嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因perA在大肠杆菌中的高效表达

利用PCR技术得到嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillusstearothermophilus)过氧化氢酶基因 perA ,将该基因与表达载体 pKK2 2 3 3连接构建重组质粒pK perA ,转化大肠杆菌过氧化氢酶HPⅠ和HPⅡ双缺突变株UM 2 ,得到重组大肠杆菌UM 2 1.酶活测定结果表明 ,表达产物具有正常的生物学活性 .SDS PAGE电泳结果显示出明显的特异性表达条带 ,单体Mr =86× 10 3 ,与嗜热脂肪芽孢杆菌所产酶相同 .实验表明 ,重组质粒在宿主UM 2中有较好的稳定性 ,在无选择压力条件下传代 6 0次基本保持稳定 ,传代 10 0次重组质粒保留 80 %以上 .摇瓶实验确定重组菌的最佳表达条件为 :IPTG浓度 ,0 .75mmol/L ;诱导时间 3h ;培养基起始 pH 6 .5 ;诱导温度 37℃ ;装液量 5 0mL/ 2 5 0mL .在优化条件下 ,重组菌产生的过氧化氢酶占菌体总蛋白的 8% ,酶活力可达 35U/mL ,是原始菌株BacillusstearothermophilusIAM110 0 1的 11.7倍 .图 2表 1参 10     

产类胡萝卜素菌株的筛选及其培养条件初探

从土壤、植物落花、细菌污染的组织培养二三角瓶里的培养基上及被细菌污染的LB琼脂平板上分离筛选出十几株产类胡萝卜素的菌株，其中从污染的LB琼脂平板上分离的一株菌落颜色为黄色的菌株PBH，分类鉴定为库特氏菌属(Kurthia sp.)．菌株在以葡萄糖为碳源，添加番茄汁(3．6mL／L)、芝麻油(1．6mL／L)、Na2CO3(6g/L)和磷酸缓冲盐的液体培养基中28℃振荡培养5d，每mL培养液细胞生物量湿重达到65．57mg，类胡萝卜素产量达到9．896μg，菌体每g湿重细胞胡萝卜素含量为150．9μg．图10参13     

一株Ⅱ型甲烷氧化菌的筛选及培养条件

甲烷氧化菌能够以甲烷作为唯一碳源和能源物质生存.在甲烷氧化、氯代烃类污染物降解、相关化学品生产等方面具有重要的潜力.利用甲烷作为唯一碳源物质筛选分离得到一株甲烷氧化菌,并对其进行初步鉴定.在此基础上,利用单因子实验和Plackett_Burman实验等方法对获得菌株的培养条件:包括培养基条件(无机氮源种类和浓度、影响显著的金属离子及其浓度、p H值)以及培养温度进行优化.结果表明:经过16S r DNA鉴定,获得菌株与Methylocystis sp.SC2、Methylocystis hiersuta strain SV97等菌株的相似性达到99%,所以确定该菌株属于Methylocystis菌属(Ⅱ型甲烷氧化菌,甲基孢囊菌属),将本菌株命名为Methylocystis sp.M16.以1.0 g/L NH4NO3作氮源,1.0μmol/L铜离子,p H 7.00,温度30℃的条件下,甲烷去除率和菌体生物量最大.在各个因素的最优条件下,Methylocystis sp.M16菌液吸光值(A600 nm)均在0.5以上,甲烷去除率在95%以上.本研究分离得到一株Ⅱ型甲烷氧化菌Methylocystis sp.M16,并获得优化的培养基和培养条件,有望为M16菌应用提供理论参考.     

