应用荧光原位杂交方法检测中国沿海塔玛/链状亚历山大藻复合种(亚洲温带基因型)

近年来,有害赤潮于中国沿海频繁发生,对沿海居民身体健康、水产养殖和自然生态形成了潜在的威胁.由于部分有毒赤潮藻在很低的密度下就有可能导致严重的危害,但传统的采样和分析方法无法对这类有毒赤潮进行有效的检测,因而急需发展准确、高效的检测新方法.根据对中国沿海分离的塔玛/链状亚历山大藻(亚洲温带基因型)核糖体大亚基DNA(LSU rDNA)序列信息的分析,设计了两条特异性的荧光标记探针,并建立了针对中国沿海塔玛/链状亚历山大藻复合种(亚洲温带基因型)的荧光原位杂交检测方法室内模拟实验显示两条探针都能够特异性地标记中国沿海塔玛/链状亚历山大藻(亚洲温带基因型),但标记效果有一定差异,探针SPEC-PROBE2标记效果远好于探针SPEC-PROBE1.经过标记的藻细胞可以通过荧光显微镜和流式细胞仪区分.中国沿海塔玛/链状亚历山大藻荧光原位杂交检测方法的建立将有助于提高海水样品中亚历山大藻监测的准确性和工作效率.     

应用荧光原位杂交方法检测亚历山大藻

采用PCR方法对三株亚历山大藻核糖体DNA 大亚基部分序列和ITS区序列进行了特异性扩增和序列测定.ITS区测序及BLAST比对结果显示,三株藻类分别为塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense),链状亚历山大藻(A. catenella)和微小亚历山大藻(A. minimum).在此基础上,针对中国沿海分布的有毒亚历山大藻,根据其核糖体DNA大亚基(LSU rDNA)序列信息,设计了特异性的荧光标记探针,建立了基于荧光原位杂交技术(FISH)上的有毒亚历山大藻检测方法.结果表明,探针Alexp1较理想地标记选定的目标藻--塔玛亚历山大藻(YA 藻株),经探针标记的藻细胞在荧光显微镜下可以明显区分于其他非目标藻.     

UV-B辐射增强对亚历山大藻和赤潮异弯藻种群竞争的影响

通过共培养的方法,研究了亚历山大藻和赤潮异弯藻种群竞争关系对UV-B辐射增强的响应变化．结果表明,不同的接种密度对亚历山大藻和赤潮异弯藻种群竞争有明显的影响．当亚历山大藻(A)和赤潮异弯藻(H)的接种比例为A：H=1：4时,赤潮异弯藻在与亚历山大藻的竞争中占优势;当接种比例为A：H=1：1和A：H=4：1时,亚历山大藻在竞争中占优势．UV—B辐射增强可改变亚历山大藻和赤潮异弯藻种群竞争的关系,使赤潮异弯藻的种群竞争能力降低,使亚历山大藻的种群竞争能力大大提高,从而导致亚历山大藻在处理Ⅱ(A：H=1：1)和处理Ⅲ(A：H=4：1)中的优势地位更加明显．     

3种海洋赤潮微藻蛋白质和核酸合成动态对芘胁迫的响应

应用同位素标志法,研究了赤潮异弯藻、亚历山大藻和中肋骨条藻核酸和蛋白质合成动态对芘的响应变化.结果表明:(1)芘处理对3种藻的96 h半抑制剂量分别为0.071、0.107和0.097 mg/L,3种海洋赤潮微藻对芘的敏感性依次是赤潮异弯藻、中肋骨条藻和亚历山大藻.(2)低浓度的芘处理对3种藻的生长与DNA的合成表现出刺激作用,高浓度则表现出抑制作用.(3)芘处理抑制3种藻的RNA和蛋白质的合成.随着芘浓度的增大,3种海洋赤潮微藻RNA和蛋白质的合成速度下降,其中赤潮异弯藻合成速度的下降幅度明显大中肋骨条藻和亚历山大藻,表明赤潮异弯藻RNA和蛋白质的合成对芘的敏感性高于中肋骨条藻和亚历山大藻.     

