脱色酶TpmD在大肠杆菌中的高效表达及纯化

用PCR方法从嗜水气单胞菌DN322基因组中扩增出编码三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD的基因,与表达载体pET-22b(+)连接构建成重组质粒pET22-tpmD,转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组工程菌株.结果表明,经IPTG诱导,脱色酶基因可高效表达,粗酶液降解结晶紫、孔雀石绿、碱性品红、灿烂绿的比活力达到569.5,386.9,516.1,273.0U/g.表达产物经Ni-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度达94.05%.对4种染料的比活力分别达到1075.3,1042.8,903.9,484.3U/g,重组质粒稳定存在于工程菌中,便于规模化发酵生产.     

蜜环菌漆酶对蒽醌类染料的脱色条件优化

利用蜜环菌发酵所得的漆酶,直接对印染工业中常见的两种蒽醌类染料活性艳蓝KN-R和活性艳蓝X-BR进行催化脱色实验,得出了最佳脱色条件.结果表明,活性艳蓝KN-R最适脱色温度为30℃,最适染料浓度为80 mg.L-1,最适酶量为0.25U.mL-1,最适pH值为5,在最优条件下活性艳蓝KN-R最高脱色率达90%以上.活性艳蓝X-BR的最适脱色温度为30℃,最适染料浓度为50 mg.L-1,最适酶量为0.5 U.mL-1,最适pH值为4,在最优条件下活性艳蓝X-BR最高脱色率达70%以上.本研究利用蜜环菌粗漆酶液直接对印染工业中常见蒽醌类染料进行脱色,结果表明蜜环菌粗漆酶液具有良好的脱色效果,蜜环菌漆酶在印染工业染料废水脱色方面具有潜在的应用价值.     

醌还原酶 醌类化合物对偶氮染料脱色的作用

外加醌类化合物作介体,利用细菌胞内的醌还原酶考察基因工程菌Escherichia coli YB对偶氮染料的脱色能力,以及甲基氢醌预处理对E. coli JM109和厌氧污泥脱色的影响.结果表明,介体2羟基1,4萘醌（lawsone,LQ）的存在对胞内过量表达醌还原酶AZR的E. coli YB的脱色能力有显著的促进作用,0.2 mmol·L^-1 LQ存在下,苋菜红（1 mmol·L^-1）在2 h内可脱色75%.LQ存在时E. coli YB对高浓度的染料也有脱色效果,8 h可使苋菜红（5 mmol·L^-1）脱色50%左右.与LQ相比,甲萘醌作为介体对脱色的促进效果较差,2.5 mmol·L^-1甲萘醌存在下脱色70%需12 h.LQ存在时E. coli YB对苋菜红的重复脱色能力稳定,12 h内能完成4次重复脱色.LQ的存在对于结构较复杂的2种偶氮染料酸性大红GR和活性艳红K2BP的脱色也有促进作用,在最适LQ浓度下,分别在9 h和30 h脱色70%.甲基氢醌预处理对E. coli JM109和厌氧污泥的脱色能力都有促进作用.预处理后在LQ存在下,E. coli JM109在5 h可脱色苋菜红（1 mmol·L^-1）80%左右,而污泥可在11 h脱色75%以上.     

菌糠过滤处理染料溶液研究

探讨了用菌糠过滤处理染料溶液可行性。结果表明,菌糠对孔雀石绿、亚甲基蓝脱色率分别达到99%和96%以上,刚果红脱色率达到80%以上,溴酚蓝脱色率较低,在50%左右,混合染料溶液过滤不影响染料脱色。不同pH特性的染料溶液过滤后接近中性,菌糠对染料污染体系的pH有调节作用;菌糠过滤重复使用8次以上仍可保持相应的特性,初步说明菌糠过滤可以作为染料废水处理或预处理方法。     

