过量表达SlWD6基因增强番茄抗旱和耐盐功能

WD40蛋白广泛存在于真核生物体内,在生物体内协助细胞行使多种功能,目前关于WD40蛋白的研究多集中在拟南芥菜和水稻中.生物信息学分析显示,Sl WD6蛋白包含两个保守的WD-repeat结构域,属于WD40家族.为了解番茄中Sl WD6基因的功能,采用RT-PCR方法检测番茄的根、茎、叶、花和不同发育时期果实中Sl WD6基因表达量.利用RT-PCR方法获得Sl WD6基因全长,并且构建Sl WD6过量表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因植株,利用Realtime PCR检测3个独立的转基因株系(WD6-393、WD6-418和WD6-421)中Sl WD6基因的表达量,并进行耐盐和抗旱性分析.结果显示,番茄Sl WD6基因为组成型表达,果实各时期表达量较高,在红果时期表达量达到最高;转基因株系中Sl WD6基因的表达量显著高于野生型;在干旱和高盐胁迫下,转基因植株叶片脯氨酸(Pro)含量显著高于野生型,丙二醛(MDA)含量与野生型相比则显著降低.用Na Cl和甘露醇介导耐盐和干旱胁迫,Sl WD6转基因植株T2代种子的根长和苗长显著高于野生型植株.综上,Sl WD6基因的过量表达能够显著增强番茄的抗旱和耐盐功能.     

高赖氨酸蛋白基因在转基因生菜中的表达和遗传转化

以生菜(LactucasativaL.)为受体材料,将含有高赖氨酸蛋白基因的植物表达载体pLBI用农杆菌介导法进行遗传转化,获得47株转基因生菜植株.PCR和Southern-blotting检测证实目的片段在T0代的整合,RT-PCR检测表明目的基因的转录.T0代植株赖氨酸(Lys)含量的测定分析表明,赖氨酸有不同程度的提高,比对照提高最高的可达9.46%.T1代植株PCR检测证明,目的基因能够遗传.图5表1参25     

石斛PRMT基因家族的鉴定及其在不同光周期下的表达

蛋白质精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferases,PRMTs）是真核生物基因组中重要的表观遗传调控因子之一,在植物信号转导、蛋白亚细胞定位和转录调控中发挥着重要作用.基于铁皮石斛基因组数据库,采用生物信息学方法对石斛PRMT基因家族进行成员鉴定,并对其基因结构、蛋白质保守基序（motif）、蛋白质理化特性和启动子顺式作用元件等进行分析.通过qRT-PCR检测DoPRMT在不同组织部位中的表达模式及对不同光周期条件的响应.在铁皮石斛（Dendrobium officinale）基因组上共筛选鉴定到6个PRMT成员,基因结构分析发现,该家族各成员内含子外显子数量有所差异,其中相差数量最多的达到25个.系统进化树可将石斛PRMT家族划分为3种类型（I、II、III）甲基转移酶,石斛中存在I型PRMT有5个,1个II型PRMT,III型甲基转移酶在其中不存在同源序列.保守结构域分析结果显示,该家族成员含有特定的PRMT和PrmA保守结构域,多数成员仅含有PrmA结构域.保守基序分析发现,该家族包含motif数量较多,各成员包含共有的motif1和m...     

表达马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的转基因烟草抗病机制

根据已报道的马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)核苷酸序列，克隆了PVY^N外壳蛋白(CP)基因，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导的方法，转化烟草NC89，获得了38株PCR呈阳性的转基因植株．攻毒试验发现，转基因植株对PVY^N的抗性水平存在着差异，其中有4株表现为高度抗病性．Southern blot表明，PVY^N CP基因已经整合到烟草染色体中，转基因的拷贝数与植株的抗病性成正相关．Northern blot表明，PVY^N CP基因在RNA水平上得到了表达，而且PVY^N CP RNA在细胞中的积累量与转基因植株的抗病性呈明显的负相关．Western blot表明，高度抗病植株未检测到转基因CP蛋白质，而抗病和感病植株都检测到了PVY^N CP蛋白，且不同抗性的转基因植物中转基因蛋白质的积累有一定的差异．实验结果表明，表达PVY^N CP基因的转基因烟草其抗病机制类似于转录后的基因沉默，即抗病件可能是RNA介导的．     

