苏云金芽胞杆菌生物活性成分研究进展

自1901年Ishimata从家蚕(Bambyx mori)中分离出第1株苏云金芽胞杆菌淬倒亚种(Bacillus thuringiensis subsp.sotto)以来,对苏云金芽胞杆菌研究已有百年的历史.现在国际上确认的苏云金芽胞杆菌菌株已有69个血清型[6],近40000株. 由于苏云金芽胞杆菌的巨大经济利益,不断地引起了广大科研人员和产品开发商的极大兴趣.到目前为止,科学家们已     

苏云金芽胞杆菌菌株WB9编码活性因子的基因分析

采用PCR—RFLP及PCR技术对苏云金芽胞杆菌新分离菌株WB9的ICP、VIP、几丁质酶和肠毒素4种活性因子的编码基因进行了分析．结果表明，该菌株含有编码ICP的cry1Aa、cry1Ab、cry1Cb、cry1Fa和cry1GaS个cry1基因型，编码Vip3A蛋白的vip3A基因以及编码3种肠毒素的hblA、bceT和entS基因；不含编码几丁质酶的基因．将vip3A、hblA、bceT和entS基因PCR产物回收纯化后直接测序，经在线的BLAST软件进行同源性分析，前两个基因片段与Bt已公布基因序列的相应片段同源性分别为99％和96％～98％，bceT基因片段与蜡质芽孢杆菌bceT相应片段同源性为97％．     

苏云金芽胞杆菌苏云金素缺失突变株的筛选及特性研究

利用高温和SDS对苏云金素高产菌株CT-43-1c进行了质粒消除,筛选得到一株不产苏云金素的无晶体突变株BMB0806;并通过SDS-PAGE、高效液相色谱(HPLC)和脉冲电泳(PFGE)分析了野生型菌株CT-43、出发菌株CT-43-1c和突变株BMB0806杀虫晶体蛋白的组成、苏云金素的产量和质粒图谱之间的差异.结果表明,突变株BMB0806与菌株CT-43和CT-43-1c相比,分别缺失了3个和2个大质粒,从而不再产生苏云金素和由cry1B基因编码的分子量为140×103的杀虫晶体蛋白.进一步分析三者质粒图谱后发现,突变株BMB0806中苏云金素的缺失和cry1B基因所在的大质粒A直接相关.图5参12     

对甘薯茎线虫具有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌筛选及特性鉴定

为筛选对甘薯茎线虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株,提取12株供试Bt菌株的晶体蛋白,溶解后加入到甘薯茎线虫悬浮液中,统计3 d和7 d后甘薯茎线虫的死亡率.经初筛和复筛后得到一株对甘薯茎线虫具有高毒力的Bt菌株YBT-008,其对甘薯茎线虫的LC50值为203.76μg/mL.研究了YBT-008的生物学特性,结果表明,YBT-008在LB培养基上培养约12 h后进入稳定期,并且伴随芽胞的形成产生卵圆形的伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明YBT-008可产生多种待鉴定的晶体蛋白类型,质粒检测显示该菌株有5条质粒条带.YBT-008的获得为利用Bt防治甘薯茎线虫提供了新型菌株和基因资源.     

苏云金芽胞杆菌聚γ-谷氨酸-明胶微胶囊剂制备及其抗逆性

晶体蛋白是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)的主要杀虫成分,其抗热处理能力及抗紫外照射能力差,造成在生产及使用过程中易失活,防效不稳定,残效期短.为改良Bt剂型,探讨了以聚γ-谷氨酸(γ-PGA)-明胶为囊壁材料的复凝聚相分离法制备Bt微胶囊剂的加工工艺,并对制得的Bt微胶囊剂进行了抗热及抗紫外能力分析,比较了Bt成囊前后的杀虫活性和芽胞存活率.结果表明,经紫外(30 w)照射4 h,Bt微胶囊和Bt原粉对棉铃虫3龄幼虫的相对致死率分别是53.57%和16.60%,芽胞存活率分别是46.63%和6.90%;于80℃处理100 min后,对棉铃虫3龄幼虫的相对致死率分别是43.42%和26.11%;于100℃处理15 min,Bt微胶囊和Bt原粉的芽胞存活率分别是72.53%和25.50%.Bt微胶囊化可显著提高Bt对热处理及紫外照射的抗逆性.图4表2参13     

