荧光原位杂交法检测反应器中聚磷菌实验条件优化及应用

文章简要介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的基本原理和操作步骤。通过正交试验筛检荧光原位杂交（FISH）技术在检测反应器中聚磷菌时的最佳及适合的实验条件。结果显示,样品预处理较优的条件为：样品在固定前应先经过1×PBS清洗两次,37℃热固定3h,乙醇脱水3min;FISH技术检测反应器中聚磷菌的最佳实验条件为：杂交温度46℃,杂交时间2h,清洗缓冲液中NaCl浓度70 mmol/L。FISH技术检测反应器样品中聚磷菌与传统检测方法相比具有快捷、简便、淮确的优点,在研究环境微生物方面有较好的应用前景。     

微丝菌(Microthrix parvicella)原位荧光杂交(FISH)定量过程的条件优化

微丝菌(Microthrix parvicella)是世界范围内诱发活性污泥膨胀现象的主要丝状菌之一,它在活性污泥中准确的原位定量解析对污泥膨胀现象及控制策略研究具有非常重要的意义.由于微丝菌自身的特殊生理生化性质(如表面高疏水性及较厚细胞壁)易导致常规荧光原位杂交(FISH)过程中定量结果偏低.本研究针对FISH过程中存在的探针渗透率低、荧光信号偏弱等现象,从活性污泥样品前处理、杂交过程条件等方面对Microthrix parvicella的FISH定量过程进行了优化.结果表明,在前处理使用溶菌酶(浓度为36 000 U·m L~(-1)),探针浓度为4.5 ng·μL~(-1),杂交时间延长至4 h的条件下,Microthrix parvicella的FISH定量结果可从1.12%提高至96.70%,并与定量PCR(q-PCR)结果和EikelboomJenkins法(镜检观察)定量结果更为趋近一致.     

FISH法检测生物膜中硝化细菌流程的建立及优化

通过试验筛检荧光原位杂交（FISH）技术在检测反应器生物膜中硝化细菌时适合的实验条件。结果显示,FISH技术检测生物膜中硝化细菌时．较好的预处理条件和杂交条件为：样品在热固定前不需1xPBS清洗;检测生物膜中硝化细菌的实验条件：①硝酸细菌：杂交温度46℃,杂交时间5h,洗脱液中c（NaCl）为55mmol／L;（爹亚硝酸细菌：杂交温度46℃,杂交时间3h,洗脱液中c（NaCl）为30～40mmol/L。     

基于秸秆厌氧干发酵的FISH预处理条件优化

优化了荧光原位杂交技术(FISH)定量测定秸秆厌氧干发酵基质中微生物的样品预处理条件,并在最优条件下做了验证性实验。结果表明:使用无水乙醇作为清洗液,FISH样品的荧光信号强度和丰度比用PBS清洗液(磷酸缓冲盐溶液)时有显著提高;样品预处理过程中加无菌玻璃珠震荡能提高微生物的分散度,从而提高FISH技术对秸秆厌氧发酵基质中微生物定量的准确性;采用离心转速为13 000 r/min时,微生物菌体收集率提高,而且还能保证完好的细胞形态,为后续的FISH杂交奠定基础。     

SBR工艺短程硝化快速启动条件的优化

以低COD/TN的实际生活污水为研究对象,采用SBR反应器,对短程硝化的启动条件进行了优化.结果表明,温度30℃、溶解氧(DO) 2.0mg/L、污泥龄为7d时,系统在实时控制条件下运行32周期,可以成功启动短程硝化.在总氮(TN)去除率>95%的情况下,亚硝酸盐积累率(NO2--N /NOx--N)>90%,随后的64d,温度恢复到常温(20~24℃),系统仍稳定运行.荧光原位杂交技术(FISH)检测表明,经过32个周期种群优化,污泥中氨氧化菌(AOB)的含量提高了38.9%,亚硝酸盐氧化菌(NOB)的含量降低了53.2%.在线动态控制DO浓度和曝气时间可以逐渐淘汰系统中的NOB,从而获得稳定的短程硝化,提高系统脱氮效率.     

