基于木质素生物降解的堆肥化接种剂开发

选取由农林废物堆肥中筛选出的木质素降解优势土著微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、黑曲霉(Aspergillus niger)、简青霉(Penicillium simplicissim)、栗褐链霉菌(Streptomyces badius),依据PLFA-PLS定量分析所得堆肥化2次发酵期有效的木质素降解微生物群落组成比例混合接种至稻草基质发酵瓶中,做1组L9(34)正交试验以优化混合比例,期望开发1种基于木质素降解的高效堆肥化接种剂.试验结果表明:混合菌剂具有较强的木质素降解能力,其对木质素的降解是木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和半纤维素酶共同作用的结果;当按照个数比细菌∶放线菌∶真菌为85∶5∶ 10,枯草芽孢杆菌∶铜绿假单孢菌为55∶25,黑曲霉∶简青霉为2∶1配比时,木质素、纤维素、半纤维素降解率最高,分别达到22.13%,48.97%和55.93%;在不灭菌前提下,按此配比接入菌剂,其木质素、纤维素、半纤维素降解率分别比不接菌剂发酵稻草提高19.16,38.25和46.30百分点.     

木质素降解真菌的筛选及产酶特性

通过定性、定量系列实验从土壤中筛选到5株有木质素降解能力的低等真菌，经鉴定属于青霉属、镰刀霉属、曲霉属和木霉属，其中青霉属和镰刀霉属是土壤中木质素转化的主要作用者．降解能力最强的简青霉Penicillium simflitcissimum H5培养13d可降解Kraft木质素40．26％，产酶研究发现，该菌分泌胞外木质素过氧化物酶和漆酶，其中前者主要在培养前期产生，后者在整个培养过程中均有较好的活性．图4表1参14.     

厌氧纤维素降解产氢复合菌系L-3研究

从厌氧发酵污泥中筛选到一组高效、传代稳定的厌氧纤维素降解复合菌系L-3.该复合菌系的内切葡聚糖酶活(Cx)、滤纸酶活(FPA)、外切葡聚糖酶活(C1)、β-葡聚糖苷酶活(β-glucodase)分别为0.216、0.101、0.132、0.002U/mL;该复合菌系可使滤纸在42h内溃烂,并能在降解纤维素的同时产生氢气,气体中氢气含量最高可达70.2%,d13时滤纸失重率为70.6%.DGGE结果表明,该复合菌系主要由14种菌组成.在所选实验条件内,该复合菌系产纤维素降解酶的最适条件为:最佳碳源为滤纸,最佳氮源为硫酸铵,温度36℃,pH6.5～7.0,接种量5%.     

病死猪堆肥高效降解复合菌系的构建及应用效果

为了缩短堆肥时间、提高堆肥产品质量,从病死猪好氧堆肥样品中筛选能高效降解蛋白质和脂肪的安全菌株,经拮抗验证后构建出病死猪堆肥高效降解复合菌系并进行现场堆肥试验.结果显示通过分离纯化共获得36株具有尸体降解能力的安全菌株,经酶活性测定复筛出10株具有较高蛋白酶及脂肪酶活性的菌株,对其进行菌种鉴定及菌株间拮抗研究后,混合构建为5组复合菌系,分别为A、B、C、D和E.通过比较复合菌系的蛋白酶及脂肪酶活性大小,进一步选择优选复合菌系E进行现场堆肥试验,结果表明堆肥期间对照组和接菌各组(2%和4%)最高温度分别达到约56.3、60.8和61.2℃;低剂量和高剂量接菌组堆肥温度达到55.0℃以上的高温天数均持续约7 d,显著高于对照组的3 d(P 0.01);堆肥结束时,对照组和接菌各组(2%和4%)降解率分别达到78.7%、97.7%和98.0%.本研究构建的复合菌系E可有效提高堆肥温度并延长高温维持时间,加速病死猪的降解.(图5表2参30)     