质粒pACYC184电转化松材线虫携带的荧光假单胞菌GcM5－1A

以质粒pACYC184为材料,研究了松材线虫携带的荧光假单胞菌的最适电转化条件.结果表明,荧光假单胞菌GcM5-1A培养至D600nm为0.5时制备感受态细胞,以300 mmol/L蔗糖溶液为电击缓冲液,质粒DNA终浓度为0.01 ng/μL,在25 μF电容、9 kV/cm电场强度、200 Ω电阻的电击条件下电击一次,可得最大的电转化效率,即5.5×106/μg(DNA).SDS-PAGE分析显示,转化质粒pACYC184的氯霉素抗性基因在受体细胞内得到了表达.本方法的建立为松材线虫携带的荧光假单胞菌的基因导入提供技术支持.为进一步通过基因敲除的方法,选择性地失活特定功能基因,进而确定这些基因在松材线虫病病理进程中的作用奠定基础.图2参16     

卵孢菌素产生菌株角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-20发酵培养条件优化

卵孢菌素(Oosporein)是具有广谱抗菌活性的二联苯醌类化合物;角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-20为本实验室通过遗传改良获得的卵孢菌素高产菌株.利用该菌株进行发酵条件研究,获得其最适发酵条件为接种量(体积分数)3%、初始p H 7.0、装液量60 mL/250 mL、摇床转速180 r/min、培养温度24℃.培养基碳氮源和无机盐筛选结果表明,15.0 g/L蔗糖、5.0 g/L蛋白粉及0.5 g/L氯化钠能显著提高卵孢菌素产量.以卵孢菌素为响应值,对蔗糖、蛋白粉、氯化钠进行三因素三水平的Box-Behnken实验设计及响应面法优化研究,得到蔗糖、蛋白粉及氯化钠的最佳配比分别为15.63 g/L、5.22 g/L、0.53 g/L,预测在此发酵条件下卵孢菌素最高产量可达2 547μg/mL,实验验证得到卵孢菌素产量为2 478μg/mL,与预测值接近;发酵条件优化后,卵孢菌素产量提高了56.14%.本研究获得了卵孢菌素稳定高产的摇瓶发酵技术参数.     

一种野生多孔菌的分离、鉴定、培养条件及抗氧化活性

多孔菌是一类子实体呈孔状且质地为革质至木质的大型担子菌,其中一部分具有较高的药用价值.对一株野生多孔菌子实体进行分离纯化获得纯培养BJ菌株,并对其分类、最适培养条件和液体发酵产物抗氧化活性进行分析.采用形态学和ITS分类学鉴定菌株的分类学地位;通过测定菌株在不同碳源、氮源等培养基中的生长状况,研究菌丝最适培养条件;使用2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)法测定菌株发酵液总抗氧化活性;使用总超氧化物歧化酶(T-SOD)法、1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基(DPPH)法测定菌株发酵液菌体的总超氧化物歧化酶活力和自由基清除能力.结果显示:经鉴定BJ菌株为石榴嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia punicata).菌丝体最适培养碳源为葡萄糖、麦芽糖和淀粉,最适氮源为酵母浸粉,最适C/N比为10/1,最适温度为28℃,最适pH为7.0.发酵液总抗氧化活性为0.517 mmol/L(维生素E),菌体的总超氧化物歧化酶活力为770.37 U/g,DPPH自由基清除力的IC_(50)为2.14 mg/mL.本研究从野外获取了一株高抗氧化活性的药用多孔菌资源,可为野生药用真菌的开发利用提供理论依据.     

中国与欧洲禾谷镰刀菌DON毒素HPLC定量比较分析

选用4个来自中国、7个来自欧洲的代表性禾谷镰刀菌菌株,经脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素特异引物鉴定,确认其具有产生DON毒素的遗传物质基础后,接种于PDB培养基培养7d,从培养基上清中经硅胶柱分离、纯化DON毒素,经HPLC定量分析表明,纯化的禾谷镰刀菌DON毒素,与购自公司的DON毒素标准样品一样,其HPLC检测谱峰清晰明显,基线平稳,无干扰,保留时间为9.5min左右;供试菌株的DON毒素含量分布在0.023~1.934μg/mL之间,德国菌株F703产毒量最大,比位居第二的中国菌株5005(1.232μg/mL)高57%;其余的6个欧洲菌株中,除意大利菌株Lor9(0.128μg/mL)略低于另一个中国菌株7105(0.135μg/mL)外,均比3个中国菌株(4020、7105、8029)的产毒量大.欧洲镰刀菌产生DON毒素的能力远远大于中国菌株,这说明欧洲菌株长期在欧洲生态环境下已演变形成其特有的高毒素代谢类型,我国有必要严防欧洲禾谷镰刀菌入侵,加强对来自欧洲的禾谷类粮食及其产品的镰刀菌和毒素的检疫和监控;同时,本研究建立的毒素样品制备与HPLC检测体系可用于准确定量分析样品的DON毒素.图3表2参14     

