促进氰钴胺素转化为腺苷钴胺素的基因表达与鉴定

辅酶B12作为甘油脱水酶(GDHt)的辅酶参与到Klebsiella pneumoniae代谢甘油生成1,3-丙二醇(1,3-PD)和3-羟基丙酸(3-HP)的途径中.前期研究表明底物甘油可以导致辅酶B12分子中Co—C键的断裂,进而引起GDHt的失活.为进一步研究非活性的维生素B12(CNCbI)转化为具有活性的辅酶B12(AdoCbI)的过程,从K.pneumoniae中克隆得到了ATP:钴(I)胺素腺苷转移酶(ACA)基因btuR和还原酶基因yciK,并成功构建了双启动子表达质粒pUC18-tac-btuR-tac-yciK,将表达质粒转化Escherichia coli JM109获得了一株重组菌.利用改进的分析方法,结果表明:1)重组蛋白具有腺苷转移酶的活性;2)重组菌可以很好地将非活性的钴胺素,如维生素B12,转化生成具有活性的辅酶B12.     

产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB)的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260 U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40 g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5 g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.图6表1参18     

强化丙酮酸-CO2途径对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中辅酶NADH的有效供给影响1,3-丙二醇的产量和得率,通过在K.pneumoniae强化丙酮酸-CO2途径,以提高胞内NADH水平和1,3-丙二醇产量.将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W3 03)的甲酸脱氢酶基因fdh1和K.pneumoniae的丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl B在K.pneumoniae中过表达,强化丙酮酸-甲酸-CO2途径.结果显示,单独表达fd h1、pfl B和共表达fhd1、pfl B基因的克雷伯氏菌与出发菌株相比,胞内NADH含量明显增加,1,3-丙二醇产量分别提高了8%、12%、18%,摩尔转化率分别提高了7.3%、13.2%、19.5%,除乙酸外其他副产物都有不同程度的降低.本研究表明,强化丙酮酸-甲酸-CO2途径提高了NADH的再生效率,促进了1,3-丙二醇的合成.     

产1,3-丙二醇新型基因工程菌的构建

以甘油为底物转化生产1,3-丙二醇的生物合成途径中,往往由于还原力NADH的不足,限制了1,3-丙二醇的合成,引起中间代谢产物3-羟基丙醛累积,进而抑制甘油脱水酶的活性,阻碍菌体的生长,严重影响1,3-丙二醇的合成途径.为了解决合成途径中还原力不足这一主要矛盾,本文以大肠杆菌和克雷伯氏菌染色体DNA为模板克隆得到yqhD和dhaB、dhaT基因,构建双启动子表达载体pEtac-dhaB-tac-yqhD及表达载体pUC-tac-dhaT,成功共转入E.coli JM109,得到可利用两种辅酶(NADH、NADPH)将片油转化为1,3-丙二醇且传代稳定的重组大肠杆菌双质粒系统,发酵结果表明,1,3-丙二醇产量提高了28.6%.图6表1参17     

克雷伯氏菌产1,3-丙二醇菌株选育及甘油脱水酶基因转录分析

通过对野生克雷伯氏菌(Klebsiella)进行紫外诱变,获得一株耐高浓度甘油及高浓度1,3-丙二醇的突变菌株A-39-3,该突变株产1,3-丙二醇的量较野生菌株提高了58%,副产物2,3-丁二醇和乙醇的量分别降低了27%和19%.为探讨突变株高产1,3-丙二醇的原因,通过对突变菌株发酵过程中关键酶的酶活跟踪分析,发现1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的酶活力与野生菌株相差不大,甘油脱氢酶(GDH)的酶活力略有下降,而突变菌株的甘油脱水酶(GDHt)的酶活力明显高于野生菌株.并采用半定量RT-PCR方法,从转录水平上比较甘油脱水酶基因的差异,结果发现突变菌株A-39-3甘油脱水酶基因的相对mRNA转录水平是野生菌株K的2.58倍,分析说明该突变株1,3-丙二醇产量的提高与关键酶基因dhaB的mRNA转录水平关系密切.     

