九层塔内生细菌系统发育分析及生物学功能

九层塔(Ocimum basilicum L.)为一年生唇形科药食两用植物.为研究野生九层塔植株内生细菌的多样性及生物学功能,采用LB、VM、DN和CCM4种培养基从植物不同部位中分离纯化内生细菌,利用IS-PCR插入序列指纹图谱技术进行聚类分析,通过16S rRNA基因测序分析对内生细菌进行分子鉴定及系统发育分析,进一步采用传统方法鉴定各类群代表菌株的生物学功能,并选取功能性较强的菌株进行水稻种子萌发及盆栽促生试验.结果显示,从九层塔中分离获得48株内生细菌,聚为13个类群,表现出九层塔内生菌的多样性;生物学功能测定显示所获得内生菌功能丰富:9株具有固氮功能,8株具溶磷功能,10株具有解钾能力,12株具有分泌生长素的能力,7株具有分泌铁载体功能;筛选出2个促生功能优良的菌株,分别为H1041和H4039,其发酵液能显著地促进水稻种子萌发和水稻生长.本研究表明从野生植物九层塔中分离所得的内生菌具有种群多样性和功能多样性,这些兼具不同功能的菌株具有农业应用开发的价值和意义.(图6表3参62)     

水产养殖环境中磺胺类药物的残留分析及其耐药菌株研究

对2014年整个养殖周期中南美白对虾养殖池塘的水样和沉积物进行采集,分析其中磺胺类药物的残留及其耐药细菌的变化,探讨其存在和分布与时间、空间及水产养殖活动的相关性,在此基础上对耐药细菌进行分离、鉴定并研究其生长性能。研究结果显示,在整个养殖季节中,池塘水体中磺胺类的变化呈低-高-低的变化趋势,养殖前、中、后期水体中磺胺类药物的平均浓度为0.437、1.691和0.503 ng·m L-1;而沉积物中的磺胺类药物的含量是逐渐递增的,养殖前、中、后期的平均含量为2.110、4.059和6.090 ng·g-1。池塘水体的可培养细菌数量在5.50×104~1.20×105 CFU·m L-1间,呈先升后降的趋势,沉积物中的可培养细菌数量在9.83×105~1.86×106 CFU·g-1间,呈不断上升的趋势,且沉积物中的可培养细菌数量较同期水体中高10~100倍。在相同浓度的磺胺二甲基嘧啶作用下,沉积物中的耐药细菌数量显著高于同期水体中的耐药细菌数量,高10~100倍。从养殖池塘沉积物和水体中分离到2株磺胺类药物的耐药菌株NHA1401和NHA1402,经细菌生理生化鉴定和16S r DNA序列分析,NHA1401和NHA1402同属奇异变形杆菌属(Proteus mirabilis)。磺胺类药物浓度越大,其对菌株NHA1401和NHA1402的生长压力越大,NHA1401菌株对磺胺类药物的耐受性要强于NHA1402。研究表明,养殖池塘环境中的磺胺类药物与养殖过程有关,沉积物是养殖环境中耐药细菌的主要存在场所。为保护环境和水产品质量,必须对抗生素的使用严加管控。     

青海省保护地辣椒根际土壤和根表放线菌研究

采用常规方法研究了青海省大棚和温室中辣椒健株、病株根际土壤和根表的微生物数量、放线菌组成及拮抗性放线菌的分布。结果表明：（1）青海保护地辣椒根际土壤和根表微生物以细菌为主，放线菌次之，真菌最少，三者数量之比为10^5：1：1(根表）；（20根际微生物数量和土壤速效N、P、K含量密切相关，速效养分含量高的土壤中微生物数量大。辣椒病株根际土坟和根表细菌、放线菌及真菌三大类微生物数量显著高于健株。（3）保护地辣椒根际土壤和根表放线菌组成较复杂，共分离到了7个属的放线菌，但仍以链霉菌为主，其次为小单孢菌和马杜拉放线菌。链霉菌可分为10个类群，金色类群占优势。健株根际土壤和根表放线菌组成较病株复杂，而链霉菌组成较病株简单。（4）供试放线菌菌株中9.0%对G^ 细菌有拮抗活性，6.7%对真菌有拮抗活性，对G^-细菌均无拮抗作用，健株根际土壤拮抗性放线放菌数量及其占放线菌总数的比例均高于病株，健株根表拮抗笥放线菌占放线菌总数的比例亦高于病株，表明根际土壤中拮抗性放线菌的数量及根际和根表拮抗性放线菌占放线菌总数的比例是决定辣椒是否染病的关键因素之一。表4参11。^^^^^^^^^     