亚剂量抗生素诱导抗性基因水平迁移

为探究亚剂量抗生素诱导下编码广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBL)基因的接合转移(conjugation),使用从新加坡主要医院的废水中直接分离的可合成ESBL的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)菌株作为ESBL编码质粒的供体,以携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的耐氯霉素(chloramphenicol,CHL)大肠杆菌SCC1(E.coli SCC1)作为受体,借助响应面分析,检测并分析了携带有ESBL编码基因的质粒在亚剂量水平的四环素(tetracycline,TC),磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole,SMZ)和头孢他啶(ceftazidime,CAZ)单一暴露和共同暴露时,从供体菌株接合传递至受体菌株的特征.结果发现,ESBL编码质粒可在无诱导抗生素胁迫下,以平均0.001 5和0.004 2的频率分别由铜绿假单胞菌和大肠杆菌供体接合转移至受体大肠杆菌SCC1菌株,具有较低的"适应性代价",并在质量浓度低于最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的抗生素暴露下更易在大肠杆菌菌株之间传递.大肠杆菌菌株之间的接合转移显著发生在质量浓度低于0.03 mg·L~(-1)的TC与质量浓度低于0.002 mg·L~(-1)的CAZ单一暴露或共同暴露时,并可被亚MIC的TC显著抑制.铜绿假单胞菌与大肠杆菌间的接合转移可在5倍MIC的TC、CAZ共同暴露时被显著诱导,未检测到亚MIC水平抗生素对其的促进作用.     

偶氮染料废水的生物脱色研究进展

对偶氮染料脱色的厌氧以及好氧生物方法进行了综述,内容包含偶氮还原酶的分析、纯化和脱色动力学研究,以及编码偶氮还原酶基因的克隆表达,和表达所得酶与原始酶的活性以及动力学的对比研究方面。     

DTT对三苯基甲烷染料脱色的研究

研究了二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)对三苯基甲烷染料的还原脱色作用.以孔雀石绿为代表,优化了反应体系中DTT的用量,目的是考察孔雀石绿和DTT之间的定量关系,并明确DTT对孔雀石绿的脱色能力.分析了反应体系pH值对DTT还原力的影响.结果表明,在pH值>5的反应体系中,平均每1 mol DTT可在1 min内脱色4 mol孔雀石绿,脱色率高达97%.脱色产物经HPLC分析表明,孔雀石绿被DTT还原脱色为隐色孔雀石绿.隐色孔雀石绿可继续与氧化态的DTT结合成为水不溶性的络合物,形成白色沉淀.DTT对结晶紫、灿烂绿及碱性品红的脱色作用均达到85%以上,以此确定DTT是一类广谱的三苯基甲烷类染料脱色剂.     

刺芹侧耳对孔雀石绿的脱色降解及其产物分析

以白腐真菌刺芹侧耳(Pleurotus eryngii-Co007)为染料脱色菌株,研究三苯甲烷染料孔雀石绿的浓度、脱色p H、脱色温度及脱色时间对染料脱色的影响,并对降解产物进行紫外-可见吸收光谱分析、红外光谱分析、GC-MS分析和植物毒性实验,以揭示孔雀石绿可能的降解路径及其产物毒性.结果表明:在p H 6、30℃条件下,P.eryngii-Co007脱色降解200 mg·L-1孔雀石绿,9 h脱色率可达98.22%;孔雀石绿的降解产物主要包括4-(二甲氨基)二苯甲酮、4-(甲氨基)二苯甲酮和4-氨基二苯甲酮;推测孔雀石绿可能的降解路径为孔雀石绿中心碳的羟基化反应,随后中心碳迅速发生碳-碳键断裂,产生4-(二甲氨基)二苯甲酮,4-(二甲氨基)二苯甲酮经过两个连续的N-去甲基化过程,分别产生4-(甲氨基)二苯甲酮和4-氨基二苯甲酮;植物毒性实验表明,P.eryngii-Co007对孔雀石绿有较好的脱毒作用.综上,P.eryngii-Co007能高效脱色降解高浓度的孔雀石绿,同时可显著降低染料对植物的毒害作用.     

嗜吡啶红球菌多氯联苯降解基因的克隆与表达

建立了多氯联苯/联苯降解菌嗜吡啶红球菌 R04 的基因组文库.活性筛选得到 1 个18kb的阳性片断,内含 1个 921个核苷酸的新的开环酶2,3-二羟基联苯双加氧酶基因 bphC2,该基因能够在大肠杆菌中表达,其蛋白分子量约为34kDa.此外,在该基因上游39bp处还发现另外一个 2,3-二羟基联苯双加氧酶基因 bphC1 的部分序列.     