利用甘油脱水酶基因构建产3-羟基丙醛工程菌及其表达比较

3-羟基丙醛(3-HPA)是一种重要的化工产品,可由甘油经甘油脱水酶作用后生成.为获得产3-HPA基因工程菌,在已构建含甘油脱水酶基因及其激活因子大亚基质粒pEtac-dhaB-gdrA的基础上,构建了包含小亚基gdrB激活因子的重组质粒pEtac-dhaB-gdrA-gdrB.利用大肠杆菌通用tac启动子将该质粒在不同Escherichia coli BL21、DH5a及JM109中进行表达.阳性转化子经IPTG诱导后,提取总RNA,以cDNA为模板进行RT-PCR发现,目标基因在不同宿主都能较好转录.SDS-PAGE、酶活测定和3-HPA浓度测定结果表明,目标蛋白表达存在差异;酶活分别为4.7(±0.44)、3.5(±0.95)、8.1(±0.66)U/mg;发酵液中3-HPA的含量分别为0.012(±0.0044)、0.014(±0.003)、0.375(±0.018)g L-1,重组E.coli JM109/pEtac-dhaB-gdrA-gdrB具有较好的甘油脱水酶基因表达和产3-HPA性能.该基因工程菌与克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)相比,发酵副产物明显较少,有利于后期提取,为生产3-HPA提供了一条新思路.     

budC缺失对克雷伯氏菌联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的影响

在利用克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇过程中,副产物对碳流的竞争是限制产物合成的重要因素.通过将来源于大肠杆菌的醛脱氢酶基因在budC缺失型克雷伯氏菌中过表达,研究budC缺失对克雷伯氏菌联产1,3-丙二醇和3-羟基丙酸的影响.与K.pneumoniae ZG27/pUC19-aldH相比,缺失型菌株K.pneumoniae ZG40(budC?)/pUC19-aldH发酵60 h后,1,3-丙二醇和3-羟基丙酸的产量分别为64.0 mmol/L和134 mmol/L,3-羟基丙酸转化率提高了22%,副产物中除2,3-丁二醇外均有不同程度降低.本研究表明,过表达醛脱氢酶的重组克雷伯氏菌能够积累3-羟基丙酸,但在微氧发酵24 h后,1,3-丙二醇逐渐向3-羟基丙酸转化;而budC的缺失进一步促进了1,3-丙二醇向3-羟基丙酸的转化.     

SO2衍生物对大鼠神经元和心肌细胞几种离子通道的影响

为了阐明大气污染物SO2对神经系统和心血管系统的毒作用机制,采用全细胞膜片钳技术研究了SO2衍生物(NaHSO3和Na2SO3,分子比为1∶3)对大鼠海马、背根节神经元和心肌细胞膜上钠、钾、钙离子通道的影响.结果显示:(1)SO2衍生物可显著增大大鼠海马CA1区神经元钠电流,不影响钠通道的激活过程,但可使钠电流的失活曲线向去极化方向移动,延迟钠通道的失活过程;另外,SO2衍生物可显著增大瞬间外向钾电流(IA)和延迟整流钾电流(IK),不影响IA的激活过程,使IK的激活过程向负电压方向移动,促进IK的激活过程,而使IA的失活曲线向正电压方向移动,延迟IA的失活过程.(2)SO2衍生物显著增大大鼠背根节神经元钠电流(TTX-S钠电流和TTX-R钠电流),可使两种钠电流的激活和失活曲线均向去极化方向移动,但对失活的影响大于对激活的影响,即延迟钠通道的失活过程;SO2衍生物显著增大背根节神经元瞬间外向钾电流(TOCs)和延迟整流钾电流(IK),不影响TOCs的激活过程,但可使IK的激活曲线向超极化方向移动,促进IK的激活.另外,还可使TOCs的失活曲线向去极化方向移动,即延迟TOCs的失活.(3)SO2衍生物可显著增大大鼠心肌细胞L-型钙电流(ICa,L),使ICa,L的激活和失活曲线均向去极化方向移动,但对失活的影响大于对激活的影响;SO2衍生物显著增大心肌细胞钠电流,不影响钠通道的激活过程,但可使钠电流的失活曲线向去极化方向移动,延迟钠通道的失活过程;SO2衍生物显著增大心肌细胞瞬间外向钾电流(Ito),使Ito的激活曲线向超极化方向移动,促进Ito的激活过程,但可使Ito的失活曲线向去极化方向移动,延迟Ito的失活过程;此外,SO2衍生物还可显著增大心肌细胞内向整流钾电流(IK1),但不影响其反转电位.结果表明,SO2衍生物可能通过影响神经元和心肌细胞膜上离子通道的活动而对中枢神经、传导神经以及心血管系统产生不利影响.提示大气SO2污染可能与神经系统和心血管系统疾病的发生有关.     