不同起始数量对赤潮异弯藻和东海原甲藻种间竞争的影响

通过共培养的方法,研究了不同起始数量对赤潮异弯藻和东海原甲藻之间种间竞争的影响.结果表明:不同的接种数量对赤潮异弯藻和东海原甲藻种群竞争关系有明显的影响.在3种不同的接种比例下,赤潮异弯藻在与东海原甲藻的生长竞争中始终占优势,对东海原甲藻的生长存在抑制作用,且随着起始数量的提高,其种群竞争生长的优势愈加明显,对东海原甲藻生长的抑制作用愈加显著.东海原甲藻仅在较高的起始数量(处理I,H:P=1:4)下,对赤潮异弯藻的生长才表现出一定的抑制作用,处理Ⅱ和处理Ⅲ(H:P=1:1和H:P=4:1)对赤潮异弯藻的生长均无影响.     

共培养体系中石莼和江蓠对赤潮异弯藻生长的影响

研究共培养体系中2种大型海藻石莼(Ulva pertusa)和江蓠(Gracilaria lemaneiformis)的鲜组织和培养液滤液对赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)生长的影响.结果发现:①石莼和江蓠均能明显影响赤潮异弯藻生长,鲜组织的作用更明显,能在短时间内完全灭杀共培养的赤潮异弯藻;石莼对微藻的影响强于江蓠的作用.②除菌作用和补充充足的碳酸盐不能消除或缓解石莼和江蓠对赤潮异弯藻生长的影响,说明细菌和碳限制不是导致大藻对微藻作用的原因.③对共培养体系中硝酸盐和磷酸盐的跟踪测定结果显示,营养盐限制不是造成石莼对赤潮异弯藻影响的原因,但却在江蓠的作用中起重要作用.当向江蓠体系中补充f/2营养盐后发现,充足的营养盐能够减轻但不能完全消除江蓠对赤潮异弯藻生长的影响.另一方面,石莼的起始浓度与其对赤潮异弯藻的生长影响之间存在明显的相关性,石莼的起始浓度越高,对赤潮异弯藻的影响越明显.④实验初步说明,石莼可能通过相生相克作用影响共培养体系中赤潮异弯藻的生长,而相生相克和营养竞争的共同作用是导致江蓠作用的根本原因.     

改性小麦秸秆去除赤潮异弯藻的实验研究

研究了改性小麦秸秆对赤潮异弯藻的去除作用和机制.结果表明,在与未改性秸秆相同用量(0.10 g/L)的情况下,在120 m in时,改性秸秆对赤潮异弯藻的去除率可以从10%左右提高到80%以上.为了探讨改性秸秆对赤潮异弯藻的去除机制,测定了核苷酸在260 nm时的吸光度,结果发现水体内核苷酸物质浓度增大,说明在此作用过程中,藻细胞膜结构遭到破坏,核苷酸物质由胞内释放.当改性秸秆用量为0.15 g/L时,释放核苷酸在260nm时吸光度与正常细胞的吸光度比值为1.17,此时改性秸秆对赤潮异弯藻造成的损害是不可逆的.实验发现,改性秸秆对赤潮异弯藻同时具有吸附作用和灭杀作用.当浓度较低时,改性秸秆通过吸附细胞体,或者与细胞膜结合,从而导致部分藻细胞的絮凝;而当浓度进一步增加时,改性秸秆可以破坏细胞膜的结构,导致大量膜内物质的释放,进而导致藻细胞的死亡.     