水体中盐单胞菌属(Halomonas)细菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

通过制备标准曲线模板,针对一株盐单胞属细菌X3(经鉴定为Halomonas alkaliphila)的16S r DNA序列设计和筛选特异性引物,建立水体中盐单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法,并将该法用于检测莱州人工鱼礁海域Halomonas属细菌数量.结果表明,引物X3-3F和X3-3R能够对Halomonas属的细菌进行特异性检测,对细菌浓度为6.75×10~1-6.75×10~7 CFU/m L检测重复性和稳定性较好,最低检出浓度为67.5 CFU/m L.运用建立的方法对莱州人工鱼礁海域水体样品的检测结果表明,在未投礁海域2011年5月和7月水体样品中Halomonas细菌数量分别为8.71×10~3 CFU/m L和2.37×10~3 CFU/m L,而投礁区5月份水样也检出了该属细菌,但荧光信号较弱,7月份水样未检出该属细菌.本研究可为Halomonas属细菌的快速检测及其在海水养殖水质净化方面的推广应用提供有力的技术支撑.     

四川盆地大豆根瘤内生细菌的分离鉴定及促生效果

以四川盆地大豆根瘤为材料,采用划线法分离内生细菌、16S rDNA PCR-RFLP分析其遗传多样性,并结合菌株促生特性和盆栽试验筛选优良促生菌.从分离获得的130株内生细菌中选取了40株细菌作为供试菌株,16S rDNA序列表明分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium).以大豆为供试作物筛选出了12株具有促生能力的细菌,所有菌株均能分泌吲哚-3-乙酸(IAA),浓度达到0.353-32.404μg/mL;7株能产铁载体,活性单位为7.35%-34.31%;有11株具有溶磷能力,溶磷量达到4.26-10.6μg/mL;6株具有固氮能力.接种12株供试菌株后,玉米的农艺性状、植株全氮和全磷含量均优于单施化肥处理,其中菌株DA16-5效果最好,表现出良好的促生潜力.综上,四川盆地大豆根瘤内生菌遗传多样性丰富并且普遍具有促生能力,是重要的生物资源.     

龙葵根际和内生Cd抗性细菌的筛选及其生物学特性

调查了南京栖霞铅锌银矿区龙葵根际土壤和植株的重金属含量,采用稀释培养法和选择性培养基分离筛选Cd抗性细菌并研究其生物学特性.结果表明,栖霞山铅锌银矿区龙葵根际土壤总Cd含量平均为19.74 mg·kg -1,污染十分严重,龙葵(Solanum nigrum)茎和叶的Cd富集系数分别为1.21 ～9.65和0.65 ～4.76,对Cd具有较强富集能力.从龙葵根际土壤和植株中分离筛选到5株Cd抗性细菌,菌株AR1和AY1分别分离自根和叶内,BGJ4和CGJ1均分离自根际土.16S rDNA序列分析表明5株Cd抗性细菌均属于芽孢杆菌属(Bacillus),能够产生吲哚乙酸(IAA)和铁载体,根内生细菌AR1在含Cd2+ 30 mg·L-1的培养基中仍能生长良好.在1.5 mg· L-1Cd2+污染条件下,Cd抗性细菌AR1、AY1、BGJ4菌株能够明显促进油菜(Oilseed rape)幼苗根的伸长,在植物-微生物联合修复重金属污染土壤方面具有潜在的应用前景.     