失稳硝化膜生物反应器的性能恢复研究

对高水力负荷条件下丧失硝化功能的膜生物反应器进行恢复实验,将水力停留时间(HRT)从原来的5h延长到正常条件下可以实现完全硝化的10h后,在进水NH4+-N浓度为500mg.L-1的条件下反应器可去除99%的NH4+-N,但NO2--N出现严重积累,在60d的实验过程中NO2--N平均出水浓度为425mg.L-1.荧光原位杂交分析结果表明,氨氧化菌(AOBs)在总菌中的比例与恢复实验前没有变化,分别为12.9%(恢复实验期)和9.75%(恢复实验前),但氨氧化杆菌(Nitrosomonas)在AOBs中的比例从80%降低到40%;亚硝酸盐氧化细菌(NOBs)在总菌中的比例下降一半(从5.64%下降至2.84%),并以慢生型的Nitrospira为主.高NO2-含量和高胞外物浓度(497.1mg.L-1)可能是导致亚硝酸盐氧化功能难以恢复的主要原因.     

DO/NH4+-N实现短程硝化过程中生物膜特性

实验探究了短程硝化实现过程中生物膜特性的变化情况.采用比值控制(DO/NH+4-N)实现短程硝化,分别取亚硝酸盐积累率为10.27%、52.12%和93.54%时生物膜样品,利用荧光原位杂交(FISH)和激光共聚焦显微镜(CLSM)联用技术观察总菌、氨氧化菌(AOB)和亚硝酸盐氧化菌(NOB)数量和空间结构的变化,通过三维激发发射矩阵(EEM)观察胞外聚合物分泌和成分变化情况.比值控制成功富集AOB,并可在NOB未洗脱完全的情况下实现短程硝化.异养菌和硝化菌共存于生物膜内上,异养细菌在外层,硝化菌分布在生物膜表面6~25μm.短程硝化实现的过程中,AOB/NOB值逐步增长,稳定运行时期比值高达15.56.反应器运行过程中,EPS和微生物菌群变化息息相关.微生物活性下降,EPS分泌减少;短程硝化稳定运行时期,NOB等不耐高亚硝酸的菌群衰亡,芳香性蛋白质荧光强度降低.但三维荧光光谱显示,短程硝化实现过程中EPS化学成分变化不明显.     

启动炭管膜曝气生物膜反应器实现全程自养脱氮

启动包裹无纺布的多微孔炭管为膜组件的膜曝气生物膜反应器(MABR),实现基于短程硝化和厌氧氨氧化的完全自养脱氮.首先接种普通硝化污泥启动反应器,在温度35℃, pH为7.9条件下,通过对膜内腔压力的适当控制逐步降低反应器溶解氧浓度,实现亚硝酸盐的积累.然后再次接种厌氧氨氧化污泥,使无纺布上形成好氧氨氧化菌与厌氧氨氧化菌稳定共存的膜曝气生物膜,从而实现全程自养脱氮结果表明,经过120 d连续运行,在膜内压力为0.015MPa,水力停留时间6 h,进水NH 4-N为200 mg/L±10 mg/L条件下, NH 4-N转化率达到88.7%,出水总氮平均为48.65mg/L,总氮去除率达到83.77%.荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)分析表明,好氧氨氧化菌(AOB)和厌氧氨氧化菌作为主要功能菌群分别控制着靠近炭管膜/生物膜界面区域和靠近生物膜/液体界面区域.     