苏云金芽胞杆菌YBT-1520中SigL及其增强子结合蛋白的结构与功能分析

为揭示SigL及其增强子结合蛋白(EBPs)在苏云金芽胞杆菌(Bt)中的调控功能,在全基因组测序的基础上,采用生物信息学方法,对YBT-1520菌株的SigL及其EBPs的结构和功能进行深入分析.结果表明,YBT-1520基因组中存在1个SigL和6个EBPs,而且EBPs在结构上具有丰富的多样性,包含了EBPs的所有可能的结构域组织类型.SigL所调控的基因涉及11个假定的COG代谢途径,其中包括能量代谢、氨基酸代谢、翻译与细胞周期等.根据EBPs在基因组的位置推测,YBT-1520的EBPs参与γ-氨基丁酸代谢途径、精氨酸代谢途径、支链脂肪酸降解途径、多糖分解代谢等代谢途径的调控.本研究将为揭示Bt杀虫晶体蛋白大量表达的调控机制提供新的思路.     

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶的分离纯化及酶学性质

以苏云金芽胞杆菌为材料 ,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE - 32离子交换柱层析初步纯化 ,获得比活力为15 0 .5Umg-1的酶制剂 .研究酶催化胶体几丁质水解的反应时间和酶量对酶活力的关系 ,探讨酶催化胶体几丁质的最适条件 .温度和 pH对酶活力的影响和酶的热稳定性及酸碱稳定性的结果表明 :酶催化胶体几丁质水解的的最适pH为 5 .6、最适温度为 5 8℃ .该酶在pH 4 .5～ 6 .5区域稳定 ,而在pH >8能很快失活 ;在 5 5℃以下处理 30min ,酶活力保持不变 ;高于 5 5℃ ,酶快速失活 .图 5参 11     

高效处理草甘膦废水菌株的筛选

通过选择性富集、驯化培养、划线分离纯化,从三峡大学求索溪及宜昌某化工集团污水处理厂次生池、终生池和排污口4处活性污泥中分离得到菌株XF100,其中排污口的活性污泥中菌株XF100含量最大,其降解能力最强.经APT鉴定,菌株XF100为水生棒状杆菌(Corynebacterricus aquaticum).由单因子优化法实验得出菌株XF100降解草甘膦废水的最适条件:温度为30℃,pH为9.0,底物浓度为300 ml·1-1.最适条件下草甘膦废水降解率可达79.46%,其矿化程度较高.     

利用 S-层蛋白CTC在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白PMGA1.2的可行性及其免疫原性,为研制能常温长期保藏和运输的禽用口服疫苗奠定基础.用部分pmga1.2基因(pmga1.2p)代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段,构建了2个融合基因ctc-pmga1.2p和csa-ctc-pmga1.2p(csa表csaAB操纵元,其与S-层蛋白牢固地锚定到细胞表面密切相关);将含融合基因的重组质粒电转化入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中,获得了2个重组菌株BCCG(含ctc-pmga1.2p和携带csaAB操纵元的质粒)和CG(含csa-ctc-pmga1.2p).血凝和血凝抑制试验结果显示,2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组蛋白PMGA1.2P;小鼠免疫学实验证实,2个重组菌株所展示的重组蛋白均具有免疫原性,其中,重组菌株CG的免疫效果优于BCCG.结果表明,苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可被用来研制热稳定性禽用口服疫苗.     

