超滤分离、浓缩、脱盐青霉素酰化酶的研究

本文用中空纤维超滤膜对青霉素酰化酶进行了分离、浓缩的研究、实验了不同种类的膜、不同的酶活浓度、不同运行时间和不同压力等因素对膜透水量、截留率和酶的回收率的影响。结果表明:采用超滤技术分离、浓缩、脱盐青霉素酰化酶工艺,具有操作简单,酶的比活高,回收率高和省能等特点,适用于工业化生产。     

超滤法分离味精废水中的菌体

本文采用超滤分离-溶剂萃取处理含锌味精废水,重点讨论用聚丙烯腈和聚砜中空纤维超滤膜分离废水中的菌体及其主要参数对超滤分离性能的影响.日处理量为25吨废水的超滤运行实验表明,经超滤处理废水中的菌体去除率可达99％以上,废水可进一步用萃取法去除锌.     

米曲霉产氨基酰化酶条件及部分酶学性质研究

通过单因子和多因子摇瓶正交优化试验,确定了米曲霉液态发酵产氨基酰化酶的最佳发酵条件.优化发酵培养基组成(ρ/gL-1):葡萄糖40,蔗糖10,可溶性淀粉20,蛋白胨2.5,马铃薯液1000mL,pH自然.培养基装量50mL/250mL三角瓶,接种量4%.培养温度30℃,转速100r/min,发酵时间42h.每50mL培养物的总酶活由优化前的2627u提高到7338u,是优化前的2.79倍.研究了米曲霉氨基酰化酶的部分酶学性质.该酶催化反应的最适pH为7.0,最适温度为40℃,低浓度的Co2 (5×10-4mol/L)对酶活激活作用显著.图5表2参8     

米曲霉氨基酰化酶酶法拆分制备D型芳香族氨基酸

以DL-苯丙氨酸为起始原料,乙酸酐乙酰化后得到N-乙酰DL-苯丙氨酸,利用米曲霉氨基酰化酶立体结构专一催化水解N-酰基-L-氨基酸的酰胺键的特点,分别得到L-苯丙氨酸和N-乙酰D-苯丙氨酸.通过结晶法分离两者后,N-乙酰D-苯丙氨酸经6 mol/L HCI水解得到D-苯丙氨酸.由此拆分DL-苯丙氨酸得到光学纯度分别为98%的L-苯丙氨酸(收率84.8%,以原料N-乙酰-DL-苯丙氨酸的0.5倍摩尔量为理论产率)和92.3%的D-苯丙氨酸(收率89.5%).参22     

人参皂苷β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学特性

通过硫酸铵分级沉淀、透析和高效液相色谱等技术分别从两株黑曲霉Aspergillusniger 4 8g和A .niger 84 8g中分离纯化出了具有水解人参皂苷葡萄糖苷键的 β 葡萄糖苷酶 ,并对其酶学特性进行了研究 .结果表明 :两株黑曲霉A .niger 4 8g和A .niger 84 8g所产的 β 葡萄糖苷酶的表观分子量不同 ,分别为 34× 10 3 和 31× 10 3 kD ;两株菌所产的 β 葡萄糖苷酶的反应特性基本相同 .图 4表 4参 15     

自剪切及活性相关位点的组合突变提高头孢菌素C酰化酶水解活力

7-氨基头孢烷酸是合成头孢类抗生素的重要中间体,利用头孢菌素C酰化酶直接催化头孢菌素C获得7-氨基头孢烷酸的一步酶法与其它方法相比更加经济和环保,其关键是获得高活性的头孢菌素C酰化酶.本文以来源于Pseudomonas sp.KAC-1的Ⅰ类头孢菌素C酰化酶(CPCase-kac)蛋白序列为模版,对其基因进行全局优化设计,人工合成目的基因,并克隆至表达载体p ET28b,实现了CPCase-kac的高效表达.但是重组蛋白CPCase-kac表达活性较低,且自剪切不彻底,表达蛋白中存在前体形式的CPCase-kac,而头孢菌素C酰化酶的自剪切和活性往往相关.对CPCase-kac分子中影响活性的Y150、Q220、F347氨基酸位点进行饱和突变发现,活力提高的突变体Q220W、Q220G其第二次自剪切明显降低,而活力提高的突变体Y150R、Y150N、Y150H、Y150W及F347H、F347Y,自剪切却没有显著影响.将这些突变进行组合,最终得到了比活力提高了8.3倍的突变体Y150W/Q220G/F347Y.虽然Y150W/Q220G/F347Y突变体活性显著提高,但是其也具有Q220G较差的第二次剪切的特性.同时发现,外部条件改变可以影响CPCase前体或α’亚基的继续自剪切.这些发现为进一步提高CPCase-kac活性及应用打下了基础.     