玉米叶对我国几种典型赤潮藻生长的影响研究

研究了玉米叶对塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、海洋卡盾藻(Chattonella marina)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)和球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)生长的影响,以期为筛选新的、无污染的、廉价高效的除藻剂提供思路,为不同的有害赤潮的治理提供参考.结果表明,玉米叶对塔玛亚历山大藻、海洋卡盾藻、赤潮异弯藻、东海原甲藻和球形棕囊藻生长的影响明显不同.玉米叶可显著抑制塔玛亚历山大藻、海洋卡盾藻和赤潮异弯藻的生长,但对东海原甲藻生长的影响不大,对球形棕囊藻的生长则有显著的促进作用.这些结果表明,玉米叶对赤潮藻生长的抑制作用存在一定的选择性,这种选择性与藻的种属与细胞结构并无明显的相关性.     

赤潮异弯藻对有机氮的利用能力

在实验室条件下,研究了赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)对不同溶解性有机氮(DON)的响应,以揭示赤潮异弯藻种群增殖和赤潮发生的环境背景。结果表明,赤潮异弯藻可以利用多种DON,不同N源下生长优劣程度分别为苏氨酸尿素丙氨酸谷氨酸 NO3-甘氨酸。在苏氨酸、尿素、丙氨酸、谷氨酸组的最大细胞数量和最大比生长率甚至明显高于无机营养盐组(NO3-),最大细胞数量为无机营养盐组的125%~253%,但赤潮异弯藻不能有效利用丝氨酸和尿酸两种N源。赤潮异弯藻不能耐受营养盐缺乏条件,在N或P缺乏以及N、P同时缺乏的条件下,无法生长。研究结果说明,赤潮异弯藻对DON具有较强的利用能力,可使之在激烈的种群竞争中占据优势,而近岸海域的富营养化及有机污染为其赤潮的发生提供了物质基础。     

烷基糖苷季铵盐选择性抑藻活性研究

以甲藻门的东海原甲藻、塔玛亚历山大藻、裸甲藻,黄藻门的赤潮异弯藻,硅藻门的中肋骨条藻等典型的赤潮生物以及绿藻门的青岛大扁藻和亚心形扁藻两种非赤潮生物为目标生物,探讨了烷基糖苷季铵盐(APG-131)类表面活性剂的抑藻活性。结果表明,该表面活性剂在较低的浓度范围内(0.5 mg/L),对东海原甲藻、塔玛亚历山大藻和赤潮异弯藻等赤潮生物的生长有明显的抑制作用。当该季铵盐的浓度增加至1.0 mg/L以上时,可完全抑制中肋骨条藻的生长,而在相同的浓度范围内,对裸甲藻和所选2种非赤潮生物生长影响不明显,表现出了抑藻作用的种属特异性。结合各海洋微藻的脂肪酸组成分析,证实了该表面活性剂选择性抑藻作用与不同海洋微藻的多不饱和脂肪酸的含量明显相关。     

厌氧氨氧化菌的富集培养与分子鉴定

采用传统培养方法与分子生物学方法相结合,进行了厌氧氨氧化菌的分离培养与分子鉴定.富集培养以2种不同反应器的厌氧氨氧化污泥作为分离源,以亚硝酸盐与铵盐为底物.经过2 a传代培养获得2个培养系,对亚硝酸盐及铵盐具有稳定的去除能力,氨氮去除率为85%左右.通过16S rRNA克隆文库方法对培养系中浮霉菌门微生物群落结构进行了多样性解析,结果表明2个培养系中的厌氧氨氧化菌是同一种微生物,代表序列比对结果与"Kuenenia stuttgartiensis"同源性为99%.采用"K.stuttgartiensis"的特异探针对培养系进行了荧光原位杂交分析(FISH),进一步证实"K.stuttgartiensis"是培养系中的优势厌氧氨氧化菌,占总菌群数的80%～90%.对反应器中"K.stuttgartiensis"的丰度变化进行了FISH跟踪检测,发现原始接种污泥中"K.stuttgartiensis"为主要厌氧氨氧化菌,经过2 a运行该菌在污泥中的丰度由11%提高到24%.     

