细菌表面展示技术及其在环境重金属污染修复中的意义

从细菌表面展示系统构成、载体蛋白的选择和细菌表面展示策略等方面综述了细菌表面展示技术及其发展,分析了它们的优缺点,指出了细菌表面展示技术用于重金属污染修复存在的问题,提出了解决问题的思路和方法。     

表面展示技术在污染环境生物修复中的应用

革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和酵母中已建立多个表面展示短肽和蛋白质的系统.在微生物细胞表面展示外源蛋白对污染环境的生物修复有着重要的意义.展示金属结合蛋白(肽)的微生物可用于污染土壤和工业废水的净化,展示有机磷水解酶的微生物将用于有机磷污染物的脱毒.微生物表面展示技术将成为污染环境生物修复的有效策略.这一技术的研究还是一个新领域,要使其得到应用还有许多问题需要解决. 参38     

镉致鸡血管氧化应激与金属硫蛋白含量的变化

为探讨镉(Cd)对血管抗氧化功能及金属硫蛋白(MT)的影响,将180只50日龄健康雌性海兰鸡随机分为3组(对照组、低剂量组和高剂量组),分别饲喂含0、140、210mg·kg-1(BW)CdCl2的基础日粮,在饲养20、40、60d后采集主动脉和前腔静脉,测定其MT含量,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量.结果表明:1)Cd暴露后,与对照组相比,低剂量组血管MT含量显著升高(p<0.01),并随暴露时间的延长而逐渐增加;高剂量组血管MT含量显著降低(p<0.01),并随暴露时间的延长先升高后降低.2)随着Cd暴露剂量的加大,血管SOD、GSH-Px活性逐渐降低,而MDA含量逐渐升高,具有明显的剂量-效应关系.3)随着暴露时间的延长,血管SOD、GSH-Px活性逐渐降低,MDA含量逐渐升高,具有明显的时间-效应关系.4)Cd暴露下,主动脉与前腔静脉各指标具有相同的变化趋势.以上结果表明,Cd具有血管毒性,其毒作用机理可能与MT含量变化以及抗氧化功能失衡有关.     

镉胁迫下蚯蚓金属硫蛋白氧化修饰的研究(Oxidative Modification of Metallothionein in Earthworm under Cd Stress)

金属硫蛋白(MT)是生物体内的一类富含巯基(—SH)的蛋白,在细胞氧化还原调控和重金属解毒等方面具有重要作用.MT的—SH可以络合重金属,同时对氧化作用很敏感,重金属胁迫产生的活性氧物质(ROS)可以将其氧化成二硫键(S—S).为揭示镉(Cd)对蚯蚓MT的—SH含量及其氧化修饰的影响,将蚯蚓放入Cd浓度为0、100、300mg·kg-1的黄棕壤中胁迫21天,通过SBD-F标记和高效液相色谱(HPLC)结合的方法测定MT中—SH和S—S的含量.结果显示,随着Cd浓度的增加,蚯蚓体内的—SH和S—S含量均逐渐增加,但S—S所占比例降低.这说明Cd诱导了蚯蚓体内MT合成,并且诱导量随着Cd胁迫的增强而增加,但—SH的氧化修饰程度有所下降.     