二年残孔菌的培养条件优化及其液体发酵产物的抗氧化及漆酶活性

二年残孔菌(Abortiporus biennis)是一种具有抗氧化、抗肿瘤功效的药用白腐真菌,可降解木质素、造成木材白色腐朽.以分离自江苏无锡的二年残孔菌WX-02菌株为材料,开展菌丝最适培养条件、液体发酵产物抗氧化活性及Cu2+诱导产漆酶活性研究.基于单因子试验的最适生长条件结果表明,葡萄糖是WX-02菌株菌丝体生长的最适碳源,牛肉膏和黄豆粉为最适氮源,C/N比为40/1时长势最佳,玉米粉和VC为最适生长因子,而菌丝生长最适pH和温度分别为7.0和32℃10%(V/V)接种量、28℃、150 r/min培养72 h条件下,PD培养基发酵液的总抗氧化活性为2.76±0.31mmol/L(FeSO4)和0.40±0.01 mmol/L(Trolox),DPPH自由基清除率为100.00%±0.00%,总SOD活力为15.75±0.25 U/mL;最适培养条件液体培养基发酵液的总抗氧化活性为0.20±0.03mmol/L(FeSO4)和0.16±0.01 mmol/L(Trolox),DPPH自由基清除率为59.06%±0.61%,总SOD活力为15.65±0.62 U/mL. 0.25 mmol/L Cu2+对胞外漆酶诱导效果最佳,PD培养基、0.25 mmol/L Cu2+、28℃、150 r/min培养96 h,胞外漆酶活性最高,为(1.82±0.02)×105 U/mL,是对照组的1.72倍.本研究表明WX-02菌株具有良好的抗氧化和产漆酶活性,具有药用和环境治理开发应用潜能.(图4表4参34)     

一株高产灵菌红素粘质沙雷氏菌的分离鉴定及发酵条件优化

天然色素化合物灵菌红素具有抑制细菌、真菌、疟疾、藻类和肿瘤细胞等多种生物学活性;微生物发酵是生产灵菌红素的主要方法.从自然界植物根际土壤中分离得到一株产红色色素的菌株JWR.经形态和16S rDNA测序鉴定,菌株JWR为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens);用酸性甲醇溶液对发酵液萃取得到灵菌红素的粗提物,利用FT-IR和HPLC鉴定产物,证明该菌株所产红色色素为灵菌红素.通过单因素以及正交优化法对发酵培养基组分和发酵条件进行优化,确定发酵培养基配方为橄榄油1.5 mL/L、牛肉膏0.5 g/L、硫酸镁0.25 g/L,发酵条件为接种量2.5%(V/V)、温度28℃、转速220 r/min.优化后灵菌红素产量提高到6.011 g/L,相比优化前提高了2.845倍.本研究分离粘质沙雷氏菌并优化发酵条件,提高了灵菌红素产量,可为其工业化生产奠定基础.     

