酶法高效转化苯乙酮酸合成L-苯甘氨酸

L-苯甘氨酸是合成多种抗生素和抗癌药物的重要中间体,目前主要通过化学法合成.利用蜡样芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化苯乙酮酸的还原氨基化合成L-苯甘氨酸,并偶联甲酸脱氢酶(FDH)进行辅酶再生,建立了一种新型的苯甘氨酸生物合成方法.结果表明,该辅酶再生体系可有效地用于L-苯甘氨酸的合成,且没有副产物残留,辅底物甲酸铵还可提供还原氨基化所需NH4+,随后对酶转化条件进行优化,最适转化条件为苯乙酮酸60 g/L,甲酸铵50.4 g/L,LeuDH 4 U/mL,FDH 2 U/mL,NAD+浓度0.14 g/L,p H 8.0以及30℃.在最优条件下,1 L的转化体系中,转化反应5 h,苯乙酮酸转化率达到99%,L-苯甘氨酸产量60.2 g/L,ee值99%.本研究为L-苯甘氨酸的工业生产提供了一种更加简单、高效、经济的生物合成途径.(图8表4参27)     

米曲霉氨基酰化酶酶法拆分制备D型芳香族氨基酸

以DL-苯丙氨酸为起始原料,乙酸酐乙酰化后得到N-乙酰DL-苯丙氨酸,利用米曲霉氨基酰化酶立体结构专一催化水解N-酰基-L-氨基酸的酰胺键的特点,分别得到L-苯丙氨酸和N-乙酰D-苯丙氨酸.通过结晶法分离两者后,N-乙酰D-苯丙氨酸经6 mol/L HCI水解得到D-苯丙氨酸.由此拆分DL-苯丙氨酸得到光学纯度分别为98%的L-苯丙氨酸(收率84.8%,以原料N-乙酰-DL-苯丙氨酸的0.5倍摩尔量为理论产率)和92.3%的D-苯丙氨酸(收率89.5%).参22     

稀土元素对怀槐悬浮培养细胞异黄酮合成及氧化还原态的影响

在培养基中添加不同浓度的硝酸铈和硝酸镧,并检测怀槐细胞悬浮培养过程中异黄酮含量、苯丙氨酸裂解酶(PAL)酶活、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量的变化,以探讨稀土元素对怀槐细胞合成异黄酮的影响和机制.结果表明, 20 mmol L-1硝酸铈和10 mmol L-1硝酸镧较适合诱导怀槐悬浮培养细胞合成异黄酮;细胞培养过程中,硝酸铈和硝酸镧诱导异黄酮合成的变化趋势与PAL酶的活性变化一致;氧化还原态变化分析发现,硝酸铈和硝酸镧处理的细胞中GSH/GSSG比例分别在d 3和d 2达到最大值,是同期对照的1.46和1.47倍,而异黄酮含量则在d 4和d 3达到最大值,分别达到了271.42 μg g-1 (DW)和279.32 μg g-1 (DW).研究结果显示,怀槐细胞悬浮培养中添加稀土元素提高次生代谢产物异黄酮的合成可能与稀土元素诱导细胞氧化还原态的改变有关.图3参16     

21世纪中国有机化学发展战略(节录)

绿色化学绿色化学是 2 1世纪化学化工研究的重要发展方向 ,通过研究和改进化学化工反应及相关的工艺 ,从根本上减少以至消除副产物的生成 ,从源头上解决环境污染的问题 .(1 )发展高效、高选择性的催化剂以实现“原子经济性”反应 .催化的不对称合成反应 ,仍是获得单一手性分子的方法之一 ,应加强有关的新反应、新技术、新配体及催化剂的研究 ,加强绿色生物催化有机反应的研究 .(2 )开发符合绿色化学要求的新反应 ,如 :硝化反应、氧化反应等 ,以及相应的工艺 ,降低或避免使用对环境有害的原料 ,减少副产物的排放 ,甚至实现零排放 .(3 )无公害…     