番茄SlNAC1基因启动子的盐应答功能分析

番茄NAC转录因子编码基因SlNAC1受假单胞菌、盐、干旱和低温等多种生物和非生物胁迫诱导表达,但其转录调控机制仍不清楚.为研究SlNAC1的盐应答转录调控机制,分离SlNAC1基因的启动子并分析其盐应答功能.构建4个5′-缺失的SlNAC1启动子(起始密码子上游2 039 bp、1 508 bp、1 373 bp和777 bp)驱动的GUS基因表达载体,并利用农杆菌介导法分别转化烟草(Nicotiana benthamiana),随后对转基因植株进行NaCl处理和GUS染色分析.结果显示,未经NaCl处理的转基因植株均不被明显染色,而NaCl处理后,除777 bp启动子转基因植株外,2 039 bp、1 508 bp和1373 bp启动子转基因植株都被明显染色.这说明SlNAC1启动子中盐应答元件位于-1 373 bp和-777 bp之间.结合该区间有4个盐应答元件——GT1GMSCAM4元件(核心序列为GAAAAA)的预测分析结果,推断这4个GT1GMSCAM4元件中的一个或者多个协同负责SlNAC1基因的盐应答转录调控.这4个GT1GMSCAM4元件将用于筛选SlNAC1盐应答的转录调控因子.(图4表1参28)     

绿萍LmPDS基因RNAi载体的构建及遗传转化

PDS基因编码控制类胡萝卜素生物合成过程中的关键酶,其被沉默或抑制性表达会使叶片组织出现斑驳、黄化、白化的现象.构建绿萍(Lemna minor)LmPDS基因RNAi载体及完成遗传转化研究,对于实现RNAi技术在绿萍中的应用具有重要意义.选取595 bp LmPDS基因片段为干涉片段,利用中间载体pUCCRNAi将克隆的LmPDS干涉片段正反向插入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCST中.将成功构建的RNAi载体通过农杆菌介导法转入绿萍愈伤,经愈伤抗性筛选、植株再生、植株扩培、标记基因NPTII检测等过程,获得植株70株,其中4株为转基因阳性植株.再经荧光定量PCR分析、番茄红素含量检测、表型观察转基因植株.结果显示,转基因阳性植株LmPDS相对表达量明显下降,为对照的28.8%-40.5%,其番茄红素含量也明显下降,且叶片出现了明显的白化表型.本研究成功构建绿萍LmPDS基因RNAi载体,实现了RNAi在绿萍中的应用,结果可为进一步的绿萍基因功能研究提供材料和方法.(图11表1参30)     

异源表达胡杨PeCPD基因提高烟草对盐、高氮和干旱胁迫的抗性

油菜素类固醇(Brassinosteroids,BRs)在调节植物生长发育和提高植物对非生物胁迫的抗性中起着重要作用,CPD(Constitutive Photomorphogenesis and Dwarfism)基因编码一种甾醇类23a羟化酶,在BR的生物合成中发挥着重要作用.本研究克隆胡杨Pe CPD基因的c DNA序列,并利用农杆菌介导法,将Pe CPD基因植物过表达载体p BI121-35S::Pe CPD转化野生型烟草,筛选得到Pe CPD基因过表达的转基因烟草植株,并利用Na Cl、高氮和甘露醇分别对转基因和野生型烟草进行胁迫处理,检测转基因烟草的耐受性和相关的生理生化指标.结果表明:(1)在正常条件下,转基因烟草的鲜重是野生型烟草的1.47倍;(2)在Na Cl、高氮以及甘露醇的胁迫处理下,转基因烟草植株的根长、叶片叶绿素和类胡萝卜素的含量均显著高于野生型植株,抗氧化酶SOD和POD活性以及渗透调节物质脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的含量也同样表现为转基因烟草显著高于野生型,而野生型植株的丙二醛(MDA)含量显著高于转基因植株.因此在烟草中异源过表达胡杨Pe CPD基因不但能够增加烟草的生物量,而且能够提高烟草对盐、高氮和干旱胁迫的抵抗能力.     