产甲烷菌和甲烷氧化菌分布对土壤-植物系统甲烷逸出的影响

CH₄(甲烷)的逸出量与产甲烷菌和甲烷氧化菌的数量密切相关.采用FISH(荧光原位杂交)技术定量解析芦苇和香蒲混栽土壤-植物生态系统基质,探讨CH₄的产生机理.结果表明,植物有利于微生物的生长,甲烷氧化菌主要聚居在植物根区,产甲烷菌数量高于甲烷氧化菌.气温变化和系统ORP(氧化还原电位)对土壤-植物生态系统CH₄排放通量的影响很大,芦苇和香蒲混栽土壤-植物生态系统CH₄年均排放通量为22.9 mg/(m2·h),最高达185.6 mg/(m2·h),排放峰值出现在夏季.表明芦苇和香蒲的生长促进了根际分泌物的产生,为产甲烷菌提供了较多生长所需的底物,从而刺激系统CH₄的排放.      

厌氧氨氧化菌的富集培养与分子鉴定

采用传统培养方法与分子生物学方法相结合,进行了厌氧氨氧化菌的分离培养与分子鉴定.富集培养以2种不同反应器的厌氧氨氧化污泥作为分离源,以亚硝酸盐与铵盐为底物.经过2 a传代培养获得2个培养系,对亚硝酸盐及铵盐具有稳定的去除能力,氨氮去除率为85%左右.通过16S rRNA克隆文库方法对培养系中浮霉菌门微生物群落结构进行了多样性解析,结果表明2个培养系中的厌氧氨氧化菌是同一种微生物,代表序列比对结果与"Kuenenia stuttgartiensis"同源性为99%.采用"K.stuttgartiensis"的特异探针对培养系进行了荧光原位杂交分析(FISH),进一步证实"K.stuttgartiensis"是培养系中的优势厌氧氨氧化菌,占总菌群数的80%～90%.对反应器中"K.stuttgartiensis"的丰度变化进行了FISH跟踪检测,发现原始接种污泥中"K.stuttgartiensis"为主要厌氧氨氧化菌,经过2 a运行该菌在污泥中的丰度由11%提高到24%.     

Immobilization of nitrite oxidizing bacteria using biopolymeric chitosan media

The effects of chitosan characteristics including the degree of deacetylation, molecular weight, particle size, pH pretreatment and immobilization time on the immobilization of nitrite-oxidizing bacteria (NOB) on biopolymeric chitosan were investigated. Nitrite removal efficiency of immobilized NOB depended on the degree of deacetylation, particle size, pH pretreatment on the surface of chitosan and immobilization time. Scanning electron microscope characterization illustrated that the number of NOB cells attached to the surface of chitosan increased with an increment of immobilization time. The optimal condition for NOB immobilization on chitosan was achieved during a 24-hr immobilization period using chitosan with the degree of deacetylation larger than 80% and various particle size ranges between 1-5 mm at pH 6.5. In general, the NOB immobilized on chitosan flakes has a high potential to remove excess nitrite from wastewater and aquaculture systems.     

游离氨对硝化菌活性的抑制及可逆性影响

为考察游离氨(FA)对硝化菌(氨氧化菌AOB和亚硝酸盐氧化菌NOB)活性的抑制影响,采用SBR反应器,基于FA与过程控制协同作用在实现短程硝化的基础上,考察了不同FA浓度(1.0,5.3,16.6,13.4,9.9,5.2,1.0mg/L)梯度下,FA对AOB和NOB活性的抑制作用及可逆性.结果表明,当FA浓度达到13.4mg/L时,系统内亚硝态氮积累率(NiAR)逐渐增加,硝态氮积累率(NaAR)逐渐减小,且NiAR/ NaAR>1时,系统实现了稳定短程硝化.在此FA浓度条件下,FA对AOB和NOB活性均产生一定的抑制作用,但相对于AOB,NOB对FA的抑制作用更加敏感.当AOB活性被短暂抑制后,其活性又迅速恢复;而NOB活性被完全抑制.此后当FA浓度又逐渐降至1.0mg/L时,AOB活性始终维持较高水平,而NOB活性尚未恢复.也即是说,在本试验控制的FA浓度条件下,FA对AOB活性的抑制作用是可逆的,而对NOB活性的抑制作用不可逆.     