构建辅酶自循环系统全细胞催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇

S-2-氨基-1-苯基乙醇是一种重要的医药中间体,广泛应用于神经递质及抗病毒剂等多种具有生理活性药物的合成.目前其合成主要通过化学手段,虽然工艺成熟,但反应条件剧烈,且会生成许多副产物.基于新鉴定的铜绿假单胞菌来源的ω-转氨酶,设计了一个结合新金色分枝杆菌来源的醇脱氢酶的级联酶催化体系,从而将较为廉价的苯基-1,2-乙二醇一步催化合成具有高附加值的S-2-氨基-1-苯基乙醇.为了解决级联催化过程中辅酶再生和氨基供体再生问题,在该级联体系中引入大肠杆菌来源的谷氨酸脱氢酶,构建一个封闭的氧化还原自循环系统,从而实现辅酶(NADP~+)和辅底物(L-Glu)的同时再生.最后将这3个酶串联表达在pETDuet和pACYCDuet质粒上,并转入大肠杆菌中,获得了重组菌Escherichia coli BL21(MPG).通过重组菌全细胞转化,结果显示在100 mL、pH 8.0的NH_4Cl溶液中,37℃条件下反应10 h后,OD_(600)=30的该重组菌可一步催化50 mmol/L苯基-1,2-乙二醇生成光学纯的S-2-氨基-1-苯基乙醇,转化率达到99.6%,产物的ee值 99%.本研究提供了一种高效经济催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇的方法,不需要受到辅因子供应不足的限制以及副产物的积累的影响.(图8表3参31)     

产琥珀酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能

琥珀酸是一种重要的化工产品,微生物发酵法生产琥珀酸具有广阔的应用前景.野生大肠杆菌厌氧发酵产物中琥珀酸含量低,且有大量副产物.为构建高产琥珀酸的重组大肠杆菌,阻断代谢旁路,利用Xer/dif重组酶系统对Escherichia coli CICIM B0013进行代谢途径的调控研究.结果显示,敲除了包括乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶基因(ackA-pta)、乳酸脱氢酶基因(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)、乙醇脱氢酶基因(adhE)等琥珀酸合成竞争途径中关键酶基因的重组大肠杆菌菌株E.coli CICIM B0013-1040,其发酵液中琥珀酸成为主要产物得到积累;进一步对其PTS系统进行修饰并适当增强PEP羧化酶基因(ppc)表达剂量,成功获得一株具备较强琥珀酸生产能力的菌株E.coli CICIM B0013-1050(pTH-ppc),该菌株厌氧转化葡萄糖36 h,琥珀酸产量达到36.2 g/L,生产强度为1.01 g L-1 h-1,葡萄糖-琥珀酸转化率为64.3%,发酵液经高效液相色谱(HPLC)检测,无乳酸、乙酸、甲酸、乙醇生成.     

地衣芽孢杆菌γ-谷氨酰转移酶的分离和纯化

γ-谷氨酰转移酶(GTE)是聚γ-谷氨酸生物合成的关键酶,地衣芽孢杆菌QBL-033是目前合成聚γ-谷氨酸的主要菌种,其γ-谷氨酰转移酶的研究尚未见报道.分离纯化该菌中的γ-谷氨酰转移酶,研究其辅酶组成,对揭示γ-谷氨酰转移酶的分子结构和性质,提高聚γ-谷氨酸产率很有必要.将培养至对数期中期的细胞离心收集并用缓冲液洗涤,细胞破碎、离心去除菌体碎片得无细胞抽提液.经DEAE-纤维素柱(HIC)、G-200凝胶过滤柱层析得到纯化大约70倍的以NADPH为辅酶的GTE和部分纯化的以NADH为辅酶的GTE,这两个酶分别对NADPH、NADH高度专一.经HPLC和SDS-PAGE测得前一种酶的分子量和亚基相对分子质量分别为235×103和39×103,表明该酶为具有相同亚基的六聚体.酶活性测定使用HLTACHI U-3000分光光度计利用NAD(P)H在340nm氧化的初速度进行.纯化结果表明,QBL-033中确实存在两种GTE.QBL-033是以NADPH为辅酶的GTE参与聚γ-谷氨酸的合成代谢,以NADH为辅酶的GTE参与聚γ-谷氨酸的分解代谢.同时发现以NADPH为辅酶的GTE在280 nm吸收很弱,在215 nm吸收很强,说明此酶中酪氨酸、苯丙氨酸含量较低.GTE最适作用温度和最适反应pH值分别为50 ℃和6.0,具有较宽的pH稳定性,并且在50℃以下较稳定.Ca2 、Co2 、Cu2 、Mn2 、Pb2 、K2 、Zn2 ,以及EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Fe2 和Mg2 对酶有轻微的激活作用.图4表1参16     

Research progress on occurrence forms and microbial transformation of mercury北大核心CSCD