不对称还原丙酮酸乙酯菌株的筛选及鉴定

以丙酮酸乙酯为底物,从成都某化工厂污水池及其附近土壤中分离到36株可将丙酮酸乙酯不对称还原成(S)-乳酸乙酯的菌株.经过多次复筛,最终获得了一株具有较高催化活性的酵母菌BTY18-6.在以该菌株静息细胞为催化剂,催化不对称还原丙酮酸乙酯合成(S)-乳酸乙酯的反应中,底物浓度为60 mmol/L时,底物转化率为86.9%,产物(S)-乳酸乙酯的ee值为88.7%.通过对其形态学、生理生化特征及其26S rDNA Dl/D2区域的分析表明,BTY18-6为胶红酵母.     

有机溶剂和变性剂对枯草芽胞杆菌溶栓酶活性的影响

以枯草芽胞杆菌LD-8547菌株发酵液为材料,提取分离溶栓酶,研究了几种有机溶剂及变性剂对枯草杆菌溶栓酶活性的影响.结果表明,甲醇对溶栓酶表现为抑制作用,在10%-15%浓度范围时,其抑制作用最强;乙醇在5%～15%浓度范围内对酶活有激活作用,但随浓度的增大则转变为较强的抑制作用;正丁醇和异丙醇对酶活力则表现出强烈的抑制作用;丙三醇对酶活力有轻微的抑制作用,随着浓度增加抑制作用逐渐增强;异戊醇在5%～15%浓度范围内有一定的激活作用,但当浓度大于15%时则表现为抑制作用.醛类对酶活也有较强的抑制作用;丙酮、DMSO、DMF、SDS和异氰硫酸胍对酶活均有不同程度的抑制作用;脲浓度＜0.01 mmol/L时略有激活作用,随浓度增大转变为抑制作用.实验同时对EDTA在不同浓度和不同时间内对酶活力的影响进行了研究,结果表明,浓度＜2mmol/L的EDTA基本不影响酶活力,但随着浓度的增大,其抑制作用明显增大.本实验还以牛血为材料,对酶液进行了体外抗血凝和溶血栓实验,结果表明,该酶具有抗血凝和溶血栓效果.     

一株铬还原菌的分离鉴定及铬还原特性研究

铬污染是目前最为普遍的重金属污染物之一,一定浓度的Cr(Ⅵ)会威胁动植物健康。用微生物修复技术降解高毒性的Cr(Ⅵ)可为环保高效的铬污染治理开辟新途径。针对从湖南某铬盐厂污染区土壤中分离筛选出的铬还原菌G12进行菌种鉴定及铬还原特性研究,明确该菌株的最适生长条件,考察其在不同环境条件下的铬还原效果,为原位微生物修复技术实际工程应用提供理论依据。通过菌株形态特征和16S r RNA基因序列分析,确定该菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌,鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。研究发现B.pumilus G12的最佳生长温度和p H分别为30℃和9.0;且菌株铬还原能力随着初始Cr(Ⅵ)浓度的升高而下降;在50、100、200、400和600 mg·L~(-1)初始Cr(Ⅵ)浓度条件下其铬还原率分别为66.2%,35.7%,26.1%,16.0%和6.0%。在改变环境过程中,该菌株以甘油为外加碳源电子供体时对Cr(Ⅵ)的还原率可达100%,在60 h可将50mg·L~(-1)Cr(Ⅵ)还原为零;菌株G12培养可耐受较高盐浓度,在10 g·L~(-1) Na Cl盐浓度下菌株的还原能力最佳,Cr(Ⅵ)的去除率为70%;将菌株分别培养在含不同重金属离子的培养液中,菌株G12还原能力均受到抑制。对菌株G12的铬还原能力的初步研究结果表明,菌株G12在铬污染修复中具有良好的应用潜力。     

嗜铁细菌枯草芽胞杆菌Bs-15对辛硫磷的降解特性

为探讨嗜铁细菌对农药辛硫磷的降解及其土壤修复的潜能,采用改良定向培育法,对嗜铁细菌枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)Bs-15进行驯化,摸索其降解条件,并测定其土壤修复能力.结果显示,菌株Bs-15对辛硫磷有较高的耐受性,在辛硫磷浓度达到800 mg L-1时仍可生长;可以以辛硫磷为唯一碳源生长,适合其降解的最佳外加营养物质为酵母粉,无机盐为MgCl2.最适辛硫磷降解浓度为≤100 mg L-1,浓度继续升高时降解效能明显降低;最适降解温度为35℃;对pH值有较广的适应范围,在pH 5-9时降解率较高;最适降解时间为24 h,振荡速率为150 r min-1,接种量为8%;土壤修复试验表明,此菌株在第20天时对土壤中辛硫磷的降解率接近50%.本研究结果说明枯草芽胞杆Bs-15对辛硫磷具有较好的降解作用,对辛硫磷污染的土壤具有良好的修复潜能.     