盐度对硝酸细菌活性的影响及动力学特性

为分析盐度对硝酸细菌（NOB）活性的影响及其动力学特性,本文采用高浓度亚硝态氮污水富集培养NOB.对NOB富集污泥进行荧光原位杂交技术（FISH）分析表明Nitrobacter占细菌总数的（81%±6%）.污泥的最大比亚硝态氮氧化速率为（42.5±0.9）mgN/（gVSS·h）.用此污泥考察了盐度对NOB活性的影响,并测定了盐度为10g/L时NOB的动力学参数（Ko、K_S）.结果表明,与盐度为0g/L时的NOB活性相比,盐度为15g/L时NOB活性降低了3.3%;盐度为10和20g/L时的NOB活性分别降低了11%.盐度为10g/L时,NOB的最大比亚硝态氮氧化速率为（37.9±0.7）mgN/（gVSS·h）,氧的半饱和常数K_o值为（1.51±0.06）mg/L,底物（亚硝态氮）半饱和常数K_S值为（6.06±0.15）mg/L,Ko、K_S测定值均高于ASM2模型中氨氧化细菌（AOB）推荐值.盐度对NOB的抑制降低了最大比亚硝态氮氧化速率,对氧传递和底物（亚硝态氮）传递均存在影响.     

污水处理系统中硝化菌的菌群结构和动态变化

研究分析了4种不同工艺类型的城市污水处理厂中氨氧化细菌(AOB)和亚硝酸盐氧化细菌(NOB)的丰度及菌群结构.实时定量PCR结果表明4种工艺中AOB菌群的丰度范围为8.56×106~4.46×107cells/gMLSS;NOB菌群的丰度为3.37×108~1.53×109cells/gMLSS.每个工艺中Nitrospira都是优势NOB,占NOB菌群的88% 以上. A2O工艺冬季AOB和Nitrospira丰度比夏季均有所降低,这是导致冬季生物脱氮效果变差的主要原因.基于 amoA基因的系统发育分析结果显示所有的序列属于Nitrosomonas,其中Nitrosomonas oligotropha cluster 占克隆文库的60.1%,是AOB 种群中的优势菌属,Nitrosomonas-like cluster和 Nitrosomonas europaea cluster次之,分别占克隆文库的29.6%和9.1%.N. europaea cluster只在A2O工艺中出现,且在A2O工艺夏季污泥样品克隆文库中达到44.7%.低DO运行使N. europaea cluster成为优势AOB是A2O工艺夏季出现较高亚硝酸盐积累率的主要原因.研究结果证实了城市污水处理厂中优势AOB和NOB分别为Nitrosomonas和Nitrospira,硝化菌群占总菌群的1%~7%,其丰度、相对含量和菌群结构是影响硝化效果的主要因素.     

不同溶解氧间歇曝气对亚硝酸盐氧化菌的影响

为了解溶解氧对间歇曝气模式下亚硝酸盐氧化菌（NOB）种群结构的影响,在以城市污水为处理对象,以间歇曝气方式运行的SBR反应器中,检测两种主要NOB菌（Nitrospira、Nitrobacter）在低溶解氧运行时期（55d）和高溶解氧运行时期（113d）数量及结构的变化.结果表明,在低溶解氧运行时期Nitrospira的含量远高于Nitrobacter的含量,与Candidatus Nitrospira defluvii相似性较高的菌种为Nitrospira的优势菌种;而进入高溶解氧运行时期后,Nitrospira含量逐渐降低,相反Nitrobacter含量逐渐升高成为主要NOB菌群,并且其大多数菌种与Nitrobacter winogradskyi菌相似.另外,在低溶解氧运行转变为高溶解氧运行阶段出现了一定的亚硝酸积累,并在Nitrobacter成为优势NOB菌群过程中逐渐消失.     