汞是一种高毒性且具有持久性的重金属污染物,汞污染的治理与修复在近几十年一直是国内外研究热点.了解微生物对汞赋存形态的转化作用,对汞污染的治理与修复具有重要意义.总结汞的不同赋存形态、毒性及对应的常用分析方法,其中甲基汞(methyl mercury,MeHg)是毒性最强的汞形态之一.环境中汞的化学形态能发生转化,尤其以微生物驱动的汞的甲基化、MeHg的去甲基化和汞的氧化还原最为常见.依据汞转化类型将汞转化相关微生物分为汞甲基化、MeHg去甲基化、汞还原、汞氧化等类群,将对应的汞转化作用机制分为基于hgcAB基因的汞甲基化、基于mer操纵子基因的MeHg去甲基化和Hg2+还原、胞内过氧化氢酶介导的Hg0氧化.微生物汞转化过程不仅受到pH和温度的显著影响,而且还受到汞的赋存形态和游离汞的浓度、微生物种/群结构与功能、矿物种类、中间体和次生产物及其交互作用的影响,基于此,提出正确客观表征汞的微生物转化过程需要综合分析微生物组和矿物组的变化规律及其交互作用的综合效应.针对酸性矿山废水(AMD)极端环境微生物汞转化研究的不足,未来的工作将聚焦结合多组学手段、同步辐射谱学和密度泛函理论(DFT)计算等分析技术研究汞赋存形态的微生物转化过程,分析和阐明汞转化中间体的键合作用方式和转化机制,从而为AMD汞污染的预防、治理和修复提供依据.(图2表2参107)     

苯偶酰的绿色催化合成及表征

以金属与双水杨醛缩乙二胺合成的金属配合物Co(salen)作为均相催化剂,用空气氧化安息香合成苯偶酰,通过四因素三水平正交试验(温度、催化剂用量、KOH添加量和反应时间)的设计,探索Co(salen)催化氧化安息香的最佳条件,并以Co(salen)作为研究对象,探索最佳条件下NaY分子筛负载催化剂和不对称Schiff碱配合物对安息香的催化氧化效果,应用X射线晶体衍射(XRD)、~1H NMR核磁共振波谱、红外光谱、紫外光谱和高效液相色谱HPLC等手段对制得的席夫碱和氧化产物进行分析表征,同时考察催化剂的回收套用效果.结果表明,在35℃下反应80 min,添加1 g催化剂和1.5 g KOH时,Co(salen)催化剂产率最高可达96%以上,回收套用催化剂2次最佳,产率仍可达到77.8%.NaY分子筛和不对称希夫碱金属催化剂在最优条件下产率低于Co(salen)催化剂,Na Y分子筛作为载体能在重结晶过滤的阶段直接有效地将产物和催化剂分离,能更有效地重复利用.合成产物经HPLC和~1H NMR核磁共振波谱分析,验证了其为较高纯度的苯偶酰.     

基于回补途径的TCA循环改造对克雷伯氏菌生长和甘油代谢的影响

回补途径和TCA循环在克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的中心代谢中扮演着十分重要的角色.通过过表达回补途径的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)和柠檬酸(TCA)循环的关键酶柠檬酸合成酶(GLTA)将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和乙酰辅酶A节点的碳流引入TCA循环,以考察基于回补途径的TCA循环强化对K. pneumoniae生长和甘油代谢的影响.结果显示:单独过表达ppc或gltA基因,TCA循环还原和氧化分支的中间代谢产物琥珀酸和α-酮戊二酸分别增加了8.3倍和1.2倍,甘油利用能力明显增强,除2,3-丁二醇外,其他副产物积累量均有所下降,但1,3-PDO产量分别降低了23.3%、5.9%.共表达ppc和gltA基因后,与对照菌相比,生物量降低了35.7%,甘油利用能力进一步增强,1,3-丙二醇产量提高了10.2%,所有副产物积累量均有所减少;与单独过表达ppc或gltA基因相比,乙醇、乳酸、乙酸积累量未有明显变化,但生物量略有提高,2,3-丁二醇积累量显著降低.上述结果表明通过共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶强化TCA循环能够提高菌株的甘油利用能力,弱化副产物合成,强化1,3-丙二醇的合成.(图4表2参19)     

模拟降水量变化对华西雨屏区天然常绿阔叶林土壤酶活性的影响

土壤酶是土壤生物化学过程的参与者,在森林土壤有机物的矿质化和腐殖化过程中起着重要作用;研究降水量变化对土壤酶活性的影响对于揭示全球降水格局变化背景下土壤有机物的矿化与腐殖质的合成过程具有重要意义.从2013到2015年,以华西雨屏区天然常绿阔叶林为研究对象,通过布设减雨架和人工喷洒方式对降水量进行调控,设置了对照(Ctr)、减少10%降水量(Dr)和增加10%降水量(W)3种处理,研究降水量变化对土壤酶活性和有机质含量的影响.结果表明:Dr处理下土壤蔗糖酶、脲酶和酸性磷酸酶活性分别提高了4.0%、4.3%和2.1%,过氧化氢酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性分别降低了3.9%、5.9%和10.3%;W处理下蔗糖酶、脲酶和酸性磷酸酶活性分别降低了12.4%、6.4%和14.4%,过氧化氢酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性分别提高了5.8%、3.9%和3.8%.多元线性回归分析表明,土壤微生物生物量碳(MBC)、NH_4~+-N含量和含水量是土壤酶活性变异的主导因子.Dr处理降低了土壤有机质含量,而W处理提高了土壤有机质含量.相关性分析表明,土壤有机质含量与土壤水解酶活性呈负相关关系,与氧化还原酶活性呈正相关关系.上述结果说明降水量变化通过影响土壤理化性质改变了华西雨屏区天然常绿阔叶林的土壤酶活性,进而影响了土壤有机质含量,对土壤有机质的转化过程产生了重要影响.(图2表5参47)     

产甘油假丝酵母甘油分解代谢CgGCY1、CgGCY2和CgDAK基因的克隆、敲除及其功能

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)能够利用甘油大量生长菌体而无有机酸、醇等代谢物积累,是潜在的优良宿主细胞.为了解C.glycerinogenes甘油分解代谢途径,成功克隆得到二羟基丙酮(DHA)途径的编码基因Cg GCY1、Cg GCY2和Cg DAK.利用"Ura-Blaster"敲除盒分别构建的缺失突变菌Cggcy1?/gcy2?和Cgdak?均不能在甘油培养基中生长.q RT-PCR及酶活测定结果显示,与葡萄糖培养相比,甘油培养下细胞通过强化糖异生、HMP途径积累生物量,下调EMP途径和副产物合成关键酶表达以弱化有机酸、醇的合成,同时上调TCA循环以补偿EMP途径下调带来的能量和还原力不足,使得生物量提高24.5%而不积累有机酸、醇等代谢物.以甘油为共底物进行木糖发酵,木糖醇产量和转化率达到39.4 g/L和89%,与葡萄糖为共底物相比分别提高了79%和32.8%.本研究表明C.glycerinogenes甘油分解代谢仅依赖于DHA途径,以甘油为共底物更有利于木糖醇的合成和转化;结果可为代谢改造C.glycerinogenes以甘油为共底物合成高附加值化合物打下基础.     

生物催化不对称还原制备(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇研究进展

(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇是合成药物阿瑞匹坦的关键中间体.以羰基还原酶生物催化前手性酮3,5-二(三氟甲基)苯乙酮的方法制备该中间体具有立体选择性优异、反应条件温和、对环境友好等优点,近年来受到广泛关注,目前已报道的高立体选择性酶源(产物ee 99%)有10余种.其中原始菌株生物催化体系能够转化底物的浓度普遍低于200 mmol/L,而利用重组Escherichia coli全细胞或者粗酶液则可催化1 mol/L以上的底物.通过添加离子液体、深共熔溶剂等辅溶剂,羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶融合表达以及酶固定化技术等方法优化反应体系可以有效提高底物转化效率.有些羰基还原酶,如LXCAR、KR01、Ch KRED20等,能够催化异丙醇脱氢实现辅酶自循环,其催化体系具有明显优势.未来利用蛋白质工程技术对野生型的潜力酶进行人工进化,可以进一步提高利于工业应用的酶学性能,同时稳定的生产工艺、规模放大、后处理等方面也需要深入开展研究.(图2表3参52)     