Design and use of group-specific primers and probes for real-time quantitative PCR

Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) has gained popularity as a technique to detect and quantify a specific group of target microorganisms from various environmental samples including soil, water, sediments, and sludge. Although qPCR is a very useful technique for nucleic acid quantification, accurately quantifying the target microbial group strongly depends on the quality of the primer and probe used. Many aspects of conducting qPCR assays have become increasingly routine and automated; however, one of the most important aspects, designing and selecting primer and probe sets, is often a somewhat arcane process. In many cases, failed or non-specific amplification can be attributed to improperly designed primer-probe sets. This paper is intended to provide guidelines and general principles for designing group-specific primers and probes for qPCR assays. We demonstrate the effectiveness of these guidelines by reviewing the use of qPCR to study anaerobic processes and biologic nutrient removal processes. qPCR assays using group-specific primers and probes designed with this method, have been used to successfully quantify 16S ribosomal Ribonucleic Acid (16S rRNA) gene copy numbers from target methanogenic and ammonia-oxidizing bacteria in various laboratory- and full-scale biologic processes. Researchers with a good command of primer and probe design can use qPCR as a valuable tool to study biodiversity and to develop more efficient control strategies for biologic processes.     

Characterization of i(18p) in prenatal diagnosis by fluorescence in situ hybridization

A case is presented in which chorionic villus direct preparation and cultured chorionic villus cells revealed a 47,XX, + mar karyotype. The marker was a small metacentric chromosome and appeared to be i(18p)—isochromosome 18p. Follow-up studies in both amniotic fluid and fetal fibroblasts confirmed the karyotype. In order to characterize the marker, a panel of biotinylated DNA probes was used, including a whole chromosome 18 probe, chromosome 18-specific alpha satellite DNA, Yac clones, and a pan-telomeric probe. These studies show that the marker is a monocentric i(18p) in which about 80 per cent of chromosome 18 alpha satellite DNA has been lost.     

高有机质含量垃圾的含水量监测试验研究

为了研究时域反射技术(TDR)对高电导率、高有机质含量的填埋垃圾的适用性,设计并制作了探针表面镀环氧树脂基复合材料和套PVC管的TDR探头,测试并评估了各个探头测试介质含水量的电导率适用范围和感应区域范围,同时推荐了95%探针长度套PVC热缩管的探头作为最优选择.对所选探头进行标定后,安装在填埋自制新鲜垃圾和现场老垃圾的模型单元中,测试渗滤液入渗过程中和入渗后的含水量变化,结果表明:经表面处理后的TDR探头能够有效测试高有机质含量填埋垃圾的含水量,且能够对瞬态渗流过程引起的含水量变化迅速响应;当渗流达到稳定时,TDR测试的含水量结果与水量平衡分析结果较为接近,绝对误差在5%以内.     

Prenatal diagnosis by in situ hybridization on uncultured amniocytes: Reduced sensitivity and potential risk of misdiagnosis in blood-stained samples

Maternal cell contamination was assessed in 18 macroscopically blood-stained amniotic fluid samples from male fetuses. The samples were analysed by double-target fluorescent in situ hybridization (ISH) with Y and X chromosome-specific probes. The only sample with an aberrant karyotype (47, XY, +18) was also analysed by hybridization with a chromosome 18-specific probe. An interpretation of extensive maternal cell contamination was made in two samples, one of which was the sample with trisomy 18. ISH with the chromosome 18-specific probe on this latter sample showed that the sensitivity of the ISH method for chromosome enumeration of uncultured amniotic fluid samples may be reduced in bloodstained samples. It was calculated that by using ISH for chromosome enumeration of the two extensively contaminated samples, a case of trisomy 21 might have been overlooked in both samples, while a case of trisomy 18 might only have been overlooked in one of the samples. It is concluded that ISH should not be used for chromosome enumeration of uncultured amniotic fluid samples that are macroscopically blood-stained without further technical developments.     