一种嗜热细菌来源角质酶的分离纯化及酶学性质

通过跟踪发酵液中pNPB水解酶活性,对角质诱导的Thermobifida fusca 口发酵液进行分离纯化.采用活性炭脱色、硫铵沉淀、Phenyl HP疏水色谱、DEAE sephamse阴离子交换色谱等方法,分离纯化得到电泳纯PNPB水解酶.该酶水解角质可得到角质单体,是一种角质酶.SDS-PAGE电泳结果显示,角质酶表观分子量约为29×10~3.该酶的最适温度为60℃.在40℃和60℃下均具有良好的热稳定性.最适pH为8.0,pH稳定范围为6.0～9.0.该角质酶的生化性质适合在纺织工业中应用.图8表2参17     

转化血型用蕃茄α—D—半乳糖苷酶的分离,纯化及理化性质

成熟蕃茄匀浆后，经硫酸铵盐析，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０离子交换层析，ＳｅｐａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤和Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ－Ａｇａｒｏｓｅ亲和层析，获得了α－Ｄ－半乳糖苷酶（Ｃ．Ｅ．３．２．１．１１）。酶制剂经ＰＡＧＥ检测为一条带；ＳＤＳ－Ｇ－ＰＡＧＥ测得酶Ｍ，为３４０００；比活力５２．９Ｕ／ｍｇ．；提纯倍数为５２９０；产率为４５％。酶专一催化以α－Ｄ－半乳糖为末端ａ－（１，３）连接的糖苷     

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶的分离纯化及酶学性质

以苏云金芽胞杆菌为材料 ,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE - 32离子交换柱层析初步纯化 ,获得比活力为15 0 .5Umg-1的酶制剂 .研究酶催化胶体几丁质水解的反应时间和酶量对酶活力的关系 ,探讨酶催化胶体几丁质的最适条件 .温度和 pH对酶活力的影响和酶的热稳定性及酸碱稳定性的结果表明 :酶催化胶体几丁质水解的的最适pH为 5 .6、最适温度为 5 8℃ .该酶在pH 4 .5～ 6 .5区域稳定 ,而在pH >8能很快失活 ;在 5 5℃以下处理 30min ,酶活力保持不变 ;高于 5 5℃ ,酶快速失活 .图 5参 11     

产碱杆菌DN25中降氰酶的分离纯化及生化特性

以一株可降氰的产碱杆菌DN25为酶来源,通过超滤、30 mg/mL硫酸鱼精蛋白沉淀、30%～70%硫酸铵盐析和Phenyl-Toyopearl 650M疏水层析等步骤,获得比活力为44 U/mg的纯化酶制剂.在确定酶浓度、反应时间等氰降解活力测定条件后开展酶学性质研究,试图为将来氰降解代谢机理的深入研究和菌株的基因工程改造提供理论基础.研究结果表明,此纯化酶催化氰化物水解的最适pH值为8.0,最适温度为30℃.该酶在pH 7.0～8.0区域稳定,而在pH>9时会很快失活;在30℃保存10 h,酶活力保持稳定,高于60℃,酶快速失活.加入甘氨酸稳定剂,在60℃下保存20 min酶活仍可保留19.6%.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为3.11 mmol/L,最大反应速率Vmax为0.23 mmolL-1min-1.     

黑曲霉Aspergillus niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2-111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证,该酶纯化水平已达到电泳纯.该酶的表观分子量(Mr)约为47×103,最适pH值为3.0,pH稳定性范围为2.5～6.0,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～60℃;Gu2+、Mn2+对其有激活作用,Hg2+、Ag+对其则有轻度的抑制作用;该酶的氨基酸组成为中极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性.图4表5参15     

电-Fenton法降解青霉素的动力学研究

采用电-Fenton法处理青霉素钠(Penicillin G sodium, PGN)模拟废水,当T=20℃,pH=3时,投加0.5g·l-1 FeSO4和0.2ml·l-1 H2O2,在0.6A电流下降解青霉素钠废水(100 mg·l-1), 20min后青霉素钠去除率为79%,40min后去除率为95%.拟合实验数据得到青霉素钠降解反应的速率方程式为:-d[PGN]/dt=2.35×106 exp(-32869.4/RT )[Fe2 ]0.53[H2O2]0.8[PGN]1.14反应速率常数和反应级数表明,初始阶段降解反应进行非常迅速,且H2O2浓度比Fe2 浓度对电-Fenton降解反应的影响重要.     

黑曲霉Aspergillsu niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2-111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证,该酶纯化水平已达到电泳纯.该酶的表观分子量(Mr)约为47×103,最适pH值为3.0,pH稳定性范围为2.5～6.0,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～60℃;Gu2+、Mn2+对其有激活作用,Hg2+、Ag+对其则有轻度的抑制作用;该酶的氨基酸组成为:中极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性.图4表5参15     

灵芝TR6号漆酶的分离纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sephadex G100凝胶柱层析对灵芝TR6号漆酶发酵液进行分离纯化,得到电泳纯漆酶.SDS-PAGE电泳结果显示,该漆酶表观分子量为62×103.Native-PAGE鉴定该漆酶由一种同工酶组成,为单体酶.试验结果表明,该漆酶的最适反应温度为60℃,与ABTS的最适反应pH为4.5,Km为0.188 mmol/L,在pH 6.0～8.0之间较稳定.Fe2 、SDS和Tris对该漆酶活性具有抑制作用,EDTA和Tween80则对该漆酶活性具有促进作用.图8表2参10     