羟丙基-β-环糊精对新金色分枝杆菌合成ADD蛋白质组的影响

新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum JC-12)可降解植物甾醇合成药物中间体雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD),由于植物甾醇的溶解度较低,因此在转化体系中添加羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为助溶剂.本次研究在HP-β-CD存在与否条件下利用二维凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOFMS)分离和鉴定新金色分枝杆菌蛋白质表达量的差异;再使用反转录实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对挑选出的5个与ADD合成相关的蛋白质编码基因进行转录水平分析.结果表明,2-DE图谱及质谱结果共鉴定到12个具有显著差异表达量的蛋白质点.其中,参与植物甾醇降解合成ADD途径的乙醇脱氢酶、烯酰-Co A水合酶、乙酰-Co A乙酰基转移酶、3α,7α,12α-三羟基-5β-胆甾-24-烯酰-Co A水合酶和4,5-9,10-双断裂-3-羟基-5,9,17三氧雄甾-1(10),2-二烯-4-酸酯水解酶的蛋白质表达量在羟丙基-β-环糊精存在条件下显著提高;参与糖、脂、氨基酸和核酸类物质代谢的乙二醛酶、3-氧代酰基-ACP合酶、3-酮脂酰-ACP还原酶、分支酸合酶、氮调节蛋白P-II和DNA结合蛋白的蛋白质表达量也有一定的提高,但磷酸甘油酸变位酶的蛋白质表达量有所下降.通过RT-q PCR分析的转录水平的变化情况与2-DE得到的蛋白水平的结果相符.综上所述,羟丙基-β-环糊精可促进降解植物甾醇合成ADD代谢途径及糖、脂、氨基酸和核酸类物质代谢途径相关酶的表达量.     

产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB)的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260 U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40 g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5 g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.图6表1参18     

氟虫腈对意大利蜜蜂工蜂幼虫及幼龄工蜂的亚致死效应

蜜蜂是重要的授粉昆虫,亦是重要的环境污染指示生物.氟虫腈对蜜蜂剧毒,Pesticide Properties Data Base (PPDB)数据库中登记的其对蜜蜂的急性经口及接触半数致死剂量(LD50)分别为0.00417 μg·蜂-1和0.00597 μg·蜂-1,正因为对非靶标生物的毒性较高,其使用也受到了限制,目前仅用于卫生害虫防治和一些旱田作物的土壤处理等.尽管有关氟虫腈对蜜蜂的危害已有一些报道,但有关其对蜜蜂幼虫和幼龄工蜂的亚致死作用研究仍较为缺乏,鉴于此,本文以意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)的工蜂幼虫和新出房工蜂(＜24 h)为研究对象,采用人工饲喂重复染毒法,分别测定了10-3、10-2、0.1、1和10 μg·L-1的氟虫腈对工蜂幼虫的21d慢性毒性和1、5和10 μg·L-1的氟虫腈对新出房工蜂7d和14d的慢性毒性.结果 表明,与对照相比,10-3～ 10 μg·L-1范围内的氟虫腈可以使幼虫化蛹率显著降低20.83％ ～ 47.91％ (P＜0.05),羽化率显著降低25.00％ ～ 43.72％(P＜0.05);对于幼龄工蜂,1μg·L-1和5 μg·L-1氟虫腈暴露7d和14d时蜜蜂死亡率均＜10％;10 μg ·L-1氟虫腈暴露7d时,死亡率＜20％,当暴露时间延长至14 d时,成蜂死亡率高达(65.0± 17.7)％ (P＜0.0001),显著高于对照组,这说明氟虫腈对蜜蜂具有一定的时间累积毒性(time reinforced toxicity,TRT).此外,通过对蜜蜂幼虫和工蜂体内抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT))、解毒酶谷胱甘肽转移酶(GST)酶活力及谷胱甘肽(GSH)、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的测定结果表明,氟虫腈暴露可显著提高幼虫体内CAT的酶活力和MDA含量(P＜0.05),但GST的酶活力显著降低(P＜0.01);而成蜂在经过处理后,体内CAT和GST的酶活力、GSH的含量均会显著降低(P＜0.05),这说明亚致死剂量的氟虫腈可干扰蜜蜂机体稳态,引发蜜蜂幼虫和成蜂显著的氧化损伤,从而危害蜜蜂健康.氟虫腈具有较强的内吸特性和环境稳定性,作物种子处理或卫生施用依然可能导致其在花粉、土壤和水体中的痕量级残留,本研究中发现氟虫腈对蜜蜂幼虫和成蜂生存及各生理指标的最低可观察效应浓度(LOEC)可低至10-5 μg·L-1和10 μg·L-1,相关结果可以补充低残留浓度下氟虫腈蜜蜂风险评价数据的不足,为未来氟虫腈的安全用药指导提供参考.