镉在方斑东风螺组织内的蓄积及镉的毒性：水相暴露与食物相暴露比较

为比较直接经水体与经营养传递的2种镉(cadmium,Cd)暴露方式对方斑东风螺(Babylonia areolata)不同组织Cd蓄积和毒性的差异,采用室内模拟法,将螺暴露于含Cd水体(Cd2+:100μg·L-1)或喂食含Cd饵料(牡蛎,34.56μg·g-1以干质量计,先经水体100μg·L-1Cd2+暴露达平衡)30d后再进行15d净化。结果显示,暴露期间,除食物相组螺胃肠道Cd浓度在第10天极显著高于对照组,但随后迅速下降外,其他各组织在2种途径及胃肠道在水相暴露时Cd的浓度均逐渐上升,暴露30d后肝胰脏中Cd浓度最高;净化期,螺鳃中Cd排出率较高,胃肠道与肝胰脏的排出率较低,至净化期末除食物相组鳃中Cd浓度与对照组无显著差异外,2种处理中其他各组织Cd浓度仍显著高于对照组。2种暴露途径中金属硫蛋白(metallothionein,MT)浓度仅在螺肝胰脏中逐渐增加,且与Cd的蓄积呈显著线性正相关。与食物相组相比,水相Cd暴露引起螺肝胰脏脂质过氧化水平(lipid peroxidation,LPO)更高,且内脏团中Cd与其亚细胞成分的金属敏感组分结合的百分比也更高。结果表明,Cd通过营养传递对螺产生的毒性较水体直接暴露低,但摄食是螺蓄积Cd的主要途径;净化后除鳃外水相暴露组螺各组织Cd的排出率较低;因此为了健康养殖与食用安全,东风螺工厂化养成时对饵料与水体Cd浓度的监测均应引起足够的重视。     

吸附铅、镉固定化细菌胞壁多糖小球包埋条件的优化选择

细菌已广泛应用于重金属废水的处理,多糖则是细胞壁的主要成分,并通过螯合作用吸附重金属,而固定化技术具有处理效率高,生产成本低等优势。采用正交实验法,以聚乙烯醇和海藻酸钠为包埋剂,同时添加活性炭,硅藻土等对细菌胞壁多糖进行固定化,并以吸附铅、镉能力为主要考察指标,同时从机械强度、传质性、耐酸性等方面综合考虑,选择最优化的固定化小球最佳配方。结果表明,在聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭、硅藻土、多糖、二氧化硅和饱和硼酸中氯化钙的质量分数分别为10%、0.2%、1.5%、1.5%、0.8%、4%、3%,胶联时间为16h,己二胺浓度为0.06mol?L-1的条件下制得的固定化小球对铅、镉吸附的能力较强,并按照最佳配方进行了验证实验,对铅的吸附量达到4.4575μmol?g-1,对镉的吸附量达到4.1708μmol?g-1,机械强度、传质性和耐酸性都较好。     

采用XPS研究镉在蒙脱石表面的吸附机理

采用XPS方法,通过对比吸附镉前后蒙脱石表面元素结合能的变化,对镉在蒙脱石界面吸附机理进行研究.结果表明,吸附镉离子后电子由镉离子向氧、铁、硅原子转移,Al基本没有参与配位.除表面配位的化学吸附作用外,镉离子还通过与蒙脱石层间阳离子进行交换吸附而进入蒙脱石的层间.     

镉胁迫下黑点青鳉(Oryzias melastigma)肝脏金属硫蛋白mRNA性别差异性表达研究

鱼类金属硫蛋白(metallothionein,MT)mRNA作为生物标志物已越来越多地应用到水环境重金属污染的监测中,然而重金属胁迫下鱼类MT mRNA表达是否具有性别差异性特征目前尚无相关报道。以海洋模式鱼类—黑点青鳉(Oryzias melastigma)为实验鱼类,首次克隆了其MT基因全长c DNA序列,分析了黑点青鳉MT基因和氨基酸序列特征,然后进一步研究了水体中镉暴露后雌、雄性黑点青鳉肝脏中MT mRNA表达的差异性。结果显示,黑点青鳉MT基因c DNA全长为385 bp,编码60个氨基酸,预测编码的多肽分子量为5 990 Da,含有脊椎动物MT基因特征性序列结构cys-x-cys、cys-x-x-cys和cys-x-cys-cys。镉胁迫下雌、雄性黑点青鳉肝脏MT mRNA表达结果显示,在0.8,4.0和8.0μg·L-1环境浓度的镉暴露1~7 d条件下,与对照组相比,雄性黑点青鳉在所有的不同暴露浓度和不同暴露时间的实验组中肝脏MT mRNA几乎均被显著性诱导表达;而雌性黑点青鳉只在较高暴露浓度和较长暴露时间的实验组中才被显著性诱导表达,并且MT mRNA的表达水平比雄性低得多。上述研究结果表明,在相同的镉胁迫条件下,雄性黑点青鳉肝脏MT mRNA的表达比雌性更敏感;以黑点青鳉MT mRNA作为生物标志物监测海洋环境重金属污染生物效应状况时,应选择更敏感的雄性黑点青鳉作为监测鱼类。利用生物标志物监测水环境污染物生物效应时,监测动物的性别差异是一个应当考虑的重要因素。     