根癌农杆菌介导的高赖氨酸蛋白基因转化叶用莴苣的研究

构建了植物表达载体pLBI，该载体携带35S启动子、高赖氨酸蛋白基因(LRP)、NPTⅡ基因和NOS终止子，对影响根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens L.)转化的多种因素进行探索后，建立了一种农杆菌介导的稳定的叶用莴苣遗传转化系统．选择目前生产上大量推广应用的叶用莴苣品种，以其无菌苗子叶为外植体，经农杆菌LBA4404(含质粒pLBI)感染，在含ρ(Kan)／mgL^-1=100的芽分化培养基上筛选转化芽，转入含相同浓度抗生素的生根培养基上进行生根筛选，直至得到完整的再生植株．PCR扩增及Southern blot的检测结果均表明，高赖氨酸蛋白基因已整合到叶用莴苣基因组中．图4表4参6     

转pBinMoBc基因棉花的培育与应用

采用农杆菌介导法将含有复合OM启动子和增强子Ω因子的外源基因pBinMoBc导入冀棉20中.转化再生株经分子检测表明,外源基因已整合到转基因植株基因组内,并得到了表达,转化外源基因插入拷贝数是1~2个.转化后代材料经6~7代选育为纯合品系2001pb-3.2001pb-3抗虫性较好,每公顷产皮棉1534.5kg,比对照增产18.68%.图5表3参4     

基于连续发酵驯化的高耐盐性酿酒酵母的育种

耐盐酿酒酵母菌株的育种对降低燃料乙醇生产成本具有重要意义.以具有优秀乙醇发酵能力的工业酿酒母菌株KF-7为出发菌株,通过连续发酵、产孢子及孢子培育、交配等获取稳定耐盐菌株.在盐胁迫条件下利用连续乙醇发酵驯化获得了耐盐突变菌株KF-7(4).在此基础上,通过孢子分离、培养、评价和交配,获得两株耐盐二倍体菌株KF-7(4)-3与KF-7-D1.这3株耐盐菌株在50次转接过程中保持着稳定的耐盐性.并且在9%KCl浓度下,3株耐盐菌株的乙醇发酵能力显著优于出发菌株KF-7:在15%YPD培养基中,发酵36 h时的乙醇浓度比出发菌株KF-7提高了21%.有盐和无盐条件下发酵过程中胞内海藻糖含量分析表明,突变菌株KF-7(4)和菌株KF-7(4)-3即使在无盐条件下的海藻糖积累能力明显高于出发菌株KF-7.本研究获得的变异酿酒酵母菌株具有较高的耐盐性和稳定性,耐盐性与胞内海藻糖积累能力提高相关.因此,基于连续发酵的进化工程手段可以有效地用于培育具有某种稳定性状的酿酒酵母菌株.     

番茄SIZ1-like1基因的克隆与功能

SUMO(Small ubiquitin-related modifi er)化修饰是植物体内一种重要的蛋白质功能调节方式.它调控植物细胞中蛋白的降解与定位,植物抗性及激素调节等.SIZ1是SUMO的E3连接酶并在SUMO化中起重要作用.为了解SIZ1基因在番茄中的功能,成功克隆番茄(Solanum lycopersicum)SIZ1基因(SIZ1-like1)并构建番茄SIZ1-like1RNA干涉和过表达载体后,通过农杆菌介导转入野生型番茄,成功获得6个独立的转基因阳性植株.荧光定量PCR(Real-time PCR)分析野生型番茄中SIZ1-like1基因的组织表达特异性,发现SIZ1-like1在植物的各个组织中都有表达.构建SIZ1-like1黄色荧光蛋白融合表达载体,通过对SIZ1-like1融合黄色荧光蛋白转基因番茄的根尖进行荧光显微观察,证实番茄SIZ1蛋白定位于细胞核.干旱胁迫实验分析显示,过表达转基因植株抗旱性强于野生型,且脯氨酸含量是野生型的3倍左右,而RNAi植株抗旱能力则较弱.因此SIZ1基因对番茄抗旱起到了正调控作用.     

