拟南芥SHI基因在烟草中的表达和矮化、延迟开花的烟草植株的获得

利用聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥基因组DNA中克隆了拟南芥SHOTINTERNODS(SHI)基因,并进行了序列测定.以载体pBI121为基本骨架构建了SHI的植物表达载体,并导入根癌农杆菌EHA105.通过农杆菌介导的叶盘法将拟南芥SHI基因转入烟草.PCR和RT-PCR检测证明,拟南芥SHI基因已整合到烟草基因组中并得以表达,获得了矮化、延迟开花的烟草植株.图5参12     

异源表达胡杨PeCPD基因提高烟草对盐、高氮和干旱胁迫的抗性

油菜素类固醇(Brassinosteroids,BRs)在调节植物生长发育和提高植物对非生物胁迫的抗性中起着重要作用,CPD(Constitutive Photomorphogenesis and Dwarfism)基因编码一种甾醇类23a羟化酶,在BR的生物合成中发挥着重要作用.本研究克隆胡杨Pe CPD基因的c DNA序列,并利用农杆菌介导法,将Pe CPD基因植物过表达载体p BI121-35S::Pe CPD转化野生型烟草,筛选得到Pe CPD基因过表达的转基因烟草植株,并利用Na Cl、高氮和甘露醇分别对转基因和野生型烟草进行胁迫处理,检测转基因烟草的耐受性和相关的生理生化指标.结果表明:(1)在正常条件下,转基因烟草的鲜重是野生型烟草的1.47倍;(2)在Na Cl、高氮以及甘露醇的胁迫处理下,转基因烟草植株的根长、叶片叶绿素和类胡萝卜素的含量均显著高于野生型植株,抗氧化酶SOD和POD活性以及渗透调节物质脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的含量也同样表现为转基因烟草显著高于野生型,而野生型植株的丙二醛(MDA)含量显著高于转基因植株.因此在烟草中异源过表达胡杨Pe CPD基因不但能够增加烟草的生物量,而且能够提高烟草对盐、高氮和干旱胁迫的抵抗能力.     

高赖氨酸蛋白基因在转基因生菜中的表达和遗传转化

以生菜(LactucasativaL.)为受体材料,将含有高赖氨酸蛋白基因的植物表达载体pLBI用农杆菌介导法进行遗传转化,获得47株转基因生菜植株.PCR和Southern-blotting检测证实目的片段在T0代的整合,RT-PCR检测表明目的基因的转录.T0代植株赖氨酸(Lys)含量的测定分析表明,赖氨酸有不同程度的提高,比对照提高最高的可达9.46%.T1代植株PCR检测证明,目的基因能够遗传.图5表1参25     

干扰烟草GA 20-氧化酶siRNA植物表达载体的构建及矮化烟草的产生

根据烟草(Nicotiana tabacum)GA 20-氧化酶基因序列,设计2对分别含有特定酶切位点的特异引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增目的基因(约250 bp)片段.将正、反向目的片段分别插入中间载体的内含子两侧.再经BamH I和Sac I双酶切回收约700 bp的目的片段,插入到双元载体质粒p2355中,成功构建了含GA 20-氧化酶基因片段的反向重复序列植物表达载体p23700,其转录产物能形成发夹RNA(hpRNA),产生小分子干扰RNA,干扰目的基因的表达.将p23700质粒导入根癌农杆菌EHA105中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得表型矮化的转基因烟草.图4参14     

异源表达胡杨PeBAK1;1基因增强烟草对Pst DC3000的抗性

BAK1(BRI1-associated receptor kinase 1)是一个富亮氨酸重复序列(LRR)的膜受体蛋白激酶,除参与植物油菜素内酯信号的转导外,还可以结合其他的LRR-RLKs蛋白来启动植物的先天免疫反应.为明确胡杨Pe BAK1;1基因在烟草中抗Pst DC3000(丁香假单胞杆菌种番茄致病变种)的功能及其在植物抗病中的调控方式,克隆胡杨Pe BAK1;1基因c DNA序列构建Pe BAK1;1基因的过量表达载体p BI121-35S::Pe BAK1;1,并利用农杆菌介导法将其转化野生型烟草,筛选获得Pe BAK1;1基因过表达的转基因烟草植株.生物信息学分析结果表明胡杨Pe BAK1;1蛋白具有植物SERK家族的全部结构特征,系统进化树分析表明胡杨Pe BAK1;1与毛果杨Pt BAK1的序列同源性最高;组织表达分析表明Pe BAK1;1基因主要在根和叶中表达;Pst DC3000侵染试验结果显示,野生型烟草植株接种Pst DC3000后表现出明显的感病症状,而Pe BAK1;1基因过表达的转基因烟草植株表现出明显的抗病症状;Real-time PCR及quantitative real-time-PCR分析结果表明,与野生型相比,转基因烟草中抗病防御相关基因PR1、PR3、PR4和PR5的表达量显著升高,且参与植物生长发育与先天防卫反应的基因BIR1和BON1的表达量也明显升高.上述结果表明,异源表达胡杨Pe BAK1;1基因在烟草抗Pst DC3000过程中起正调控作用,能够增强植物的抗病能力.     