一株槭射脉革菌MY51的分离鉴定及对染料的脱色能力

通过对兔眼蓝莓叶片组织中分离得到的内生真菌MY51进行鉴定和产木质素降解酶活性检测,探讨该菌株对染料的脱色能力.通过形态学和分子生物学分类法对菌株MY51进行鉴定;对菌株MY51所产3种木质素降解酶酶活曲线进行测定;利用菌株MY51对固体条件下8种染料进行脱色能力的检测,筛选出较易脱色的染料后,以脱色效果较好的染料模拟污水染料,研究菌株MY51在静态条件下对不同浓度固体染料的脱色能力.结果表明,菌株MY51为白腐真菌——槭射脉革菌(Phlebia acerina),该菌株可以产木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶等木质素降解酶;且木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶活性均在培养第8天达到最大值,分别为11.05、1.21 U/L;漆酶活性在第10天达到最大值18.52U/L;菌株MY51对不同的染料均有脱色效果,对活性红和活性黑的脱色效果最显著;但染料浓度较高时会对菌株MY51的脱色产生一定抑制作用,脱色15 d后,MY51对质量浓度为10、50、100、250和500 mg/L活性红脱色率分别为98.2%、94.5%、87.8%、88.3%和85.6%;对质量浓度为10、50、100、250和500mg/L的活性黑脱色率分别为98%、93%、83.3%、74.5%和65.5%.本研究表明菌株MY51对活性染料具有较好脱色能力,在染料废水处理领域具有一定的应用前景.(图10参31)     

一株能产生聚乙烯醇降解酶的委内瑞拉链霉菌

以聚乙烯醇(PVA)为唯一碳源,从土壤中筛选到1株能产生胞外PVA降解酶的放线菌GY1.根据扩增出的该菌株的16SrDNA全序列在GenBank中的比较结果,结合生理生化实验、细胞化学成分及菌落形态分析,确定该菌为委内瑞拉链霉菌(Stretopmycesvenezuelae).GY1菌株以PVA为唯一碳源时,产生的PVA降解酶活性达到120UL-1,是以葡萄糖或可溶性淀粉为唯一碳源时的10倍.当在PVA培养基中添加1gL-1至3gL-1的葡萄糖时,该菌株细胞量和PVA降解酶总酶活随着葡萄糖添加量的增加而增加,最大细胞量是未添加葡萄糖时的2.4倍,最高总酶活是未添加葡萄糖时的2.6倍,而单位质量细胞产生PVA降解酶的能力提高不大.但当添加的葡萄糖浓度从3gL-1增至10gL-1时,总酶活随着细胞量的增加出现下降趋势,同时单位质量细胞产生PVA降解酶的能力也大大降低.在相同PVA聚合度下,高醇解度PVA比低醇解度PVA更有利于GY1菌株的生长及产生PVA降解酶.图5表1参16     

嗜碱细菌降解木质素的复合碳源共代谢研究Ⅱ—营养条件调控机制的研究

文章研究了在蔗糖（第一碳源）＋麦草木质素（第二碳源）的复合碳源组合方式培养条件下,嗜碱木质素降解菌降解木质素的降解率及营养条件调控机制对其的影响。结果表明,蔗糖初始浓度为1g/L,添加0．3％的T－80和0.5mmol/L的ABTS并静置培养对菌株的产酶及降解能力有较大的促进作用。     

嗜碱细菌降解木质素的复合碳源共代谢研究Ⅰ——复合碳源组合方式及氮源的选择

研究在碱性液体培养条件 (pH =1 0 .5)下 ,不同碳源组合方式对嗜碱木质素降解菌产酶及降解麦草木质素的降解率的影响。研究结果表明 ,在蔗糖 (第一碳源 ) +麦草木质素 (第二碳源 )的组合方式下 ,并将硝酸铵作为氮源且碳氮比为 1 :1 .2时 ,该菌株的产酶及降解能力效果理想。     

高效纤维素降解菌分离筛选、复合菌系构建及秸秆降解效果分析

从川西高原贡嘎山区杜鹃林下土壤中分离纤维素降解菌,构建具有高效降解纤维素能力的复合菌系,并对秸秆降解效果进行分析,为农业废弃物的循环利用提供菌种资源和理论依据.样品及经风干、高温等预处理后,采用平板涂布法进行分离,共获得79株菌株;通过刚果红实验对分离获得的菌株进行初步筛选,运用DNS法测定各菌株的羧甲基纤维素酶活(Carboxymethyl cellulase,CMCase),复筛得到15株具有CMCase活能力的菌株.经滤纸条崩解实验、秸秆崩解实验及降解率测定,最终确定了各菌株的纤维素降解能力,进一步经拮抗实验,选取相互无拮抗的菌株构建5个复合菌系:A(112、146、156、171),B(145、147、150、153),C(110、116、174),D(147、154、171),E(145、146、150、152、153).复合菌系的滤纸酶活(Fpase)与秸秆降解率测定结果显示,组合C对秸秆的降解率较单菌株116提高了50.71%,组合D对秸秆的降解率较单菌株154提高了41.54%.经形态学和分子生物学鉴定,纤维素降解能力比较好的两个组合中的菌株分别被鉴定为类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)以及链霉菌属(Streptomyces sp.).本研究表明,复合菌系纤维素降解能力优于单一菌株,C、D两组复合菌系表现出较高的纤维素降解能力,具有进一步开发的价值.     