小麦TaMyb2基因转化拟南芥表达载体的构建与遗传转化

采用双酶切方法构建了小麦TaMyb2基因转化拟南芥表达载体pCHF3-35Sp-TaMyb2-I-NOSter和pCHF3-35Sp-TaMyb2-Ⅱ-NOSter.并通过农杆菌GV3101介导,用渗透法将TaMyb2-Ⅰ和TaMyb2-Ⅱ基因转入拟南芥中.结果表明,TaMyb2-Ⅰ、TaMyb2-Ⅱ和表达载体pCHF3分别被KpnⅠ和PstⅠ成功酶切为837 bp、840 bp和10.4 kb的目标条带;分别将pCHF3-35Sp-TaMyb2-Ⅰ-NOSter和pCHF3-35Sp-TaMyb2-Ⅱ-NOSter转入农杆菌GV3101中,在提取的农杆菌质粒DNA中分别扩增出了837 bp和840 bp目标条带,说明可用于拟南芥的转化;在含Kan(50 mg/L)的1/2 MS培养基上筛选转基因当代拟南芥植株的种子(T0),获得了T1代抗性植株,转化率约为0.1%.     

Xα21基因导入水稻及转基因植株的鉴定

以水稻愈伤组织为受体、质粒pCXK1301为Xα21基因供体,用农杆菌EHA105和PDS－1000／He基因枪转化受体,经Hyg浓度梯度筛选,获得一些转基因水稻植株,GUS检测、PCR扩增和Southern杂交分析表明,报告基因（GUS）、选择标记基因（Hyg^r）和抗白叶枯病基因Xα21都已整合入转化水稻基因组中,Southern杂分析显示了Xα21基因在转化水稻基因组中整合的拷贝数。田间接菌鉴定表现抗白叶枯病。     

蚯蚓粪对铁皮石斛抗氧化能力及次生代谢产物的影响

在盆栽条件下使用不同含量蚯蚓粪的基质(蛭石)栽种一年生铁皮石斛(Dendrobium officinale),并在栽种的第15、30、45天时,分析石斛抗氧化能力和次生代谢产物含量的变化.结果表明:含有蚯蚓粪的栽培基质能提高铁皮石斛的超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化物酶(POD)比活力、丙二醛(MDA)含量、根系活力、可溶性蛋白含量以及茎中黄酮和多糖含量(P0.05),蚯蚓粪含量不同效果有所差异.其中,蚯蚓粪含量为60%时,第45天石斛SOD活力和POD比活力较之对照分别增加了29%和156%;蚯蚓粪含量为80%时,在栽种45 d后石斛根系活力、可溶性蛋白含量以及多糖和黄酮含量较之对照分别增加了235%、37%、102%和97%;蚯蚓粪含量为20%、40%、60%和80%时石斛体内MDA含量均显著降低(P0.05).综上,人工栽培中使用适宜含量的蚯蚓粪能提升铁皮石斛品质,80%为提高其药用品质的最适含量,60%为提高其抗氧化能力的最适含量.     

中度嗜盐菌Halomonas sp.BYS-1耐盐相关DNA片段的克隆

通过固体亚硝基胍诱变获得了Halom onassp.BYS-1的盐敏感突变株BYS-1M.以pBBR1MCS-2为载体在E.coliDH5α中构建了BYS-1的基因文库.以文库菌E.coliDH5α(pBBR-X)为供体菌、E.coliWD803(pRK2013)为辅助菌、BYS-1M为受体菌进行三亲接合,筛选到了恢复耐盐性能的接合子HR-23,提取接合子HR-23的重组质粒pHR23,酶切确定其插入的耐盐相关DNA片段大小分为5.4 kb.该片段为Halom onassp.BYS-1耐盐相关基因的克隆奠定了基础.图5表1参14     

一株降解除草剂膦化麦黄桐(PPT)菌的筛选与鉴定

从喷洒有除草剂的土壤中分离到一株能分解膦化麦黄桐(PPT)的细菌.该菌在以PPT为唯一碳源的培养基上生长,能利用PPT的最高浓度为2. 7g/L.采用常规生理生化鉴定方法,并结合16SrDNA序列分析法对该菌进行鉴定.结果表明,该菌与生癌肠杆菌(Enterobactercancerogenus)序列相似性为99. 3%,在细菌分类学上属于肠杆菌.将它命名为Enterobactersp. PPT. 图4表2参7     