胶质类芽胞杆菌对花生生长和土壤微生物学性状的影响

研究不同施用条件下胶质类芽胞杆菌3016对花生生长、土壤酶活性及微生物多样性等的影响,为揭示该菌种的增产机理提供依据.田间小区试验设置4个处理:T1(对照)、T2(接种3016)、T3(接种3016,50%的常规施肥量)和T4(常规施肥).结果发现,T3处理花生单株总果数、单株总果重、百仁重、出米率和产量表现均为最高,分别高出对照27.1%、22.9%、7.8%、2.4%和10.4%;花生果仁和茎叶中养分含量与T4处理持平或略高,其中钾含量增加显著(P0.05),分别达到0.55%和1.19%;同时,T3处理土壤细菌、放线菌数量和土壤脲酶活性也显著(P0.05)高于对照,土壤菌群结构得以改善,有助于实现土壤肥力的提高.因此,接种胶质类芽胞杆菌3016配施50%的常规施肥量,不仅能达到花生高产的目的,而且改善了土壤的生物学性状,是一种节本增效的施肥方式.     

厌氧条件总磷还原为磷化氢种泥筛选及功能菌株鉴定

厌氧除磷是一种高效、节能、低耗的方法。获取经济、方便、高效的种泥是实现该方法的前提,种泥中产生磷化氢功能菌株的组成及特性是提高处理效能和开发新工艺的基础,目前此研究未见有关报道。本研究依据厌氧除磷理论,利用厌氧培养反应瓶、筛选培养基和微生物筛选、分离、鉴定的方法。以A2/O厌氧池、污泥浓缩池污泥、养殖场新鲜猪粪、鸡粪、牛粪及鸭粪为研究种泥,通过跟踪厌氧培养过程培养液中总磷的去除率和吸收液中磷化氢的生成量筛选出最佳种泥,并对最佳种泥的菌株进行筛选、分离和鉴定。结果表明,6种泥中鸡粪的厌氧除磷能力最强,鸭粪能力最弱,浓缩池中的污泥和猪粪次之,牛粪及厌氧池污泥有一定的作用。本试验条件下鸡粪是厌氧除磷的最佳种泥。经过3个周期的厌氧培养,6种泥培养液总磷的去除率和吸收液中磷化氢的含量随培养时间增长都有不同程度增加。鸡粪的最佳培养时间为5d。鸡粪培养液经21d培养后分离到1株芽孢杆菌属、1株假单胞菌属及2株肠杆菌科,明确了2株肠杆菌科中1株为埃希氏菌属另1株为柠檬酸杆菌属。     

高效转化胆固醇菌株的筛选、鉴定及转化条件优化

胆固醇由甾体母核和侧链构成,是一种新的甾体资源.以胆固醇为唯一碳源的选择培养基,利用富集培养法从土壤中筛选出一株细菌,编号5901.该菌能够快速高效转化胆固醇,专一性生成4-胆甾烯-3-酮.经形态学观察和16S rDNA序列比对分析,该菌株为Rhodococcus sp.该菌株转化胆固醇的最优条件为:生长温度和转化温度均为30℃,初始pH 8.0.胆固醇质量浓度为5 g/L,反应24 h后,胆固醇转化率为95%.本研究表明,590 1菌株较之前报道的菌株,底物浓度高,转化速率快,也可以催化其它甾体化合物的3β-羟基氧化和5位双键位移反应,具有潜在的研究和应用价值.     