转化血型用蕃茄α－D－半乳糖苷酶的分离、纯化及理化性质

成熟蕃茄匀浆后，经硫酸铵盐析，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０离子交换层析，ＳｅｐａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤和Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ－Ａｇａｒｏｓｅ亲和层析，获得了α－Ｄ－半乳糖苷酶（Ｃ．Ｅ．３．２．１．１１）。酶制剂经ＰＡＧＥ检测为一条带；ＳＤＳ－Ｇ－ＰＡＧＥ测得酶Ｍｒ为３４０００；比活力５２．９Ｕ／ｍｇ·；提纯倍数为５２９０１产率为４５％．酶专－催化以α－Ｄ－半乳糖为末端ａ－（１，３）连接的糖苷键，以ＰＮＰＧ（对硝基苯－α－Ｄ－半乳糖昔）为废物，酶催化反应的Ｋｍ＝０．１１ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ为６７μｍｏｌ·ｍｇ１－·ｍｉｎ－１．ｔ稳定范是０～３５℃；ＰＨ稳定范围是４．０～７．０．最适ｐＨ为５．１．半乳糖是酶的竞争性抑制剂；Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｇ＋和ＥＤＴＡ对酶活性无影响．纯酶制剂可作为Ｂ型血向Ｏ型血转化的工具酶液．     

敌百虫萃取分离的研究

在考察敌百虫亲油性的基础上,本文对敌百虫稀溶液进行了溶剂萃取和络合萃取的研究。结果表于敌百虫的亲油一般,溶剂萃取分配系数较小,加入胺类络合剂提高了溶剂对敌百虫的萃取分配系数。     

鲤鱼肝胰脏线粒体DNA的分离,纯化方法

取活鲤鱼肝胰脏，经冲洗后，立即投入液氮中，然后制成匀浆，先在４℃下６００ｇ离心，保留上层液，再９００ｇ离心，保留沉淀物并用不同游泳重复悬浮洗涤离心，可得互比较纯的线粒体。将上述粒体在含１％ＳＤＳ的Ｓａｌｉｎｅ－Ｎａ２ＥＤＴＡ溶液中悬浮，于３７℃反应１５ｍｉｎ，然后在室温用混合溶剂萃到，先后用乙醇洗涤７００ｇ，１２００ｇ离心，待用电泳检查ＲＮＡ除净后，加少量蛋白醇－Ｋ除去其余蛋白质，最终获得比较的Ｄ     

一种新的中温酸性α-淀粉酶的分离纯化及酶学性质

从Bacillus sp.中分离纯化了一种新的中温酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究.粗酶经硫酸铵沉淀、 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、 Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤后获得电泳均一的α-淀粉酶,其分子量(Mr)约为56×103.该酶最适反应pH为5.0,在pH 5.0～11.0范围内稳定,具有较好的耐酸特性.该酶最适反应温度为40～50 ℃,在40～60 ℃范围内稳定.在60 ℃、 pH 4.5时,该酶能快速有效水解可溶性淀粉;在pH 5.0时该酶对多种生淀粉底物也具有良好的水解作用.因此,该酶有助于解决中温条件淀粉加工行业中,液化酶和糖化酶由于适用pH值的差异而无法联用的难题,是一种具有研究价值和应用前景的中温酸性α-淀粉酶.经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中两个肽段的氨基酸序列,通过比对发现,该酶与NCBI中已报道的α-淀粉酶序列具有一定的同源性,同时,在氨基酸水平上也存在着差异.     

汕头海域几丁质酶产生菌的筛选及其几丁质酶编码基因研究

在汕头海域表层沉积物中分离得到69株高产几丁质酶的菌株,对其中6株形态特征差异比较明显、几丁质酶活力比较高的菌株SWCH-1、SWCH-2、SWCH-3、SWCH-5、SWCH-6和SWCH-9进行了16S rDNA序列鉴定,发现它们分别归属于5个属.即短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas).采用兼并引物对6株菌几丁质酶编码基因的催化保守区片段进行了PCR扩增和序列分析,发现菌株均含有18家族几丁质酶编码基因;但是其编码的蛋白序列与NCBI收录的蛋白序列存在着差异,其中菌株SWCH-1和SWCH-3的蛋白序列与数据库中序列的相似性比较低,分别为85%和81%,菌株含有比较新的几丁质酶编码基因,其全基因序列的克隆和酶蛋白的纯化分析尚在进一步研究中.图6参18     

邻苯二甲酸二丁酯的酶促降解性的研究

测定了Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦＳ１的邻苯二甲酸酯降解酶对邻苯二甲酸二丁酯的降解特性;提出了邻苯二甲酸二丁酯酶促降解的途径,Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦＳ１细胞中的颗粒部分、溶液部分对邻苯二甲酸二丁酯都具有降解作用,Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦＳ１的邻苯二甲酸酯降解酶尾胞内酶;Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦＳ１