旱地土壤反硝化厌氧甲烷氧化菌的垂向分布特性与活性分析

在厌氧条件下,以亚硝酸盐作为电子受体将甲烷氧化的反硝化厌氧甲烷氧化反应(nitrite-dependent anaerobic methane-oxidizing,n-damo)的发现,彻底颠覆了人们对甲烷循环的传统理解.通过分子生物学方法及13C和15N稳定同位素示踪技术,对河北省北澧河附近的旱地农田土壤(0~1 m)中n-damo菌的群落结构、丰度和活性进行了研究,深入探究了n-damo菌的亚硝酸盐底物来源.结果显示,n-damo菌更多存在于旱地浅层土壤中,并且随季节变化分布在不同深度的土壤中.针对其pmo A基因的系统发育分析显示,旱地土壤中n-damo菌的群落结构具有明显的空间异质性,来自土壤0~20 cm和40~60 cm土层的序列完全分开,处于系统发育树不同分枝.针对其16S rRNA基因的实时荧光定量PCR结果显示,n-damo菌丰度随土壤深度的增加而降低,夏季丰度(1.44×10~4~1.02×10~5copies·g~(-1))低于冬季(3.66×104~2.67×105copies·g-1).在浅层土壤(0~20 cm)中,硝化反应和反硝化反应共同为n-damo菌提供亚硝酸盐底物来源;而在深层土壤(60~80 cm)中,亚硝酸盐底物主要来源于硝化反应.n-damo菌的活性(0.18 nmol·g~(-1)·d~(-1),以CO_2计)只能在夏季表层土壤(0~20 cm)中检测到,其余深度均未检测到其活性.在旱地农田土壤中,反硝化厌氧甲烷氧化菌对农田碳循环的影响可能不大.     

人类活动对三峡消落带土壤亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化菌群落的影响

由"Candidatus Methylomirabilis oxyfera(M.oxyfera)"主导的亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化过程(nitrite-dependent anaerobic methane-oxidizing,ndamo)是碳循环中新发现的一个过程.已有研究发现三峡库区消落带有n-damo菌的存在.为了解人类活动对n-damo菌群落结构的影响,对三峡库区受人类活动干扰程度不同的消落带n-damo菌群落进行了研究.结果表明,人为干扰水平高的小河消落带n-damo菌基因丰度(8.98×102~3.31×105copies·g~(-1))整体上要高于白家溪(4.72×102~5.32×104copies·g~(-1)).此外,淹水都会导致两个地点n-damo菌基因丰度的增加.白家溪的n-damo菌丰度与累积淹水时间呈线性正相关,而小河的n-damo菌丰度与土壤总氮显著负相关.系统发育树和多样性分析表明,淹水前白家溪和小河相近高程土壤n-damo菌群落结构比较类似,但淹水后出现较大差异;较低高程土壤的群落多样性要明显高于较高高程土壤.消落带土壤中的n-damo菌群落具有明显的时空异质性,且淹水会导致这种异质性增加.淹水和人类活动对于n-damo菌的多样性具有同等的重要性.这些结果表明,淹水和人类活动都会影响消落带土壤中n-damo菌群落结构,而人类活动可能进一步增加n-damo菌的丰度和多样性.     

浑河底泥反硝化厌氧甲烷氧化菌群落结构时空特征

为了解在反硝化厌氧甲烷氧化反应过程中起主要作用的微生物——Candidatus Methylomirabilis oxyfera(M. oxyfera)在河流底泥环境中的时空变化特征,利用克隆文库及实时荧光定量PCR技术考察了浑河流域部分底泥中M. oxyfera-like的16S rRNA和pmoA功能基因的多样性及丰度. 结果表明:从浑河上游至下游丰水期各采样点底泥中M. oxyfera-like的16S rRNA的多样性无明显地域性差异,其OTU(operational taxonomic unit,独立操作单元)数变幅不大;pmoA功能基因的多样性则存在较为明显的地域性差异,上游采样点A(章党大桥)底泥中OTU数为5,下游采样点E(三岔河大桥)底泥中仅为1. 采样点A底泥中M. oxyfera-like的16S rRNA和pmoA功能基因的多样性均存在一定的季节性差异,平水期16S rRNA和pmoA功能基因的Shannon-Wiener多样性指数分别为1.48和2.19,在各期中最高;而枯水期时二者均最低,分别为0.83和1.26. 丰度分析结果显示,所有采样点底泥中M. oxyfera-like的16S rRNA丰度均表现为平水期(2.42×106~1.74×107 copies/g)(以干质量计)最高、枯水期(2.87×104~4.19×106 copies/g)居中、丰水期(1.29×103~2.04×104 copies/g)最低,说明浑河底泥中M. oxyfera-like的丰度亦存在一定的季节性差异.      

西湖底泥中的反硝化型甲烷厌氧氧化菌的分子生物学检测

反硝化型甲烷厌氧氧化反应(Denitrifying anaerobic methane oxidation,DAMO)是一种最新发现的生物反应,该反应能够偶联反硝化和甲烷的厌氧氧化.催化DAMO反应的微生物是NC10门中一种被命名为“Candidatus Methylomirabilis oxyfera”的细菌.本研究采用基因克隆文库技术考察了西湖淡水底泥中DAMO微生物的分布与种群多样性状况.16S rRNA基因系统发育分析表明,西湖底泥中存在NC10门细菌,与已知的M.oxyfera的16S rRNA基因相似度为93％～98％.DAMO微生物功能基因(pmoA)的系统发育分析进一步证实了西湖底泥中分布有此类微生物,与已知的Moxyfera的pmoA基因相似度为86％ ～ 95％.实时定量PCR结果表明,西湖底泥中DAMO微生物的16S rRNA基因的拷贝数为2.15 ×105 copies·g-1(以干重计).     

菌渣与化肥配施对稻田土壤微生物群落组成及多样性的影响

菌渣是一种独特而丰富的有机物料,与化肥配施不仅能改良土壤质量还可以调控微生物群落.然而,土壤细菌和真菌对菌渣与化肥配施的响应是否一致仍不清楚.在水稻田间长期定位试验条件下,设置化肥水平(C)0%、 50%和100%,菌渣相对用量(F)0%、 50%和100%各3个水平,共9个处理,对土壤肥力与微生物群落的相关指标进行测定.结果表明,土壤全氮(TN)在C₀F₁₀₀处理中最高,碳氮比(C/N)、全磷(TP)、可溶性碳(DOC)和有效磷(AP)在C₁₀₀F₁₀₀处理中最高,土壤有机碳(SOC)、碱解氮(AN)、速效钾(AK)和pH在C₅₀F₁₀₀处理中最高,较对照分别增加了55.56%、 26.18%、 26.46%、 17.13%、 279.54%、 85.57%、 41.61%、 29.33%和4.62%.菌渣与化肥配施后,不同处理土壤细菌和真菌α-多样性存在显著变化,与对照C₀F₀处理相比较,各处理细菌β-多样性...     

典型稻田土壤真菌群落结构及多样性对比

为了解中国主要稻作区内不同母质发育的稻田土壤真菌群落结构和多样性差异,本研究选取由砖红壤、红壤、盐碱土、黑土和紫色土发育而来的5种中国典型稻田土壤为研究对象,利用高通量测序技术对土壤真菌群落组成及多样性进行对比分析.结果表明：5种典型稻田土壤的含水量、pH值、盐度及容重差异显著（P<0.05）;从Chao1指数来看,稻田土壤真菌群落丰度红壤型 > 黑土型 > 砖红壤型 > 紫色土型 > 盐碱土型.从ACE指数来看,群落丰度黑土型 > 红壤型 > 砖红壤型 > 紫色土型 > 盐碱土型.Shannon指数和Simpson指数均表现为群落多样性黑土型 > 紫色土型 > 红壤型 > 砖红壤型 > 盐碱土型;5种典型稻田土壤真菌门水平相对丰度最高的均是子囊菌门（Ascomycota）;砖红壤型和红壤型稻田土壤的优势真菌属为翅孢壳属（Emericellopsis）,紫色土型稻田土壤的优势真菌属为翅孢壳属、枝鼻菌属（Cladorrhinum）和柄孢壳属（Zopfiella）,黑土型稻田土壤的优势真菌属为翅孢壳属和明梭孢属（Monographella）,盐碱土型稻田土壤的优势真菌属为瓶头霉属（Phialocephala）;石黄衣属（Xanthoria）、Cyberlindnera、青霉菌属（Penicillium）和Westerdykella的相对丰度与土壤pH值呈显著负相关（P<0.05）,Ceroophora的相对丰度与土壤含水量呈极显著负相关（P<0.01）;帚枝霉属（Sarocladium）的相对丰度与可溶性有机碳呈极显著正相关（P<0.01）.以上研究表明,稻田真菌的群落结构和多样性受稻田开垦前土壤类型的影响,真菌物种丰度和优势菌种类型对土壤理化性质变化的响应较为敏感.     

浑河底泥反硝化厌氧甲烷氧化菌群落多样性的时空分布特征及其与环境因子关系分析

为了解浑河底泥中反硝化厌氧甲烷氧化菌——Candidatus Methylomirabilis oxyfera(M.oxyfera)群落多样性的时空分布特征,通过克隆文库技术考察M.oxyfera的16S rRNA和pmo A功能基因的多样性时空分布特征,并结合多元直接梯度分析来研究环境因子(水样和底泥的理化性质)与其之间的关系.9月浑河上、中、下游底泥样品中M.oxyfera的16S rRNA基因的OTU数在2~5之间,Shannon-Wiener多样性指数变化范围为0.21~1.4,呈现出中游上游下游的分布特征.pmo A功能基因上游的OTU数和Shannon-Wiener多样性指数明显高于中游和下游,上游的Shannon-Wiener多样性指数分别是中游和下游的3.5倍和2.3倍,因此M.oxyfera的群落多样性呈现出明显的地域性分布特征.3号采样点处3月采集样品中M.oxyfera的16S rRNA和pmo A的OTU数目分别是6和5,明显高于9月对应的OTU数目,Shannon-Wiener指数也明显比9月高(1.40.68;1.570.00),因此M.oxyfera的群落多样性呈现出明显的季节分布特征.多元直接梯度分析结果表明底泥中DOC浓度、底泥电导率、水体中TOC含量和水体中亚硝酸氮浓度是影响M.oxyfera群落多样性的主要环境因子.     

稻田土壤氧化亚氮产生潜势、反硝化功能基因丰度和群落结构的垂向分布

土壤中氧化亚氮（N₂O）的释放量占全球N₂O释放总量的60%.其中，稻田土壤是N₂O最主要的释放源.反硝化过程是稻田土壤N₂O生成的主要微生物过程之一.本研究选取广东韶关稻田垂向土壤（0~100 cm）为研究对象，通过乙炔抑制剂法测定了N₂O产生潜势和反硝化潜势，并利用针对特异性功能基因的实时荧光定量和高通量测序技术分别分析反硝化功能基因丰度和反硝化微生物群落结构.结果显示：0~10 cm深度的土壤样品N₂O产生潜势最高，可达（0.020±0.0035）μg·g^-1·h^-1.反硝化功能基因中，nirK基因的丰度峰值（（1.51±0.0015）×10⁸ copies·g^-1）出现在0~10 cm深度，而nosZ和nirS基因的丰度峰值（（4.29±0.0015）×10⁷ copies·g^-1和（8.86±0.0010）×10⁷ copies·g^-1）均出现在10~20 cm深度.稻田垂向土壤中N₂O产生潜势和相关的反硝化功能基因（nosZ、nirK和nirS）丰度均随土壤深度的增加而逐渐降低.其中在所有深度的土壤样品中nirK基因的丰度均高于nirS.基于nirK基因的高通量测序结果发现慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）的相对丰度最高（44.06%±6.14%，n=6）.相关性分析表明，稻田土壤中N₂O产生潜势与环境因子（TN、TC和含水率）、反硝化功能基因丰度以及慢生根瘤菌（Bradyrhizobium），罗河杆菌属（Rhodanobacter）和亚硝化螺菌属（Nitrosospira）的相对丰度呈正相关.上述结果表明稻田土壤中环境因子和反硝化功能基因丰度影响了N₂O产生潜势的垂向分布.     

硫自养反硝化与厌氧氨氧化耦合工艺中微生物群落结构和多样性研究

为研究基于硫自养反硝化和厌氧氨氧化耦合工艺中微生物群落结构和多样性特征,从稳定运行的HABR厌氧折流板反应器中采集生物膜样品,利用PCR-DGGE技术分别对反应器中4个格室进行群落结构解析。结果表明,微生物群落变化与水质环境中的有机物、氮和硫的浓度有关,微生物群落结构在不同的格室中变化较大,4个格室中的细菌的Shannon-Wiener指数(H)由左至右依次减小,相邻格室的相似性较高。经过克隆测序分析,HABR反应器内的微生物多为硫自养反硝化菌和厌氧氨氧化菌,并且出现了Sulfurimonas菌种,该类菌种是同步脱硫反硝化作用的主要功能菌,它们对污水中硫及氮的去除发挥了重要的作用。     

厌氧氨氧化细菌和反硝化厌氧甲烷氧化细菌在岸边带土壤中的分布规律

厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation,anammox)和反硝化厌氧甲烷氧化(nitrite-dependent anaerobic methane oxidation,n-damo)的发现打破了人们长久以来对生物氮、碳循环的传统认识.厌氧氨氧化细菌(anammox bacteria)和反硝化厌氧甲烷氧化细菌(n-damo bacteria)在水生态系统均有分布,并且在全球氮、碳循环中发挥重要作用.但它们在岸边带土壤中的存在和分布还不甚清楚.因此,本文对湖泊岸边带土壤中厌氧氨氧化细菌和反硝化厌氧甲烷氧化细菌的存在和分布进行了研究.基于厌氧氨氧化细菌hzs B基因(联氨合成酶关键基因)和M.oxyfera-like细菌16S rRNA基因的序列分析,分别证明了厌氧氨氧化细菌和M.oxyfera-like细菌在白洋淀湖泊岸边带深层土壤中的共同存在.厌氧氨氧化细菌hzs B基因定量PCR结果显示,其主要分布在地下水位附近及以下部分(40~100 cm),而在表层(0~40 cm)土壤中未被检测到.M.oxyfera-like细菌16S rRNA基因定量PCR结果显示,不同深度的土壤均有M.oxyfera-like细菌分布,并且其丰度随着土壤深度的增加而递增.这些结果说明厌氧氨氧化细菌和M.oxyfera-like细菌在湖泊岸边带深层土壤中共同存在,并且有不同的分布规律.     

稻田硝酸盐异化还原成铵细菌群落结构的垂向分布特性

硝酸盐异化还原成铵（Dissimilatory nitrate reduction to ammonium，DNRA）过程，可将土壤中的NO₃^-/NO₂^-还原成NH₄⁺-N以被作物吸收利用，有助于土壤中氮素的保存.选择位于广东韶关市和吉林安图县的两块稻田为研究对象，通过分子生物学方法和高通量测序技术，深入探究了两种稻田土壤（0~1 m）中DNRA细菌丰度和群落结构的垂向分布特性.结果显示：两种稻田土壤中DNRA细菌更多的存在于表层土壤（0~20 cm）中，丰度最低值均出现在深层土壤（90~100 cm）中，且表层样品群落结构的多样性大于深层样品；两个稻田样品间的群落结构体现出明显的空间异质性，安图稻田样品DNRA细菌的丰度和群落结构多样性均大于韶关稻田样品；其中，相对丰度较高的Anaeromyxobacter（28.67%）、Caldimicrobium（19.49%）、Nitrospira（10.90%）和Chthoniobacter（9.15%）是两个稻田中DNRA细菌群落组成中的关键菌属.相关性分析表明，总硫（TS）、有机质（TOM）、含水率（MC）、碳氮比（C/N）与DNRA细菌丰度之间均有显著正相关性（p<0.01，n=20），偏碱性、有机质丰富、氮源缺乏、碳源丰富且C/N较高的环境及适宜的含水率是稻田垂向生态系统中DNRA细菌适宜的生存环境.     

炉渣与生物炭施加对稻田土壤铁还原菌群落结构及甲烷排放影响

为了探究炉渣及生物炭施加处理对稻田土壤铁还原菌群落结构及甲烷排放的影响,在福州某平原稻田中分别进行施加生物炭、炉渣、生物炭+炉渣3种处理,测定早、晚稻生长期稻田甲烷排放通量和可培养铁还原菌数量,并比较施加处理与不施加处理稻田土壤铁还原菌群落结构组成之间的差异.结果表明：废弃物施加能够改变稻田土壤铁还原菌数量,晚稻生物炭施加组的铁还原菌数量显著高于其他3组（P<0.05）;废弃物施加在一定程度上抑制了稻田土壤甲烷的排放,其中早稻混合施加组对甲烷排放的降低作用最为明显;福州平原稻田土壤中铁还原菌种类丰富,分布于10个门,其中厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为优势菌门相对丰度占比之和大于95%.共鉴定出20个属,其中相对丰度较高的菌属为芽孢杆菌属（Bacillus）、厌氧粘细菌属（Anaeromyxobacter）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）等10个属,占样品中已知铁还原菌属的62.07%~66.58%;生物炭和炉渣主要通过改变土壤pH值及含水量影响稻田土壤铁还原菌群落结构,混合施加的影响比单一施加更为显著;芽孢杆菌属（Bacillus）的相对丰度与稻田土壤甲烷的排放通量呈显著负相关,是稻田中抑制甲烷产生与排放的主要铁还原菌属.     

CO2封存泄漏的稻田土壤细菌监测指标筛选研究

为研究CO₂地质封存过程中CO₂泄漏对水稻及稻田土壤的风险影响,利用CO₂模拟泄漏平台,研究了不同CO₂泄漏速率下水稻生长、稻田土壤性质与土壤细菌组成及多样性的变化特征.结果表明：随着CO₂泄漏速率的增加,稻田土壤pH显著降低,电导率显著增加,水稻生长受到明显抑制;稻田土壤细菌的丰富度指数和多样性指数均有增加,均匀度指数有所降低.CO₂泄漏显著改变了稻田土壤细菌组成,稻田土壤的优势菌门中变形菌门、拟杆菌门与绿弯菌门的相对丰度总体降低,而酸杆菌门与放线菌门的相对丰度总体升高;稻田土壤优势菌属中RB41、MND1、厌氧粘菌属及鞘脂单胞菌属的丰度总体升高,而硝化螺旋菌属的丰度总体降低;稀有细菌中CO₂泄漏下全部出现的有粘胶球形菌门、柔膜菌门及双头菌属、硫杆菌属,CO₂泄漏后全部消亡的为假单胞菌属.建议将变形菌门的减少和酸杆菌门的增加,以及RB41、MND1及厌氧粘菌属的增加作为稻田土壤CO₂泄漏监测的推荐指标.     