土壤栽培和无土栽培菜心中内生细菌比较及分离鉴定

菜心(Brassica parachinensis)是华南地区的一种特色蔬菜.为探究无土栽培和土壤栽培菜心内生细菌的差异,以这两种栽培方式的菜心为材料,分离内生细菌.根据插入序列指纹图谱(IS-PCR)结果进行聚类,对代表性菌株的16S rRNA基因序列进行系统发育分析,并将菌株加入无土栽培营养液中,收获后测定菜心的的相对叶绿素含量(SPAD)和可溶性糖含量.结果显示,从两种菜心中共分离到31株内生细菌,IS-PCR结果将其聚为9个类群,16S rRNA基因鉴定其分别属于Bacillus sp.(芽孢杆菌属)、Rhizobium sp.(根瘤菌属)、Microbacterium sp.(微杆菌属)、Leifsonia sp.(雷夫松氏菌属)、Sphingomonassp.(鞘氨醇单胞菌属)、Alcaligenessp.(产碱菌属)和Agrobacteriumsp.(农杆菌属).土壤栽培菜心中可培养细菌数目多于无土栽培菜心,且土壤栽培菜心中内生细菌的碳代谢更多样化.生理生化实验显示,部分菌株能分泌生长素和铁载体.加入土壤栽培菜心中分离得到的菌株SCG14和SCG0802后,无土栽培菜心的相对叶绿素含量和可溶性糖含量比对照显著提高.本研究表明无土栽培和土壤栽培的菜心中的内生细菌在种类、数目、分布部位和碳源利用能力上有差异;此外,分离得到的菌株能提高无土栽培菜心的相对叶绿素以及可溶性糖含量,有开发为微生物制剂的潜力.(图4表6参35)     

几种可利用多氯联苯和多溴联苯醚植物内生菌的分离及初步鉴定

采用PDA、NA以及高氏一号培养基,分别从毛白杨、绦柳、荻以及二穗短柄草植株内分离、纯化出37株内生菌,其中34株为细菌,3株为放线菌.以分离纯化得到菌株各自对应的营养培养基并添加不同浓度的污染物对获得的37株内生菌进行污染物的耐受筛选,发现24株分别对20 mg·L-1的aroclor1254和BDE209具有一定的耐受性.利用无机盐培养基并添加污染物作为微生物唯一碳源筛选,发现菌株CPY-4和菌株SGL-1可以在只提供4-BDE的无机盐培养基中存活,菌株CPY-4,SGL-1、菌株4、菌株13可以在提供BDE209和aroclor1254的无机盐培养基中存活.形态学观察和16Sr DNA序列同源性分析,初步确定菌株SGL-1为克雷伯氏菌属,菌株CPY-4为地衣芽胞杆菌,菌株4和菌株13为肠杆菌属.     

水稻内生粘着剑菌的分子系统发育分析

通过16S rRNA基因和看家基因recA、atpD、rpoB的序列测定与分析,及(G+C)mol%测定等技术,对分离自河北省滦南县水稻根内的两株细菌进行分子系统发育学研究.根据系统进化树构建及其同源性分析,可确定所分离的两株水稻内生细菌属于剑菌属(Ensifer)系统发育分支;供试菌株的各保守序列与粘着剑菌(E.adhaerens)模式菌种同源性最高,除recA为97.2%外,其他均为99%～100%,可以确定供试菌属于E.adhaerens;对所分离的菌株与大豆、菜豆、三叶草、苜蓿等4种豆科植物进行结瘤试验,结果显示其中一株J3-N55可与苜蓿结瘤.野生型的E.adhaerens菌株与豆科植物结瘤的报道尚为鲜见;本文首次报道从水稻植株内分离到E.adhaerens菌株.     

骆驼刺根际细菌的植物促生能力

采用纯培养方法使用5种培养基分析沙漠干旱植物骆驼刺的根际可培养细菌群落,并用盆钵试验验证这些菌株的植物促生能力.共从骆驼刺根际土中分离纯化了120株细菌,根据16S rRNA基因序列划分成32个16S r RNA基因型,分布在Actinobacteria、Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes等4个门的17个属内.其中,Actinobacteria占全部分离菌株的77.3%,是骆驼刺根际的优势微生物;该门的Streptomyces和Arthrobacter两个属是分离菌株最多的属.从16个型(55株)的细菌中检测到了固氮酶nif H基因,占全部分离菌株的45.8%、全部型的50%.盆钵试验中,菌株Microbacterium sp.WLJ053、Streptomyces sp.WLJ079、Paenibacillus sp.WLJ097、Sphingomonas sp.WLJ118和Chryseobacterium sp.WLJ119能显著提高玉米的株高、鲜重和干重,具有植株促生能力.使用营养丰富的LB和WS培养基获得的微生物种类和特有微生物数量都更多,含nif H基因和具有植物促生能力的菌株比例更高.本研究说明沙漠植物根际蕴含了大量微生物种质资源,具有较好的开发前景.