基于高通量测序技术的铬污染农田土壤菌群多样性及修复菌株的筛选

菌种资源筛选是铬污染土壤生物修复的基础.以铬污染农田土壤为研究对象,采用高通量测序方法分析土壤细菌多样性特征,并根据多样性分析结果,采用选择性培养基和培养方法快速筛选对铬具有适应性和去除能力的细菌,以寻找能在铬污染农田土壤原位修复中具有较大应用潜力的菌种资源.结果显示:受铬污染的土壤细菌群落丰富度和多样性均低于未受铬污染土壤.门水平上,铬污染土壤中放线菌门(Actinobacteria)细菌丰度显著高于未受铬污染的土壤,是两种生境丰度差异最大的门.属水平上,芽孢杆菌属(Bacillus)是铬污染土壤中丰度最高的优势属,显著高于未受铬污染的土壤.从铬污染土壤中共分离到6株能够耐受1 000μg/mL铬的细菌. 6株菌都具有一定的六价铬Cr(VI)去除能力,其中Cr1、Cr3和Cr8能在72 h内将500μg/mL铬培养基中的Cr(VI)全部去除,Cr8能在72 h内将1 000μg/mL铬培养基中的Cr(VI)去除61.2%. 16S rDNA测序结果表明,6株菌中有5株属于厚壁菌门芽孢杆菌属,1株属于放线菌门纤维微菌属(Cellulosimicrobium).结合菌体及菌落形态特征和序列分析结果,铬去除能力最高的Cr8菌可初步被确定为C. aquatile.本研究表明铬污染降低土壤中细菌多样性,根据高通量测序结果有选择性地快速筛选铬污染修复菌株具有可行性,Cr8菌是国内首次分离到的具有铬污染修复功能的纤维微菌属菌株.(图11表5参40)     

不对称还原α-氨基苯乙酮菌种的筛选及转化条件优化

芳香基手性胺醇是许多手性药物合成的重要手性砌块,生物催化不对称还原前手性酮是合成该类醇的重要方法之一.以α-氨基苯乙酮盐酸盐为模型底物从土壤中筛选获得两株能分别高立体选择性催化底物产生R型、S型相应醇的菌株,对映体过量值(e.e.)分别为99%和77%,编号为1403和4802,鉴定菌株所属为镰刀菌属和地霉属.对两株菌培养时期和转化条件的研究表明镰刀菌1403最适生长时间为24 h,最优菌体浓度20 g/L,最优底物浓度5 g/L;地霉4802最适生长时间24 h,最优菌体浓度80 g/L,最优底物浓度3 g/L.底物特异性研究表明,菌株1403和4802均可转化α-氯代苯乙酮、α-溴代苯乙酮、α-羟基苯乙酮和苯乙酮为相应醇,且以α-羟基苯乙酮为底物时,其产物均为S型,e.e.值达99%.     

Streptomyces sp. WJS-825产谷氨酰胺转胺酶发酵条件优化及中试

应用五因子二次正交旋转回归试验设计,建立了微生物谷氨酰胺转胺酶 (TG)发酵生产过程中以酶活力和菌体细胞生长量作为目标函数的数学模型,并以此模型对链霉菌 (Streptomycessp. )WJS-825菌株发酵生产TG的培养条件进行优化,确定了影响TG生产的主要因子及其最适取值为多价胨 2. 1%、可溶性淀粉 1. 5%、初始pH 7. 0及培养温度 30℃.以该优化工艺条件进行了 5L发酵罐小试和 200L发酵规模的中试生产.结果表明,在中试发酵生产中使用以豆饼粉部分替代多价胨的经济性发酵优化培养基,以及发酵过程中在线监控pH、溶氧系数等多项发酵调控参数,并分段控制pH、温度、通气量和搅拌转速以及进行适时的流加补充碳源,该菌株生长繁殖能力强、产酶效果好,TG活性达 3. 2u/mL,而且连续重复的中试发酵生产试验的TG产量均稳定在 3. 2u/mL以上. 图 2表 3参 15     

微酸多年卧孔菌产漆酶条件优化及其在染料脱色中的应用

微酸多年卧孔菌(Perenniporia subacida)产漆酶能力对生物漂白等研究具有重要意义.通过单因子和正交试验确定了微酸多年卧孔菌(菌株号:Dai 8224)的最适产酶条件:麦芽糖20 g/L,酵母浸粉5 g/L,pH 5.4,Cu2+2.0 mmol/L,培养温度24℃,转速160 r/min,接种量1.5%(V/V),此时酶活最高可达1.945 U/mL.单独使用微酸多年卧孔菌漆酶粗酶液对染料具有很好的脱色效果.该菌株对于50 mg/L杂环类染料中性红的脱色率可达98.3%,对偶氮染料刚果红的脱色率次之,为91.57%,对亚甲基蓝和铬天青的脱色率也都在80%以上.此外,其催化中性红脱色的最佳底物浓度为60 mg/L,脱色率达到99.42%,其中,生物降解作用占55.92%,菌体吸附作用占43.5%.结果表明该菌对多种染料脱色具有较大的应用潜力.图4表3参31     