基于荧光传感器Frex的特性检测水质环境中生物毒性物质

发光菌作为水环境生物毒性监控的有效手段,近年来越来越得到重视.本实验利用基因工程技术,将Frex荧光蛋白重组到大肠杆菌中,并通过测定菌体内NADH水平所引起的荧光强度变化,来监测水体中有毒物质对微生物代谢的影响,从而实现实时毒性监控.实验完成了Frex荧光蛋白在大肠杆菌中的正确表达,研究了培养温度、诱导时间及IPTG浓度等不同条件对Frex融合蛋白表达量和荧光活性的影响.将此重组荧光发光菌初步应用于环境水体中有毒物质的检测研究,选取氯化汞、苯酚、重铬酸钾、硫酸锌等4种国际荧光发光菌生物毒性检测标准物质进行检测,结果表明毒性物质均能对菌体的荧光产生一定的催灭作用.该毒物测试手段分别具有反应速度快和灵敏度高等特性.同时,实验优化了该重组菌应用于生物毒性检测试验的条件,为后续的应用研究提供了一定的实验基础,拓展了荧光发光菌在其他方面的适用范围.     

斑马鱼基因组随机扩增DNA多态性研究

采用随机扩增DNA多态性（RAPD）技术，对毒性试验的模式生物斑马鱼（Danio rerio）基因组进行了分析。结果显示，在Amersham Pharmacia公司随机扩增引物系列中，分别在01号引物的829bp、534bp，02号引物的572bp，及06号引物的495pb，各出现1条稳定条带，而环磷酰胺作用后的斑马鱼基因组DAN随机扩增产物中，缺少了部分稳定条带。这可以明确判定受试斑马鱼的基因发生了改变，为水环境遗传毒性效尖的研究提供了初步的数据基础。     

Prenatal detection of an Arg→Ter mutation at codon 111 of the pah gene using DNA amplification

A CGA→TGA mutation at codon 111 in exon 3 of the phenylalanine hydroxylase (PAH) gene was recently identified in a Chinese phenylketonuria (PKU) patient. This paper reports the prenatal diagnosis of a Chinese fetus at risk for PKU using DNA amplification with PCR and oligonucleotide hybridization. RFLP analysis revealed that the fetus had inherited a PKU gene from his mother, but his paternal PAH gene was uninformative. PCR amplification of 300 bp which included exon 3 plus the flanking intronic sequences of the PAH gene was performed. The amplified DNA was hybridized with a pair of allele-specific oligonucleotide probes. The results indicated that the fetal DNA carried a PAH 111 Arg→Ter mutant gene inherited from his father. Thus, the fetus was predicted to be affected with PKU.     

镍钴转运酶NiCoT基因的克隆表达及基因工程菌对镍离子的富集

利用PCR技术从Staphylococcus aureus/ ATCC6538基因组中扩增出大小为1?053 bp的镍钴转运酶基因NiCoT gene,将其连接到pET-3c载体上构建重组质粒,并转化至E.coli BL21.筛选阳性菌并经酶切分析和PCR扩增双重鉴定.核苷酸序列测定及分析结果与GenBank中报道的同类基因相似性高达97%以上,表明其具有正确的NiCoT基因核苷酸序列.重组菌的SDS-PAGE结果图谱中,在相对分子量为39?000附近有特异性蛋白条带,大小符合预测值,表明NiCoT基因在E.coli BL21中成功表达.基因工程菌在IPTG用量为1.00 mmol·L^-1,诱导时间为4 h的条件下培养对镍离子的富集能力最高.在不同镍离子浓度时,基因工程菌对溶液中Ni²⁺的平衡富集量为11.33 mg·g^-1,与原始宿主菌相比提高了3倍.对基因工程菌吸附镍和钴的实验表明,Staphylococcus aureus ATCC6538的NiCoT对镍具有较高的特异性和富集容量,属于第Ⅲ类镍钴转运酶.     

假单胞菌的氯儿茶酚1,2-双加氧酶基因的克隆和表达

 从土壤中分离得到1株降解2,4-二氯酚(2,4-DCP)能力较强的细菌菌株GT241-1,克隆了该菌株的3,5-二氯儿茶酚1,2-双加氧酶基因(dcpB),采用的克隆策略为:用Southern杂交对dcpB进行定位后,构建重组质粒,再用斑点杂交从重组质粒中筛选目的转化子.经序列测定得知dcpB亚克隆片段全长4303bp,其中dcpB基因编码区765bp.核苷酸和推测的氨基酸序列分析表明,dcpB与已在GenBank登记的相关基因有一定的差异.dcpB基因能够在大肠杆菌转化子中成功地表达有生物活性的酶.     