一株聚乙烯降解菌的筛选及其降解特性研究

为解决聚乙烯塑料在自然环境中难降解的问题,从土壤中分离出一株降解菌用于聚乙烯塑料生物降解研究。经筛选纯化,对该菌进行生理生化实验、16Sr DNA序列分析和系统发育进化树构建;将菌株接种于以不同相对分子质量聚乙烯粉末(相对分子质量分别为2000、5000、100 000)和膜片(相对分子质量400 000)为唯一碳源的基础液体培养基中,于30℃、180 rpm下培养;采用分光光度法每隔24 h测定菌体生长浓度、总蛋白含量、还原糖含量以及p H值;培养14 d,采用ABTS法和愈创木酚法测定漆酶和锰过氧化物酶酶活力;培养60 d,称量聚乙烯残留物质量,于扫描电子显微镜下观察膜片表观,对膜片力学性能变化进行测定。鉴定结果表明,该菌为放线菌属的东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis);菌生长浓度随聚乙烯相对分子质量的增大而减小;胞外蛋白质量浓度为(27.625±0.400)~(0.958±0.180)μg·m L~(-1);还原糖质量浓度为(15.664±1.764)~(2.660±0.000)μg·m L~(-1);p H值显著下降;漆酶和锰过氧化物酶酶活力酶活力分别为3 500~3 000 U·L~(-1)和2 600~2 000 U·L~(-1);聚乙烯失重率为(35.81%±0.39%)~(5.57%±0.22%);电镜观察发现膜片表面出现大量降解孔洞和大面积菌体附着;膜片力学性能显著下降;亲水性增大,表面能增大。证明东方拟无枝酸菌能够直接作用于普通聚乙烯塑料表面,是一株高效的降解菌株。推测该菌通过分泌胞外酶氧化聚乙烯长烃链,降低聚乙烯表面能,且在降解过程中产生酸性物质,长烃链最终转化成小分子物质;在菌株降解聚乙烯中起直接作用的酶为漆酶和锰过氧化物酶。     

白腐真菌降解五氯酚的初步研究

研究了白腐真菌黄孢原毛平革菌在不同营养条件下对五氯酚的降解.采用土豆葡萄糖液体培养基,接种后第2天投加PCP,在胞外木质素降解酶活性极低的真菌反应体系中,五氯酚能够有效降解,4d内10mg·1-1五氯酚降解率达到98%;采用高氮培养基,接种后第6天投加五氯酚,在胞外木质素酶含量极低的真菌反应体系和不含胞外酶的菌丝体反应体系中,五氯酚均能有效降解,1d内降解率分别达到56%和22%;采用低氮培养基,接种后第6天投加五氯酚,在胞外木质素酶含量较高的真菌反应体系、胞外酶液反应体系和不含胞外酶的菌丝体反应体系中,五氯酚均能有效降解,1d内降解率分别达到86%,17%和46%.结果表明,黄孢原毛平革菌在非木质素降解条件下,依赖胞内酶能有效地降解PCP;在木质素降解条件下依赖胞外木质素降解酶和胞内酶降解五氯酚,降解效率高于非木质素降解条件.     

共生菌B1+B2聚乙烯醇降解酶活性优化研究

从PVA降解酶的角度对本实验室前期实验筛选到的共生菌B1 B2进行了研究.在考察共生菌的基本生长和酶活的关系以及PVA降解酶和氧化酶的关系后,研究了不同的营养条件对PVA降解酶活性的影响.通过对主要营养条件的单因素考察,设计正交实验,优化出影响PVA降解酶活性的最佳主要营养条件为酵母汁0.2gL-1、硝酸铵0.2gL-1、葡萄糖0.5gL-1.采用优化条件进行验证实验,PVA降解酶活性(1.61UmL-1)高于正交实验中的最高酶活(1.56UmL-1),研究结果对发酵生产PVA降解酶和提高该菌在PVA废水处理中的降解性能有一定的价值.图5表3参11     