固定CO2氢细菌的筛选及其培养条件优化

从土壤中分离筛选到一株高效固定CO2 的氢氧化细菌—专性化能自养菌BHA 15 ,在最佳培养条件下(培养基 ρ/gL-1:NH4 Cl 4.0 ,Na2 HPO4 ·12H2 O 0 .75 ,KH2 PO4 0 .5 ,MgSO4 ·7H2 O 0 .3;V(H2 )∶V(O2 )∶V(CO2 ) =3 .5∶1∶1;pH =7;最适生长温度θ =30℃ ) ,密闭摇瓶中恒温 (30℃ )培养 40h后 ,菌体浓度 ρ(DW)达 1.6mg/mL ,菌体蛋白含量 71.8% .图 7表 2参 12     

几种诱导子对青霉PT95菌株固态发酵产生类胡萝卜素的影响

分别用粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、紫红曲霉(Monascuspurpureus)、掷孢酵母(Sporobolomycesroseus)、深红酵母(Rhodotorularubra)、诺卡氏菌(Nocardiasp. )N89和游动放线菌(Actinoplanessp. )A05的细胞壁制成6种诱导子.当在玉米培养基中添加适量诱导子进行诱导培养时,青霉PT95菌株的菌核生物量和菌核中积累的类胡萝卜素含量有了显著的提高(P<0. 01),从而提高了PT95菌株的类胡萝卜素产率.其中, 4种真菌诱导子的效果明显好于另外2种放线菌诱导子,紫红曲霉诱导子的效果最好.当培养基中紫红曲霉诱导子的质量分数为100μg/g时,每百克玉米的类胡萝卜素产率达到14 446μg,比对照提高176%.除紫红曲霉诱导子外,其余5种诱导子都能显著提高总色素中的β-胡萝卜素百分含量(P<0. 01). 表4参9     

Tet抗性铜绿假单胞菌接合转移pHN102方法研究

二亲本杂交实验通常要求受体菌不能携带有与质粒上相同的抗性.本次实验中受体菌铜绿假单胞菌(Pseudo-monas aeruginosa)和重组质粒pHN102都带有四环素(Tc)抗性.考虑到质粒pHN102导入受体菌后至少带有两个Tc抗性基因片段,转移接合子的抗性会增强,所以提高四环素浓度至20μg/mL,并利用pHN102上携带的luxAB发光酶基因标记受体菌筛选转移接合子,并设立对照菌株.通过抽提质粒、琼脂糖凝胶电泳检测,确定pHN102成功转入P.aeruginosa中.转移接合子经4次转接后,质粒仍可以稳定存在且能够稳定表达.P.aeruginosa(pHN102)的发光动力学曲线表明,加入底物20min后,发光强度趋于稳定.经液体培养稀释后进行发光度和活菌数测定,发现二者呈显著的线性关系(r=0.994).图4表2参6     

几株紫色非硫细菌的分离鉴定与产氢特性分析

从重庆地区不同环境淤泥、泥水样品中,经富集培养、分离纯化,获得5株紫色非硫细菌.根据菌体的菌落形态、染色特性、生理生化特征及活细胞光吸收峰对菌株进行常规鉴定,结合菌株16S rDNA扩增测序进行分子生物学分析验证,构建了菌株与数据库中近缘菌株的系统发育树.以优化的培养条件(营养、pH、接种量等参数)对供试菌株的生理生化特性和产氢能力做了比较分析.结果显示,5个菌株均为光合产氢细菌,菌株ANI、D1为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris),AN2、AS1、BS1等3株为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides);其中类球红细菌菌株AN2在给定的培养条件下光合产氢能力最高,可达9.55μg/mL d-1,是一株有应用前景的光合产氢细菌.图4表2参15     