质粒pACYC184电转化松材线虫携带的荧光假单胞菌GcM5－1A

以质粒pACYC184为材料,研究了松材线虫携带的荧光假单胞菌的最适电转化条件.结果表明,荧光假单胞菌GcM5-1A培养至D600nm为0.5时制备感受态细胞,以300 mmol/L蔗糖溶液为电击缓冲液,质粒DNA终浓度为0.01 ng/μL,在25 μF电容、9 kV/cm电场强度、200 Ω电阻的电击条件下电击一次,可得最大的电转化效率,即5.5×106/μg(DNA).SDS-PAGE分析显示,转化质粒pACYC184的氯霉素抗性基因在受体细胞内得到了表达.本方法的建立为松材线虫携带的荧光假单胞菌的基因导入提供技术支持.为进一步通过基因敲除的方法,选择性地失活特定功能基因,进而确定这些基因在松材线虫病病理进程中的作用奠定基础.图2参16     

木聚糖酶基因xynB在不同大肠杆菌表达系统中的表达比较

从黑曲霉(Aspergillus niger)nl-1中克隆获得木聚糖酶基因xynB.该基因全长745 bp,含有67 bp内含子,与公布的黑曲霉xynB基因有较高的同源性.将PCR扩增的木聚糖酶成熟肽基因和含有信号肽的基因分别连接到表达载体肠杆菌Top10 F’、DH10B和两种BL21宿主中获得重组菌株.通过IPTG诱导,xynB基因在重组菌株中获得特异性表达.表达产物以胞内可溶性蛋白和不溶性包涵体形式存在.诱导4 h,重组菌株pTrc-99a-xynB[BL21 condon plus(DE3)]表达量最高,胞内酶活达到299 IU/L.重组质粒pTrc-99a-xyn B(S)在不同宿主胞内和胞外均能分泌目的蛋白,诱导10 h,胞外酶活pTrc-99a-xynB(S)[BL21 condon plus(DE3)]达到347 IU/L.而pET-20b-xynB(S)在两种BL21宿主中均不表达.经SDS-PAGE分析,以pTrc-99a和pET-20b作为表达载体时,重组蛋白相对分子质量分别约为45×103和30×103.与pET-20b相比,pTrc-99a以及自身信号肽的引导更有利于重组木聚糖酶的表达.     

Evaluating losses in ecosystem services in nature reserves in Sichuan,China

Nature reserves have developed rapidly over the decades in China and play a significant role in the function of ecosystem services. The function of ecosystem services in nature reserves, however, has tended to decline in recent years due to natural hazards and human activities. Based on land use, the variation of ecosystem services value (ESV) during 2000–2010 in national nature reserves in Sichuan was evaluated. We analyzed the comprehensive effects of natural disasters and human activities on the decline of ESVs. Total ESV in the national nature reserves in Sichuan was approximately 2741.35 million US$ in 2000, 2616.81 million US$ in 2005, and 2499.06 million US$ in 2010, representing a decrease of 242.29 million US$, or 8.84%, in the decade. Forestland, grassland, wetland, and water bodies played vital roles in the function of ecosystem services, with an aggregated ESV of 99% of the total. The largest proportion of the total ESV was the protection of biodiversity at 48.6%. ESV of all land use types and single ecosystem services continued to decline during 2000–2010. A mechanism of adaptable risk prevention should be established, and unreasonable human activities should be avoided to protect ecosystems and to improve the functions of ecosystem services.     