1株高效油脂降解菌株的筛选及其降解特性研究

从学校餐厅污泥中分离得到7株油脂降解菌。以芝麻油为唯一碳源,通过驯化培养、初筛和复筛得到1株芝麻油降解优势菌株。菌种特性研究表明其为好氧菌,降解芝麻油的最适温度为30~37℃左右,pH值为8.0;在最佳生长环境下,该菌株在含20g·L-1芝麻油的培养基中72h内对油脂的降解率达80%以上。     

枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶突变株的筛选及其拮抗作用

从小麦根际土壤中分离到一株对多种植物病原真菌有拮抗作用且产蛋白酶的枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis T2.经紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)诱变处理,获得具有良好遗传稳定性的蛋白酶正负突变株.与出发菌株相比,培养48 h的正突变株胞外蛋白酶活力提高108.5%,负突变株蛋白酶活力降低81.1%,而二者的几丁质酶和β-1.3-葡聚糖酶活力均无显著变化.正突变株对棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum)的平板拮抗作用增强,其粗酶液可使该菌菌丝变形膨大成珠状、原生质浓缩,萌发的孢子芽管短且畸形膨大;负突变株对该菌的平板拮抗作用显著降低,粗酶液对该菌菌丝和孢子的形态无明显作用.表明提高生防芽孢杆菌胞外蛋白酶的活力可增强其拮抗病原真菌的能力.     

基于高通量测序技术的铬污染农田土壤菌群多样性及修复菌株的筛选

菌种资源筛选是铬污染土壤生物修复的基础.以铬污染农田土壤为研究对象,采用高通量测序方法分析土壤细菌多样性特征,并根据多样性分析结果,采用选择性培养基和培养方法快速筛选对铬具有适应性和去除能力的细菌,以寻找能在铬污染农田土壤原位修复中具有较大应用潜力的菌种资源.结果显示:受铬污染的土壤细菌群落丰富度和多样性均低于未受铬污染土壤.门水平上,铬污染土壤中放线菌门(Actinobacteria)细菌丰度显著高于未受铬污染的土壤,是两种生境丰度差异最大的门.属水平上,芽孢杆菌属(Bacillus)是铬污染土壤中丰度最高的优势属,显著高于未受铬污染的土壤.从铬污染土壤中共分离到6株能够耐受1 000μg/mL铬的细菌. 6株菌都具有一定的六价铬Cr(VI)去除能力,其中Cr1、Cr3和Cr8能在72 h内将500μg/mL铬培养基中的Cr(VI)全部去除,Cr8能在72 h内将1 000μg/mL铬培养基中的Cr(VI)去除61.2%. 16S rDNA测序结果表明,6株菌中有5株属于厚壁菌门芽孢杆菌属,1株属于放线菌门纤维微菌属(Cellulosimicrobium).结合菌体及菌落形态特征和序列分析结果,铬去除能力最高的Cr8菌可初步被确定为C. aquatile.本研究表明铬污染降低土壤中细菌多样性,根据高通量测序结果有选择性地快速筛选铬污染修复菌株具有可行性,Cr8菌是国内首次分离到的具有铬污染修复功能的纤维微菌属菌株.(图11表5参40)     

一株高效不对称还原产生(R)-苯基乙二醇的菌株筛选、鉴定及全细胞催化体系

(R)-苯基乙二醇是合成许多光学活性药物的重要手性中间体,其制备具有重要的现实意义.以α-羟基苯乙酮为底物,从土壤中筛选得到一株能够立体选择性催化α-羟基苯乙酮产生(R)-苯基乙二醇的细菌菌株HBU-SI7.经形态学观察和16S r DNA序列分析,鉴定此转化菌株为红球菌属菌株Rhodococcus sp.菌株全细胞催化体系研究表明在邻苯二甲酸二丁酯-磷酸盐缓冲液(V:V=1:3)的两相催化体系下,菌体转化α-羟基苯乙酮的最优浓度为3.0 g/L,转化率高达96.2%,e.e值为99.3%.本研究建立的红球菌全细胞催化还原体系对(R)-苯基乙二醇的高效制备具有潜在的研究和应用价值.