硫氧化细菌的分离鉴定及降解特性

从浙江华海药业污水处理系统中分离得到一株硫氧化细菌T3,基于形态特征、生理生化、16S rRNA基因序列系统学分析和Biolog鉴定系统分析,鉴定该菌株为根瘤菌属.摇瓶实验结果表明,T3生物降解最适生长温度为30℃,最适pH值为8.0,外加氯化铵、碳源对菌株生长及硫化钠降解有促进作用,驯化后的硫氧化细菌对硫化钠有很强的耐受能力,最优生长条件下,2 d内菌株T3能将400 mg/L以下浓度的硫化钠降解彻底,是一株有应用前景的硫氧化细菌.通过测定代谢过程中各种物质的含量,确定该菌株对硫化钠的去除机理为S2-→S2O32-/S0→SO32-→SO42-.图8表1参18     

基于黄单胞菌冰核蛋白N端的表面展示体系建立

为了建立一个自主、高效的细菌表面展示体系,利用野油菜黄单胞菌冰核蛋白N端结构域,将短小芽孢杆菌脂肪酶展示于大肠杆菌Rosetta 2(DE3)表面.采用细胞分级、脂肪酶活测定和His-tag In-gel stain分析等检测了重组蛋白的表达情况,并进一步检测了不同底物、温度、pH和有机溶剂对酶活稳定性的影响.结果显示融合蛋白在大肠杆菌细胞外膜成功展示,重组菌脂肪酶活为(74.6±4.5)U/g冻干细胞,展示水平为每个细胞表面19 267个脂肪酶分子;展示酶对中长链脂肪酸酯表现出较高的水解活性,最适pH为11.0,最适温度为40℃,且在40℃保温一周仍保持80%以上的酶活.本研究表明基于野油菜黄单胞菌冰核蛋白N端的展示体系是一种高效、稳定的细菌表面展示体系.     

水体沉积物结合态镉对大型溞（Daphnia magna）的生物毒性研究

选择大型溞(Daphnia magna)作为受试生物,以大型溞体内金属积累量、金属硫蛋白含量和死亡率作为测试指标,考察了上覆水体系与水柱-沉积物共存体系中金属镉(Cd)的毒性状况,探讨了水体沉积物中重金属的生物毒性作用机制.结果表明:暴露于水柱-沉积物共存体系和上覆水体系中的大型溞体内的生物积累量均随沉积物Cd含量的升高而升高,且前者显著高于后者,说明沉积物中的Cd可通过食物吸收等途径对生物体致毒、致害;暴露于两种体系中的大型溞体内的MT含量在低浓度条件下随沉积物中Cd含量的升高而升高,当Cd含量高于800μg·g-1时MT含量大幅度下降,并且两体系之间无显著差别;暴露于两种体系中的大型溞幼溞死亡率无显著差别.上覆水中溶解态Cd和沉积物中可交换态Cd是对水生生物重要的毒性影响形态.     

利用 S-层蛋白CTC在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白PMGA1.2的可行性及其免疫原性,为研制能常温长期保藏和运输的禽用口服疫苗奠定基础.用部分pmga1.2基因(pmga1.2p)代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段,构建了2个融合基因ctc-pmga1.2p和csa-ctc-pmga1.2p(csa表csaAB操纵元,其与S-层蛋白牢固地锚定到细胞表面密切相关);将含融合基因的重组质粒电转化入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中,获得了2个重组菌株BCCG(含ctc-pmga1.2p和携带csaAB操纵元的质粒)和CG(含csa-ctc-pmga1.2p).血凝和血凝抑制试验结果显示,2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组蛋白PMGA1.2P;小鼠免疫学实验证实,2个重组菌株所展示的重组蛋白均具有免疫原性,其中,重组菌株CG的免疫效果优于BCCG.结果表明,苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可被用来研制热稳定性禽用口服疫苗.