森林土壤固碳机理研究进展

全球碳平衡中,土壤有机碳储量为2000 Pg,植被碳储量500 Pg,大气碳储量785 Pg,土壤中有机碳变化是影响大气温室气体含量的重要因素。中国人工林总量世界第一,可以通过造林树种的选择,增加森林土壤的碳汇功能,它主要通过4种机理来实现,包括稳定性有机-矿物复合体的形成、持久性封存的深层碳的增加、耐分解有机物成份的积累、以及土壤团聚体结构中碳的物理性保护。中国近年来对木材的需求上升,导致大量短轮伐期人工林的种植,采伐、火烧炼山、施肥与整地等营林措施对土壤碳汇功能形成重大影响。因而,通过加强对中国人工林土壤固碳机理的研究,通过人为措施实现具有较强固碳能力的森林类型,从而提高人工森林生态系统的固碳能力,它对中国减排增汇战略具有重要意义,而加强对不同营林措施对碳汇功能影响的研究是中国当前面临的重大课题。     

中国水稻土碳循环研究进展

文章首先分析了水稻土在碳循环研究中的地位和重要性，进而对我目水稻土碳循环的研究现状作了较为详尽的阐述，对其主要研究结论进行了深入的剖析。中国大而积的水稻土自1980年以来显示出有机碳库增加现象，说明水稻田对大气CO2可能产生汇效应。水耕熟化过程足有机碳的积累过程，水稻土的碳密度是早作土碳密度的2-3倍。水稻土的同碳能力与土壤的微团聚体的粒径有关。但对于水稻土中有机碳的分布和结合状态与农业管理措施、水稻土质量变化、农业生态环境变化的关系仍不清楚。因而建议就这一问题从土壤物理学、化学和生物学的相互作朋与土壤微团聚体中矿物质、有机质和微生物的相互结合关系的层面上进行多学科研究。同时提出了今后我困水稻土碳循环的重点研究方向和领域，即从整体和系统的角度来研究碳循环和平衡，从不同的时空区域来研究碳循环的过程和强度。     

Is the antipredatory response in behaviour reflected in stress measured in faecal corticosteroids in a small rodent?

Predation risk has been shown to alter various behaviours in prey. Risk alters activity, habitat use and foraging, and weight decrease might be a consequence of that. In mammals, studies on physiological measures affected by risk of predation, other than weight, are rare. We studied in two separate laboratory experiments foraging, hoarding behaviour and expression of stress measured non-invasively from the faeces in the bank vole (Clethrionomys glareolus), a common boreal rodent. Voles were exposed to predation risk using odours of the least weasels (Mustela nivalis nivalis). Distilled water served as control. In the first experiment, we found that foraging effort, measured as sunflower seeds taken from seed trays filled with sand, was significantly lower in trays scented with weasel odour. Both immediate consumption of seeds and hoarding were affected negatively by the weasel odour. Females hoarded significantly more than males in autumn. In the second experiment, the negative effect of weasel odour on foraging was consistent over a 3-day experiment, but the strongest effect was observed in the first night. Foraging increased over the time of the experiment, which might reflect either energetic compensation during a longer period of risk, predicted in the predation risk allocation hypothesis, or habituation to the odour-simulated risk. Despite decreased foraging under predation risk, stress measured as corticosteroid metabolite concentration in vole faeces was not affected by the weasel odour treatment. In conclusion, we were able to verify predation-risk-mediated changes in the foraging effort of bank voles but no physiological stress response was measured non-invasively, probably due to great individual variation in secretion of stress hormones.     