应用电致化学发光分子探针技术对微小原甲藻的检测

以双特异分子探针技术(NPA-SH)为基础,运用电致化学发光技术(ECL)和磁性微球分选技术对其进行改进,成功建立了用于赤潮藻类定性定量分析的电致化学发光分子探针(ECL-MP)检测新技术.设计微小原甲藻特异性NPA探针并对其进行联吡啶钌和生物素标记,优化磁性微球使用量,在ECL检测装置中启动电化学反应,建立光信号与微小原甲藻细胞数目间的ECL-MP分析曲线并对其进行验证.结果表明,标记后的NPA探针具有一定的特异性和实用性;4μg是检测20μL目标藻杂交混合液的最适磁性微球使用量;在最适条件下,微小原甲藻细胞数的线性分析范围6.25×102～4×104个;比较ECL-MP和显微计数方法的样品检测结果,在95%置信区间内二者无显著差异(t-检验).ECL-MP方法为实现微小原甲藻现场样品的快速准确检测提供了一种新方法.     

The evolutionary processes of mitochondrial and chloroplast genomes differ from those of nuclear genomes

This paper first introduces our present knowledge of the origin of mitochondria and chloroplasts, and the organization and inheritance patterns of their genomes, and then carries on to review the evolutionary processes influencing mitochondrial and chloroplast genomes. The differences in evolutionary phenomena between the nuclear and cytoplasmic genomes are highlighted. It is emphasized that varying inheritance patterns and copy numbers among different types of genomes, and the potential advantage achieved through the transfer of many cytoplasmic genes to the nucleus, have important implications for the evolution of nuclear, mitochondrial and chloroplast genomes. Cytoplasmic genes transferred to the nucleus have joined the more strictly controlled genetic system of the nuclear genome, including also sexual recombination, while genes retained within the cytoplasmic organelles can be involved in selection and drift processes both within and among individuals. Within-individual processes can be either intra- or intercellular. In the case of heteroplasmy, which is attributed to mutations or biparental inheritance, within-individual selection on cytoplasmic DNA may provide a mechanism by which the organism can adapt rapidly. The inheritance of cytoplasmic genomes is not universally maternal. The presence of a range of inheritance patterns indicates that different strategies have been adopted by different organisms. On the other hand, the variability occasionally observed in the inheritance mechanisms of cytoplasmic genomes reduces heritability and increases environmental components in phenotypic features and, consequently, decreases the potential for adaptive evolution.     

分子生物学在生物强化处理环境污染物中的应用

综述了分子生物学的相关技术在生物强化处理环境污染物中的应用，主要包括：通过分子生物技术育种、筛选、构建高效降解污染物微生物菌株；提供更科学、快捷、准确多样的环境监测和环境评价技术手段；探索微生物与环境污染物间的相互关系，及微生物降解污染物的有关基因定位，相关主要技术有：核酸探针检测、DNA-DNA杂交，rRNA和rRNA基因序列分析。质粒指纹图谱分析、聚合酶链式反应（PCR）、低分子量PNA分布图及由PCR技术发展而带动的基因多态性技术，如变性梯度凝胶电泳（DGGE）、随机扩增多态性DNA技术（RAPD）等。     

FISH技术定量解析亚硝酸盐氧化菌的条件优化

利用基于亚硝酸盐氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria,NOB)16S rRNA序列的荧光探针,优化了针对亚硝酸盐氧化菌的FISH技术实验条件.确定了FISH技术定量检测亚硝酸盐氧化菌的具体方法,并优化了样品预处理的实验条件为热固定2h,4%多聚甲醛固定15min,乙醇脱水5min;杂交过程的实验条件为杂交温度46℃,杂交时间3h,洗脱液中NaCl浓度为60mmol·L-1.运用建立的FISH技术检测了7d内亚硝酸盐氧化菌菌群的丰度变化,充分显示了荧光原位杂交技术(Fluorescence in Situ Hybridization,FISH)的快速定性定量检测优势.