长期施肥对稻田不同土层反硝化细菌丰度的影响

为了探讨长期施肥对稻田不同土层关键反硝化功能种群丰度的影响及核心驱动因子,以湖南宁乡长期施肥定位试验田为平台,选取不施肥（CK）、全量化肥（NPK）和秸秆还田（ST）3个处理,结合实时荧光定量PCR（qPCR）技术,系统分析了稻田不同土层（0~10,10~20,20~30,30~40cm）关键反硝化功能基因（narG、nirK和nirS）的丰度及其与土壤理化性质的内在联系.结果表明,相比于不施肥处理（CK）,施肥处理（NPK和ST）在0~40cm土层土壤SOC、TN、NO₃^--N、NH₄⁺-N和Olsen-P分别显著增加了2.2%~83.6%,3.5%~58.3%,70.8%~222.1%,0.9%~83.7%和16.5%~94.5%,pH值下降了0.31~0.67个单位;长期施用化肥和秸秆使narG、nirK和nirS基因丰度分别增加0.75~7.18倍,1.57~3.02倍和0.53~3.81倍,其中秸秆还田对反硝化细菌数量的影响比单施化肥更显著;稻田narG、nirK和nirS反硝化型细菌的丰度随土层深度增加而逐渐降低,具有明显的垂直分布特征;RDA分析结果显示,土壤养分如SOC和TN是影响水稻土narG、nirK和nirS反硝化型细菌垂直分布的关键因子,而pH值是调控反硝化细菌在稻田底土分布的核心驱动因子.研究结果可为提升稻田土壤肥力和减少稻田氮素损失和温室气体排放提供理论依据.     

水田土壤细菌群落对不同重金属污染水平的响应分析——以A县为例

重金属污染问题长期存在于土壤环境中,并对土壤细菌群落结构造成了较大影响,从而引起了广泛的研究.本文选取水田土壤为测试样本,通过高通量测序技术和土壤性质化验对样本进行处理,采用Spearman相关性分析等统计分析方法对不同重金属污染水平下的水田土壤细菌群落进行结构和多样性分析.结果显示,研究区内土壤样点的重金属污染水平可被划分为4个等级,其中,轻度重金属污染水平(LL)区域土壤细菌群落的多样性指数总体上显著低于其他区域,即轻度污染的环境将降低该区域的细菌群落多样性.Nitrospira和Candidatus_Solibacter等菌属在重度重金属污染水平(SL)区域中显示出较强的重金属耐受性.Proteobacteria、Firmicutes和Gemmatimonadetes等菌门在不同等级重金属污染水平区域中表现出一定的耐受性.此外,土壤含水量(SWC)、酸碱度(pH)、速效磷(AP)、有效钾(AK)、总氮(TN)、有机质(OM)、铜(Cu)、铅(Pb)、砷(As)和锌(Zn)等土壤环境因子与细菌群落结构存在显著相关性(p0.05).因此,应该尽快开发利用这些具有重金属耐性和生物修复功能的微生物,为粮食作物的健康生长提供适宜的土壤环境.     

多元复合调理剂对镉砷污染农田土壤微生物群落结构的影响

通过温室盆栽试验,研究多元复合调理剂(石灰石、铁粉、硅肥和钙镁磷肥,简称LISP)对土壤基本理化性质、Cd和As的生物有效性和微生物群落结构的影响.结果 表明,LISP可改变土壤基本理化性质,降低土壤有效态Cd和As含量,并改变土壤微生物群落结构.在0.4％的LISP添加下,土壤pH值、有效磷和总磷含量较CK处理分别显...     

低温高海拔湖泊岸边带厌氧氨氧化菌的存在、生物多样性及活性——以天山天池为例

本文旨在通过聚合酶链反应PCR、构建克隆文库、15N同位素示踪等技术研究厌氧氨氧化细菌在以天山天池为代表的高海拔低温水生态系统中的存在、发生、活性及对氮循环的影响.通过定量PCR测得天山天池沉积物厌氧氨氧化菌的丰度为(2.93×105±0.25×105)copy/每克干沉积物土样,证明了存在有一定数量的厌氧氨氧化菌;在分别对厌氧氨氧化细菌的16S rRNA和hzs B功能基因构建克隆文库,并对阳性克隆进行生物多样性分析,发现天山天池沉积物中16S rRNA阳性克隆子均属于同一个独立操作单元,与已知的厌氧氨氧化菌的相似度高于99%;而hzs B功能基因克隆文库中,其生物多样性略高于16S rRNA文库.通过同位素示踪技术测得该样品的厌氧氨氧化速率为1.162 nmol·g-1·h-1,其对氮气生成的贡献率高达82%,远高于以往报道的淡水环境中厌氧氨氧化对氮气生成的贡献率.推断高海拔和低温等环境可能不是限制厌氧氨氧化细菌生长的关键因素.