诺卡氏菌株C-14-1中腈水解酶基因的鉴定、测序及分析

从腈纶废水中分离到高效降解多种污染物的诺卡氏菌株C-14—1,并对该菌中腈水解酶的基因进行鉴定和测序．利用红球菌中腈水解酶氨基酸保守区设计核苷酸引物,以菌株C-14—1的总DNA为模板,PCR扩增发现一条预期大小的DNA带．Southern杂交显示基因组中存在一个腈水解酶基因．进一步构建基因文库和菌落原位杂交,克隆到一个约4．5kb的DNA片段．DNA序列测定和分析表明,该DNA片段携带长度为1143bp的腈水解酶基因．比对分析表明,该基因与国际上发表的红球菌和诺卡氏菌中的腈水解酶基因高度相似．     

Genetic basis of lethal junctional epidermolysis bullosa in an affected fetus: Implications for prenatal diagnosis in one family

Fetal skin biopsy at 20 weeks' gestation in a woman at risk for a child with the lethal skin-blistering disorder junctional epidermolysis bullosa (Herlitz) confirmed an affected fetus. Genomic DNA from the aborted fetus was examined for mutations in laminin 5, a macromolecule involved in adhesion at the dermal-epidermal junction, and a candidate protein in this condition. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of exon 10 and parts of the flanking introns of the gene encoding the β3 chain of laminin 5 (LAMB3) and subsequent analysis by agarose gel electrophoresis showed a more slowly migrating band in the affected fetus compared with the normal control. Nucleotide sequencing of the abnormal PCR product revealed a homozygous 77 bp duplication within the exon, resulting in a premature termination codon 250 bp downstream from the 3′ end of the duplication. Maternal DNA was heterozygous for the mutant and wild-type alleles. These findings illustrate the genetic basis of the skin disease in this case and also offer the prospects of a simple, rapid, and reliable first-trimester DNA-based prenatal, or even preimplantation, diagnostic test for future pregnancies in this family.     

固态发酵过程中微生物总DNA提取方法比较

为了分析固态发酵过程中微生物群落的多样性及演替情况,对比研究了从固态发酵中提取细菌和真菌DNA的3种方法--溶壁酶法、超声波法、液氮研磨 CTAB法.使用紫外分光光度计测定了由不同提取方法得到的DNA的产量与纯度;使用细菌16S rDNA基因通用引物(341F和907R)和真菌18S rDNA基因通用引物(NU-SSU-0817和NU-SSU-119)对DNA进行了PCR扩增;采用DGGE(变性梯度凝胶电泳)法对固态发酵中细菌和真菌的多样性进行了分析.结果显示,3种方法得到的粗提和纯化DNA长度均约为23 kb;细菌和真菌PCR产物长度分别约为586 bp和422 bp.细菌和真菌PCR产物的DGGE分析表明,3种方法提取的DNA所反映的微生物多样性比较一致;但紫外分光光度计测定结果表明溶壁酶法提取固态发酵中微生物总DNA产量最高,超声波法次之,液氮研磨 CTAB法最低.     

Phaeocystis globosa核糖体大亚基(28SrDNA)的序列分析与分类学意义

对一株Phaeocystisglobosa的28SrDNA基因序列测定,共得到碱基大小为1795bp的两个序列片段,其中序列一的长度为970bp,序列二的长度为825bp。将Ph.globosa与Ph.antarctica和Prymnesiumpatelliferum同源序列进行对比,发现Ph.globosa与Ph.antarctica仅在序列二中有一个碱基插入/缺失,同源性为99.99%,而与Pr.patelliferum相比,有7处插入/缺失,碱基总变异率为6.13%;研究发现序列一中有一个比较明显的高度保守区和两个高变区;序列二中有两个比较明显的高变区、一个保守区和一个高度保守区。对28SrDNA基因RNA二级结构分析发现,DNA序列保守区在RNA二级结构上也非常保守,与DNA序列分析结果一致,都证明28SrDNA基因只适用于种以上水平的分类研究,不宜用于种间和种下水平的研究。