克拉维酸产生菌的改良

以棒状链霉菌Streptomyces clavu ligerus CCRC11518(ATCC27064)为出发菌,采用经典物理和化学诱变剂处理的微生物诱变技术和现代理性化筛选方法,通过筛选抗终产物结构类似物舒巴坦钠突变株、底物甘油耐受型突变株、营养缺陷型突变株,最后获得一株克拉维酸高产突变株III50,其克拉维酸摇瓶产量为834.8μg/mL,是出发菌株产量(282.4μg/mL)的2.96倍.该突变株在琼脂斜面培养基上连续转接传代8代,克拉维酸的产量保持稳定.表12参8     

野生白桦茸的分离鉴定及其生物学特性

以采集自俄罗斯的野生白桦茸菌核为原料,经组织分离获得纯培养菌株(编号F1501),进一步进行分类鉴定、最适生长条件、液体发酵产多糖及其抗氧化活性与人工驯化研究.依据内转录间隔区ITS鉴定,确定F1501菌株属于锈革菌科纤孔菌属(Inonotus)真菌,其与桦褐孔菌(Inonotus obliquus)的相似性为99%;结合菌核、菌丝形态学特征,确定F1501菌株为桦褐孔菌.最适培养条件研究实验表明,F1501菌株的最适碳源、氮源、C/N、生长因子、温度、pH值分别为麦芽糖、牛肉浸膏、10/1、VB2、28℃、8.0;以马铃薯葡萄糖(PD)培养基、10%接种量、28℃、150 r/min培养10 d,发酵液中多糖含量为476.32 mg/L,总抗氧化活性为0.19 mmol/L(Trolox),对羟自由基(·OH)清除率为72.7%.以棉籽壳为主要栽培基质进行人工驯化试验,可以形成类子实体结构.本研究获得野生桦褐孔菌菌株,其生物学特性研究结果可为野生桦褐孔菌的人工驯化和开发利用提供理论依据.     

耐盐菌Pseudomonas brassicacearum YZX4的筛选、鉴定及其植物促生特性

植物根际促生菌(PGPR)具有促进植物生长的作用.从盐碱地植物根际土壤中分离筛选耐盐菌,测定其在盐胁迫下的1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性、吲哚乙酸(IAA)合成能力、嗜铁素合成能力、无机磷溶解能力,以及在Ashby无氮培养基上的生长情况;并对同时具有以上促生功能的耐盐菌进行不同盐浓度下的促生功能测定、小黄白(白菜Brassica pekinensis的一个品种)种子萌发促生实验和菌株鉴定.结果显示,在筛选得到的15株耐盐菌中,菌株YZX4在10 g/L NaCl浓度下同时具有多种促生特性.在不同盐浓度下促生功能测定实验中,当盐浓度为10 g/L时,菌株的ACC脱氨酶活性(以α-KA/Pr计)、IAA合成量和嗜铁素相对含量最高,分别为11.07(±1.89)μmol mg~(-1)h~(-1)、36.42 (±1.81) mg/L和0.61 (±0.15),且随着盐浓度的增加而降低;在20 g/L盐浓度下,该菌株的固氮量、有机磷溶解量和无机磷溶解量最高,分别为4.79 (±1.61) mg/L、1.68±(0.04) mg/L和23.77 (±1.30) mg/L.在小黄白种子萌发促生实验中,当盐浓度为5.84 g/L时,YZX4的菌液(105 CFU/mL)对小黄白的种子萌发率、幼苗根、茎长和平均鲜重分别提高了7.19%、17.33%、23.85%和22.69%.根据形态特征、生理生化鉴定结果和16S rDNA序列分析,初步确定菌株YZX4为油菜假单胞菌(Pseudowonas brassicacearum).上述研究结果表明在盐胁迫下同时具备多种促生特性的菌株YZX4可作为盐碱地改良微生物菌剂的优良菌源.(图6表4参37)