一株选择性降解木质素菌的筛选及其对玉米秸秆的降解

以玉米秸秆为基质,对15株白腐真菌进行了初步筛选,从中获得一株选择性系数较高的菌株Y10,经ITS-5.8SrDNA序列分析,初步鉴定为Cerrena sp.,并研究了该菌在30 d培养期内降解玉米秸秆中木质纤维素的情况.结果表明,菌株Y10对玉米秸秆中木质素和半纤维素的降解速率明显高于纤维素;在30 d的培养过程中,该菌对玉米秸秆降解的选择性系数都大于1,d 15选择性系数最高为3.88.紫外光谱和红外光谱分析结果表明,经菌株Y10降解后玉米秸秆的化学成分发生了变化,且对木质素的降解程度要大于对纤维素的降解程度.图4表3参17     

黄曲霉A5p1脱色糖蜜酒精废水机理初探

研究自行筛选的一株黄曲霉(Aspergillus flavus)A5p1(保藏号CGMCC.4292)对糖蜜酒精废水(MSW)的脱色机理.在外加蔗糖情况下菌株A5p1对MSW具有较好的脱色效果,脱色率由14%增高至58%;脱色进程与细胞生长基本同步.从培养液中检测出3种木质素过氧化物酶——漆酶(Lac)及两种胞外过氧化物酶即锰过氧化物酶(MnP)和不依赖锰的过氧化物酶(MiP)的酶活,但是水平不高,认为此3种酶不是主要的脱色机制.发现由各种代谢过程产生的总H2O2生成速率与脱色率基本同步,同时在第4天达到最大值,随后下降;还原糖总消耗也在初期阶段较快.外加蔗糖后总H2O2生成速率增加10倍,达到0.0027 mmol·min-1·mL-1.认为体系中脱色机制可能与产H2O2的酶相关.紫外可见光谱分析和凝胶色谱分析表明脱色过程中有大分子物质降解.综上所述初步认为,黄曲霉A5p1脱色糖蜜酒精废水是一个受产H2O2酶影响、复杂的生物降解过程.     

蚁巢伞对木质纤维素的降解作用

白蚁-细菌-真菌共生系统对自然界生物质降解具有重要作用,研究蚁巢伞(Termitomyces)对木质纤维素的降解能力有助于揭示其共生关系,为蚁巢伞应用于生物质能源开发提供理论依据.利用黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)菌圃(OFC)及其固体培养蚁巢伞(TA)、液体培养蚁巢伞(TL)分别对未经预处理和经密褐褶孔菌(Gloeophyllum trabeum)预处理材料进行降解试验,探究蚁巢伞的木质纤维素降解能力.结果显示,未经预处理时,处理90 d后,OFC对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为15.22%、29.34%和6.01%;处理120 d后,TA对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为20.98%、31.89%和11.68%,TL对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为14.39%、24.62%和5.05%.经过预处理时,处理120d后,OFC对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为37.09%、42.20%和24.95%,TA对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为34.77%、38.29%和29.74%,TL对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为30.57%、30.47%和24.36%. 3种状态蚁巢伞对经预处理材料木质纤维素降解率均高于未经预处理材料.本研究表明,蚁巢伞对木质纤维素具有一定的降解能力,尤其是蚁巢伞对木质素的降解说明其可以打破木质素屏障,证实了利用蚁巢伞的木质纤维素降解能力来实现生物质能源化的潜力,结果可为蚁巢伞的人工栽培提供数据和参考.(图4表2参39)     

三相鼓泡塔生物反应器培养黄孢原毛平革菌合成木素过氧化物酶系

利用三相鼓泡塔反应器固定化培养黄孢原毛平革菌，可以高效地合成木素过氧化物酶系，固定化载体为聚氨酯泡沫塑料．实验表明，合成木素过氧化物酶和锰过氧化物酶的最佳通气量均是1．0vvm。在此通气量下，最大木素过氧化物酶的酶活达367U/L，最大锰过氧化物酶的酶活达4．72U／mL。在使用相同的培养基和固定化载体单位体积用量条件下，与摇瓶培养相比，酶活分别增大1倍和1．2倍．一定条件下，在三相鼓泡塔中可以进行重复间歇培养生产木素过氧化物酶，连续进行了5批培养，每批最大木素过氧化物酶的活力均在250U／L以上，最高酶活出现在第二批为480U／L，总培养时间达22d．图9参15     

