的消失与重现

应用A/O工艺处理低C/N比的生活污水,SRT维持在15d左右,水温控制在21-25℃,pH值在7.2-7.6之间,污泥浓度为2500-4500mg·l-1,通过控制溶解氧(DO)浓度实现了亚硝酸氮积累、消失和重现.维持较低的DO浓度(≤0.7mg·l-1)可使亚硝酸氮积累现象重现.在两次试验的比较中,亚硝酸氮积累破坏的愈彻底相应恢复的过程就愈漫长.在长期较低的DO浓度条件下,亚硝酸菌充分利用了有限的溶解氧,在与丝状菌竞争DO中占到优势,因此,污泥沉淀性能很好,没有产生严重污泥膨胀.同时分析了pH值、游离氨(FA)浓度、温度等对亚硝酸氮积累的影响,DO是影响亚硝酸氮积累的关键因素.     

微杆菌3-28对萘、菲、蒽、芘的降解

研究了以多环芳烃为唯一碳源富集培养的微杆菌3-28对不同多环芳烃化合物(Polycyclic aromatichydrocarbons,PAHs)及混合PAHs的降解能力,以及在无机基础培养基中生长时PAHs浓度与一些主要环境因子如pH值、盐度、温度对细菌降解PAHs的影响.结果表明,微杆菌3-28X对萘、菲、蒽和芘均有较高的降解能力,112 h后萘与菲完全降解,而蒽和芘28 d的降解率分别为97.54%、90.2%.初始底物浓度会影响细菌生长速率,底物浓度过高不利于细菌生长.相同培养时间下多底物培养液中的菌群浓度明显高于单底物系统.微杆菌3-28能够在pH 6.0-9.0、盐度10～30g/kg,温度40～55℃的环境下生存,并保持较高的降解能力.图8参33     

野生槐耳的分离、鉴定、培养条件及产漆酶能力

以采集自北京香山公园加拿大杨(Populus canadensis)的槐耳子实体为材料,利用组织分离获得纯培养并保存,编号为XS-01.结合形态与ITS鉴定确定其分类地位,进一步开展菌丝最适生长条件和液体发酵产漆酶研究.通过PCR扩增,获得长度为598 bp的部分ITS序列(KY933481),采用MEGA 6.0构建发育树、测定遗传距离,XS-01与槐生多年卧孔菌(Perenniporia robiniophila)相似性最高,为100%,遗传距离为0.000.进一步结合子实体和菌丝形态,确定XS-01为槐生多年卧孔菌.结合生长速度和长势,确定了该菌株的最适生长碳源为淀粉和麦芽糖,最适生长氮源为酵母浸粉,最适生长C/N比为30/1-60/1,最适生长温度为32℃,最适生长pH 7,最适生长因子为VB1.Cu~(2+)诱导的胞外漆酶发酵研究表明,1.0 mmol/L Cu~(2+)对漆酶产量有显著的促进作用,产量在96 h达到最大值,为417.5 U/mL,比对照组提高93.4%,而2.0 mmol/L Cu~(2+)对漆酶产量有显著抑制作用,96 h酶活为79.0 U/mL,是对照组的36.6%.本研究获得具有高产胞外漆酶能力的槐耳菌株,具有潜在的应用开发价值.     

球衣菌对重金属离子的耐受性及其吸附能力

研究了球衣菌对重金属离子Ag 、Hg2 、Pb2 、Zn2 的耐受性及生物吸附情况,并着重对Pb2 的吸附行为及工艺条件进行了探讨.结果表明:球衣菌对 4种重金属离子均有不同程度的耐受性,其中对Pb2 具有较大的耐受力.不同生长阶段的菌体对重金属离子的敏感性也不同.球衣菌对Pb2 的吸附作用是一种快速而非依赖温度的过程.在ρi(Pb2 ) =5mg/L,菌体浓度ρb=0. 2g/L,θ=30 ~35℃,pH=6. 5,菌龄a=32h,吸附时间t=30min时,吸附率可达95. 6%,吸附量为 23. 9mg/g. 图 3参 10     

脱硫脱硫弧菌去除SO2的工艺条件研究

从太原污水处理厂分离到1株硫酸盐还原菌,对其进行形态学观察及生理生化特征测定,鉴定为脱硫脱硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans).该菌株在pH=7、温度30℃、搅拌速度270r/min时生长最好,处理SO2的能力最强.当二氧化硫进口浓度小于10334mg/m3,SO2-3累积浓度小于87.31mg/L时,菌体生长良好,碱液流加速率较小,但当二氧化硫进口浓度达到11582mg/m3,SO2-累积至124.06mg/L时,菌体生长受到抑制,系统被破坏.图6参11     

芽孢杆菌发酵产碱性果胶酶温度控制策略

采用自行筛选获得一株产碱性果胶酶芽孢杆菌WSH03-09,在小型发酵罐中研究了不同温度对碱性果胶酶分批发酵的影响,结果表明,在恒定39℃条件下,可获得最高酶活5．39u／mL,各温度条件下的菌体干重相差不多,最终均能达11．5g／L左右;在发酵前期,控制温度41℃时最有利于菌体的生长,而在产物合成期,控制37℃有利于获得较高的产物合成比速,在此基础上,提出分阶段温度控制策略,采用此温度控制策略进行碱性果胶酶的发酵,碱性果胶酶酶活达5．99u／mL,比采用单一温度下的最大值提高了11％,其它各项指标也有较大提高．图6表1参6     

一种野生多孔菌的分离、鉴定、培养条件及抗氧化活性

多孔菌是一类子实体呈孔状且质地为革质至木质的大型担子菌,其中一部分具有较高的药用价值.对一株野生多孔菌子实体进行分离纯化获得纯培养BJ菌株,并对其分类、最适培养条件和液体发酵产物抗氧化活性进行分析.采用形态学和ITS分类学鉴定菌株的分类学地位;通过测定菌株在不同碳源、氮源等培养基中的生长状况,研究菌丝最适培养条件;使用2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)法测定菌株发酵液总抗氧化活性;使用总超氧化物歧化酶(T-SOD)法、1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基(DPPH)法测定菌株发酵液菌体的总超氧化物歧化酶活力和自由基清除能力.结果显示:经鉴定BJ菌株为石榴嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia punicata).菌丝体最适培养碳源为葡萄糖、麦芽糖和淀粉,最适氮源为酵母浸粉,最适C/N比为10/1,最适温度为28℃,最适pH为7.0.发酵液总抗氧化活性为0.517 mmol/L(维生素E),菌体的总超氧化物歧化酶活力为770.37 U/g,DPPH自由基清除力的IC_(50)为2.14 mg/mL.本研究从野外获取了一株高抗氧化活性的药用多孔菌资源,可为野生药用真菌的开发利用提供理论依据.