中国公众参与环境管理的研究

回顾了中国公众参与环境管理的发展历程,分析了公众参与环境管理存在的问题。针对公众参与环境保护管理的有效性的影响因子,例如主观因素、传统背景、时效因素及执行技巧等进行一系列的探讨,并根据公众参与计划的设计构思、公众参与计划的关键两方面的讨论,提出增加公众参与环境保护管理有效性的一些建议。     

Employment of passive sampling in monitoring indoor air quality in selected residences in a Tri-city area in Poland

Time-weighted average concentrations of selected volatile compounds were measured in chosen residences in a Tri-City area of Poland by means of passive sampling. The results were compared to those obtained by dynamic technique – sorption tubes filled with Tenax TA sorbent. Results obtained by employing the two techniques were similar. Total volatile organic compound (TVOC) parameters were also determined. An attempt was also made to evaluate the influence of outdoor air pollutants on indoor air quality.     

Lead in a residential environment in Jamaica

The background levels of lead in Jamaica in soils and sediments, estimated at 37 mg kg^–1, are relatively high compared with world averages. Several areas have values in excess of this due to mineralisation and pollution. One such is the residential Hope Flats/Kintyre area in which levels of lead up to 2.5% are found in the soils and up to 8 g kg^–1 in the water of the nearby Hope River. The blood lead levels of a sample of children were in the range 5.7–57 g dl^–1. The high lead levels suggest a potential health risk, particularly for the children. This can be minimised by programmes which include community education, case management and abatement to reduce the lead exposure.     

硝基芳香化合物的植物作用研究进展

硝基芳香化合物是环境中难以降解的污染物之一。因其用途广泛,大量残留于土壤,水体和大气中,造成的环境污染日趋严重。多种植物对该类污染物具有吸收、富集和代谢降解作用,利用植物对其环境污染进行治理是一种有效的方法。文章在总结国内外有关硝基芳香化合物的植物作用研究基础上,重点阐述了植物对硝基芳香化合物的吸收、转运和代谢过程,分析了吸收、代谢机理以及影响吸收的因素;硝基芳香化合物的理化特性、浓度和植物自身特性及其它外界条件都会影响植物对该类化合物的吸收,植物可以通过体内降解、体外联合代谢、根部释放酶催化的机制实现该类化合物的降解。目前,硝基芳香化合物进入植物细胞膜的机理认知不足,模拟模型缺乏有力数据验证;代谢机制中参与反应的酶、化合物等体系和反应产物环境特性仍不明确,植物修复可行性缺乏有力证据。未来将在模型预测构建、降解机理和修复工程的实际应用方面作进一步探究,以形成系统的认知,为硝基芳香化合物污染土壤和农产品的生态风险评价以及植物修复提供理论依据。     

生物扰动在水层-底栖界面耦合中的作用

综合评述了生物扰动在水层-底栖界面耦合中的作用研究进展和热点问题,并进行了展望。国际上十分重视水层-底栖界面耦合过程的研究并已有一定基础,生物扰动作为海洋生态学的重要内容之一早在20世纪50—60年代就已开展了工作,但直到10余年前才真正开始定量研究,进入了实验模拟、现场观测与建立模型相结合的新阶段。国内的生物扰动研究尚处于起步阶段,加上技术方法落后,一直未能取得突破性进展。目前国内外关于水层-底栖界面生物扰动效应研究基本上都在海洋中开展,尤其在河口、近岸和浅海水域进行,湖泊和河流研究明显薄弱。作为水生态动力学的重要分支和前沿领域,生物扰动研究具有广阔前景。急需针对我国水域特点,引进先进的现场观测和室内测试手段,进一步揭示水层-底栖界面耦合过程中的生物扰动机制,更精准和更详细地掌握水域中各种物质的生物地球化学循环的全过程,为控制水体内源污染释放、富营养化治理和生态建模等提供科学依据。