双农杆菌共转化获得无标记转pepc基因的水稻植株

利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择标记转pepc基因的水稻植株.采用两个农杆菌EHA105转化粳稻品种台粳9号幼胚诱导的胚性愈伤组织,其中一个农杆菌内的质粒表达载体的T-DNA区仅含有目的基因pepc,另一个的T-DNA区含有选择标记基因hpt和GUS报告基因.获得抗性愈伤的转化率为9.2%.85.3%的抗性愈伤分化成T0代株系,其中78.8%的T0代植株为GUS阳性转基因植株.PCR分析表明,在78个T0代GUS阳性植株(来源于23个抗性愈伤组织)中共有35个植株(来源于7个抗性愈伤组织)含有pepc基因,即在23个GUS阳性株系中发生共转化株系的频率为30.4%.7个共转化的株系中有5个株系自交产生后代植株中含有无标记转pepc基因植株,其比例为71.4%.无标记的转pepc基因水稻植株中PEPC活性平均比对照提高8.8倍;与非转基因对照植株相比,转pepc基因水稻植株表现出更强的光合能力.图5表3参26     

编码水稻胞外核苷酸双磷酸酶基因的表达特性

NTPDase(Nucleoside triphosphate-diphosphohydrolase,核苷酸双磷酸酶)在哺乳动物巾分布于细胞膜,可以水解细胞外ATP和其他核苷酸,从而调控胞外核苷酸代谢及信号应答.根据水稻NTPD基因序列设计引物,在不同胁迫条件样品中,通过PCR扩增水稻NTPD基因,结果表明水稻NTPD基因表达水平在盐胁迫样品中升高.为进一步分析水稻NTPD基因的功能,构建了该基因的过量表达、RNA干涉载体,通过根癌农杆菌介导转入水稻品种日本晴并获得阳性植株.半定量RT-PCR分析达到过量表达和干涉日的.在盐胁迫条件下,TO代过表达转基因植株表现出一定程度的抗胁迫能力,RNA干涉转基因植株的生长则受到抑制.图7表3参20     

青稞B-hordein基因表达载体构建及对小麦的遗传转化

利用从具有特殊B-hordein亚基组成的青藏高原青稞材料中克隆的B-hordein编码基因(SL60)和小麦高分子量谷蛋白亚基胚乳特异表达启动子PGlu1Dx构建了真核表达载体pCB2007-SL60.通过农杆菌介导对普通小麦进行遗传转化,共获得227株再生植株,经PCR鉴定和转化片段测序验证,最终获得5株阳性植株.研究为进一步分析B-hordein基因在小麦背景中的遗传和表达,以及对小麦加工特性的影响奠定了基础.图5表2参21     

无指盘臭蛙皮肤抗菌肽Odorgrin A真核表达载体的构建与转化

根据无指盘臭蛙(Odorrana grahami)皮肤抗菌肽Odorgrin A的氨基酸序列,合成了以酵母偏爱密码子编码的Odorgrin A基因片段.目的片段从合成质粒上用XhoΙ和EcoRΙ双酶切下后,与经同样限制酶酶切的pPIC9K载体连接而成表达载体pPIC9K-Odo A.PCR扩增、酶切及测序检测的结果表明表达载体构建成功.线性化的pPIC9K-OdoA经电击法转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115宿主菌,营养缺陷型筛选、遗传霉素抗性筛选、PCR扩增和测序检测的结果表明,表达载体pPIC9K-Odo A成功地转化并整合入酵母基因组.用甲醇对具遗传霉素G418高抗性的Odorgrin A重组酵母菌进行诱导表达,取酵母发酵液上清经SDS-PAGE电泳检测,结果初步表明,整合进酵母基因组的抗菌肽Odorgrin A基因已获得分泌表达,表达产物相对分子质量为3×103～4×103,与理论值相近.图10参17