尖孢镰刀菌致病相关因子及其分子生物学研究进展

由致病性尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)侵染引起的植物枯萎病是一种世界性的土传真菌病害,对农业生产造成了巨大经济损失.研究表明,尖孢镰刀菌的致病与多种致病因子相关,包括信号传导系统(环腺苷酸单磷酸-蛋白激酶A和促分裂素原活化蛋白激酶信号途径)、细胞壁降解酶(木聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、细胞毒素、纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶等)、克服植物防御响应系统(降解抗真菌化合物和破坏植物细胞壁的化学修饰)以及其它(细胞毒素和过氧化物酶)等.此外对今后的研究工作提出展望.参26     

磺胺类抗生素复合污染降解菌的筛选及其降毒作用

磺胺类抗生素是环境中检测出率较高的一类污染物.微生物降解是一种相对安全、高效且成本低的污染物去除技术,而关于磺胺类抗生素复合污染降解菌对该类抗生素的去除及其降毒能力方面的研究较少.因此,以3种磺胺类抗生素:磺胺吡啶(SP)、磺胺氯哒嗪(SCP)和磺胺二甲嘧啶(SM2)为碳源,从土壤中筛选3种磺胺类抗生素复合污染的降解菌,应用时间毒性微板分析法,测定3种抗生素及其复合污染物在降解前、后对指示生物蛋白核小球藻的毒性效应,并分析降解菌对3种抗生素及其复合物污染物的降毒能力.结果表明,以SP、SCP和SM2为碳源筛选出2株(S1和S2)降解菌,其中,S1菌株对3种抗生素的降解能力优于S2菌株,并初步鉴定S1降解菌为马氏棒杆菌属;S1降解菌的生长状况和降解能力最佳条件:3种抗生素的混合浓度为1 500 mg·L-1,pH=7.0,温度30℃,转速为150 r·min-1以及接种量为2.0％;S1菌株降解后的抗生素及其复合污染物对蛋白核小球藻的毒性明显低于降解前的毒性,降毒率在99％以上;S1降解菌对3种磺胺类抗生素的降解能力为SM2＞SP＞SCP.     

微生物菌剂堆肥中草药渣中试研究北大核心CSCD

木质纤维素降解是中草药渣堆肥的主要难点.在前期小试的基础上,接种纤维素降解菌剂,将1 t新鲜药渣直接进行好氧堆肥.腐熟度指标T值和种子发芽指数(GI)显示,堆肥19 d左右就已经腐熟.堆肥过程中接种组(JZ)和对照组(CK)的纤维素平均降解速率分别为0.73 kg/d和0.64 kg/d,JZ比CK纤维素降解总量提高了13.39%,木质素降解量提高118.18%.第30天时,堆肥的含水率、p H、总养分、重金属等指标都达到有机肥料标准(NY 525-2012).接种菌剂提高了堆肥温度,加速了水分散失,促进了纤维素和木质的转化,有利于堆肥腐熟和提高肥料品质.因此,在中试规模上堆肥中草药渣生产有机肥是可行的.     

不同配方培养料生产双孢蘑菇过程中主要木质纤维素降解酶及物料组分的变化

为探讨双孢蘑菇生产过程木质纤维素的利用情况,以麦草秸秆、玉米秸秆和杂草秸秆为主料的3种不同配方的培养料为研究材料,分别测定各配方培养料不同时期主要胞外木质纤维素降解酶活性和木质纤维素组分(纤维素、半纤维素和木质素)的相对含量,并统计各配方产量.结果显示,麦草配方(FWS)的纤维素酶总活性和木聚糖酶活性不断升高,出菇期达到稳定;玉米秸秆配方和杂草配方堆肥期的纤维素酶总活性保持在1 U/g左右,发菌期大幅升高,出菇期先稳定后下降,木聚糖酶活性始终保持在7.97-23.85 U/g之间;3个配方的漆酶活性在堆肥期未检测到,发菌期升至最高,出菇期快速降低.3个配方堆肥期纤维素和半纤维素的相对含量明显下降,木质素相对含量则几乎不变.发菌及出菇期木质素与半纤维素的相对含量较纤维素的下降明显.3个配方双孢蘑菇的产量关系为麦草配方(30.00 kg/m~2)玉米秸秆配方(17.21 kg/m~2)杂草配方(16.67 kg/m~2).本研究表明堆肥期主要为堆肥微生物及物理化学作用降解纤维素和半纤维素,发菌期则主要是双孢蘑菇菌丝利用木质素;从播种至三潮菇清床,双孢蘑菇菌丝主要利用木质素和半纤维素;本研究中麦草配方是栽培双孢蘑菇的最佳培养料,而玉米秸秆配方和杂草配方有待进一步优化.