农杆菌介导将高赖氨酸蛋白基因导入谷秆两用水稻

采用农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因导入到谷秆两用水稻中，GUS组织化学染色、PCR扩增、Southem blot分析表明，该基因已经整合到水稻基因组中，测定9株转基因水稻叶片赖氨酸含量，大部分植株有明显的提高，最高幅度达到了22．71％，图6参15     

壳寡糖诱导转反义mapk基因烟草的TMV抗性和PAL活性研究

壳寡糖具有诱导植物对病原物防御反应的作用,而PAL活性的升高通常被认为是发生抗性反应的标志之一.本文以mapk基因受到反义抑制的转基因枯斑三生烟草为试材,比较了壳寡糖诱导后转基因型和野生型烟草的PAL活性变化及对TMV抗性的变化.由实验结果初步推测,在壳寡糖诱导的植物抗性信号通路中,mapk可能为PAL的一个重要的上游基因,同时mapk在烟草抗TMV信号转导中亦为一个重要组分.图4表2参13     

酵母双杂交筛选OIPK相互作用蛋白

前期研究发现烟草中一个壳寡糖诱导的Ser/Thr蛋白激酶(Oligochitosan induced protein kinase,OIPK)在壳寡糖诱导的烟草抗性反应中起着重要作用.目前在烟草中发现OIPK基因的两个选择性剪接体:OIPKL和OIPKS,其中OIPKL是3个选择性剪接体中序列最长的.为进一步研究OIPK在壳寡糖诱导植物抗性中起的作用,本研究采用酵母双杂交方法,以pGBKT7-OIPKL为诱饵质粒,筛选构建在pACT2载体上的烟草cDNA文库,寻找OIPKL的相互作用蛋白.结果表明OIPKL蛋白在酵母中可以和烟草的S-腺苷甲硫氨酸合成酶、泛素激活酶E1、丙酮酸激酶、过氧化物酶相互作用.实验结果为研究壳寡糖诱导抗性机理提供了一定依据.图3参26     

Ri质粒转化烟草的影响因素及豌豆凝集素基因在烟草发根中的表达

对Ri质粒转化烟草的影响因素进行研究,以期获得较为理想的实验系统,用发根农杆菌介导,将豌豆凝集素基因导入烟草,获得转基因的烟草发根,GUS组织化学染色,蛋白免疫原位杂交证明,gus报告基因和豌豆凝集素基因已在转基因烟草发根中得到了转译表达,本结构将为瘤菌能否扩大宿主范围,为研究烟草与豌豆根瘤菌相互作用,结瘤固氮的可能性奠定基础。     

过量表达水稻OsP5CS1和OsP5CS2基因提高烟草脯氨酸的生物合成及其非生物胁迫抗性(英文)

为了解水稻OsP5CS基因在非生物胁迫中的生物学功能及其生理生化作用,将P5CS基因的两个水稻同源基因OsP5CS1和OsP5CS2同时构建到植物表达载体pHB上,并通过农杆菌介导的遗传转化法转入烟草,经过鉴定转基因植株,成功获得9个独立的转基因阳性植株.选取野生型和其中的3个转基因植株后代,分别测定它们在不同的胁迫条件下幼苗的根长、鲜重以及脯氨酸、过氧化氢和丙二醛的含量.结果显示:在200 mmol/L NaCl、300 mmol/L甘露醇(Mannitol)、300μmol/L CuSO4胁迫条件下转基因植株的平均根长、平均鲜重、平均脯氨酸、平均过氧化氢含量和平均丙二醛的含量分别为野生型的1.3-2.3、1.9-3.9、1.8-3.2、51%-61%和62%-76%.因此在烟草中过表达OsP5CS基因,可以显著增加脯氨酸含量,降低烟草在非生物胁迫条件下的氧化损伤.图6参31     

Heterologous overexpression of Populus euphratica BAK1;1 gene enhanced resistance to Pst DC3000 in tobacco北大核心CSCD

BRI1-ASSOCIATED RECEPTORKINASE1(BAK1), a leucine-rich repeat (LRR) receptor protein kinase, plays a significant role in brassinosteroid (BR) signaling. Furthermore, it combines with other LRR-RLKs protein to initiate immune response in plants. The objective of this study was to (1) investigate the function of the Populus euphratica BAK1;1 gene in the resistance of transgenic tobacco to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) and (2) discuss the regulation pathway of PeBAK1;1 involved in the resistance to plant pathogen. We cloned the cDNA sequence of the P. euphratica PeBAK1;1 gene, constructed the pBI121-35S::PeBAK1;1 over-expression vector, and then transformed it into wild-type tobacco by Agrobacterium-mediated transformation to obtain PeBA K 1;1-overexpressing transgenic tobacco plants. The bioinformatic analysis showed that the PeBAK1;1 protein contained all the structural features of the plant SERK family. The phylogenetic tree showed that PeBAK1;1 has the highest sequence homology with PtBAK1. The gene expression profile results indicated that the expression of PeBAK1;1 in the root was higher than that in the leaf and stem. The wild-type tobacco plants showed an obvious susceptibility to Pst DC3000, whereas the transgenic plants exhibited enhanced resistance to Pst DC3000. Compared with that of the wild-type (WT), the real-time PCR and quantitative real-time PCR analysis revealed that the expression of pathogenesis-related genes (including PR1, PR3, PR4, and PR5), BAK1-interacting receptor kinase 1 gene, and BONZAI1 gene was upregulated in 35S::PeBAK1;1 transgenic tobacco plants. In conclusion, the PeBAK1;1 gene plays a positive regulatory role in 35S::PeBAK1;1 transgenic tobacco against Pst DC3000, which can enhance the resistance of plants to pathogen. © 2018 Science Press. All rights reserved.     

拟南芥VTE1过量表达可以增加维生素E含量和提高烟草植株耐盐行

维生素E在动物细胞内具有抗氧化等重要作用，但在植物体内的功能却鲜为人知．本实验利用CaMV 35S启动子与来源于拟南芥的编码生育酚环化酶（TC）的cDNA（VTE1）构建的嵌合表达载体，以根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草W38．实验结果表明，具有卡那霉素抗性的再生植株经RT-PCR检测，得到了与阳性对照一致的495bp的目标片段；转基因植株的VE含量比对照植株高2倍左右，个别株系高达11倍．实验还发现，在耐盐性实验中转基因植株对盐的抗性明显高于野生型烟草；同时，在不同盐浓度（150、250mmoL／L）胁迫下转基因植株VE含量比未转化植株增加了1．3～1．8倍，首次证明VTE1与植物耐盐性之间的关系．     

拟南芥VTE1过量表达可以增加维生素E含量和提高烟草植株耐盐性

维生素E在动物细胞内具有抗氧化等重要作用,但在植物体内的功能却鲜为人知.本实验利用CaMV35S启动子与来源于拟南芥的编码生育酚环化酶(TC)的cDNA(VTE1)构建的嵌合表达载体,以根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草W38.实验结果表明,具有卡那霉素抗性的再生植株经RT-PCR检测,得到了与阳性对照一致的495bp的目标片段;转基因植株的VE含量比对照植株高2倍左右,个别株系高达11倍.实验还发现,在耐盐性实验中转基因植株对盐的抗性明显高于野生型烟草;同时,在不同盐浓度(150、250mmol/L)胁迫下转基因植株VE含量比未转化植株增加了1.3~1.8倍,首次证明VTE1与植物耐盐性之间的关系.图7参30     

番茄ARF4基因果实特异RNAi载体的构建及遗传转化

构建ARF4基因果实特异表达的RNA干涉载体,对转基因番茄果实进行初步分析,可为采用基因工程方法改良番茄果实品质做出新尝试.利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增SlARF4基因全长,将番茄ARF4基因正反向重复序列片段导入到植物表达载体pBI121上,启动子是番茄果实特异表达的TFM7.将构建的ARF4基因果实特异RNA干涉载体pBI121-TFM7-A4Ri通过根癌农杆菌介导转入到野生型番茄中,进而对转化获得的植株进行了阳性鉴定.分别以转基因番茄和野生型番茄为材料,分析ARF4在果实中的表达水平,测定绿熟期果实叶绿素含量、果实的单果重量和果皮厚度.酶切证实pBI121-TFM7-A4Ri果实特异表达载体构建成功,而且,PCR检测也得到阳性转基因株.半定量RT-PCR分析显示,转基因番茄果实中ARF4的表达量明显低于野生型果实.转基因番茄果实的叶绿素含量、单果重量和果皮厚度都比野生型有提高.因此,ARF4果实特异表达的RNAi方法能够改良番茄果实品质.     

编码水稻胞外核苷酸双磷酸酶基因的表达特性

NTPDase(Nucleoside triphosphate-diphosphohydrolase,核苷酸双磷酸酶)在哺乳动物巾分布于细胞膜,可以水解细胞外ATP和其他核苷酸,从而调控胞外核苷酸代谢及信号应答.根据水稻NTPD基因序列设计引物,在不同胁迫条件样品中,通过PCR扩增水稻NTPD基因,结果表明水稻NTPD基因表达水平在盐胁迫样品中升高.为进一步分析水稻NTPD基因的功能,构建了该基因的过量表达、RNA干涉载体,通过根癌农杆菌介导转入水稻品种日本晴并获得阳性植株.半定量RT-PCR分析达到过量表达和干涉日的.在盐胁迫条件下,TO代过表达转基因植株表现出一定程度的抗胁迫能力,RNA干涉转基因植株的生长则受到抑制.图7表3参20