采用FISH、DGGE和Cloning对短程脱氮系统中硝化菌群的比较分析

针对4种不同的实际污水短程生物脱氮系统(SBR大型中试反应器、UASB-A/O小型反应器、A/O中试反应器和SBR小型反应器),采用Fish、PCR-DGGE和PCR-Cloning-Sequencing分子生物学方法对系统中硝化菌群AOB和NOB进行定性与定量化分析.Fish结果表明,在4种短程脱氮系统中,AOB相比于NOB已成为明显的优势菌群,占总菌群的3%～12%;在SBR中试和小试反应器中没有检测出NOB;A/O中试反应器中存在极少量的Nitrospira(＜0.2%),而UASB-A/O小型反应器中存在极少量的Nitrobacteria(＜0.2%).PCR-DGGE结果表明SBR中试、A/O和UASB-A/O 3种短程脱氮系统中的AOB均以Nitrosomonas-like为主.SBR大型中试反应器中污泥样品的PCR-Cloning-Sequencing结果表明,所有的克隆相似于Nitrosomonas,其中60%以上的克隆相似于Nitrosomonas europaea.     

SBR法常、低温下生活污水短程硝化的实现及特性

采用序批式反应器(SBR)处理实际生活污水,通过实时控制好氧曝气时间,在常温下快速实现短程硝化,并在低温下长期维持稳定的短程硝化.结果表明,随着温度逐渐降低,比氨氧化速率略微减缓,27℃的平均比氨氧化速率是13℃时的1.68倍,但亚硝化积累率始终维持在90%以上,该温度区间内氨氧化反应的温度系数为1.051.通过荧光原位杂交(FISH)技术对低温下维持稳定短程硝化的污泥进行种群分析发现,实时控制策略为氨氧化菌(AOB)成为优势硝化菌群创造了有利条件,AOB的相对百分含量达到8%~9%,而亚硝酸盐氧化菌(NOB)逐渐被淘洗出反应器.在低温下要实现短程硝化,可首先在常温下利用好氧曝气时间实时控制实现亚硝态氮的积累和AOB的优势生长,然后通过逐渐降温使AOB适应在低温下生长.     

高氨氮废水与城市生活污水短程硝化系统菌群比较

短程硝化是污水脱氮工艺中的重要环节,系统中的菌群结构决定了其处理效果.为探讨短程硝化系统中的微生物对不同污水的适应性,利用细菌16S rDNA克隆文库、磷脂脂肪酸(PLFA)和定量PCR分析方法对高氨氮废水和城市生活污水短程硝化系统中活性污泥的细菌群落结构、总体微生物的多样性以及功能微生物进行了比较.克隆文库结果表明两个系统中细菌群落结构明显不同,城市生活污水中细菌种类更丰富,但两个系统的优势菌群都属于变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidete).磷脂脂肪酸分析结果显示高氨氮废水短程硝化系统中微生物多样性指数和均匀度指数明显低于城市生活污水.定量PCR结果表明,高氨氮废水短程硝化系统中氨氧化菌(AOB)与亚硝酸盐氧化菌(NOB)的数量都多于城市生活污水短程硝化系统;高氨氮废水短程硝化系统中AOB比NOB高3个数量级,而城市生活污水短程硝化系统中AOB比NOB高2个数量级.     

弹性填料净化受污染入湖河流的现场试验研究

利用新型弹性填料作为生物膜载体,将其直接布置在林庄港河道中,研究在不影响河流生态系统结构和使用功能的前提下,弹性填料对河流微污染水体的强化净化效果.现场试验在挂膜成功后共运行了半年.结果表明,弹性填料对氨氮的去除效果最好.它在整个运行期间对高锰酸钾指数的平均净去除率为5.4%,其中最高为9.9%;氨氮净去除率在5.35%～39.91%,总磷的净去除率最高也达到了28.6%.同时细菌学检验结果表明,高锰酸钾指数的去除率与附着在填料丝上的异养菌的数量存在正比关系;而亚硝酸菌和硝酸菌的数量也与氨氮的去除率变化相匹配.     

高浓度游离氨冲击负荷对生物硝化的影响机制

工业废水厂或含工业废水较多的城市污水处理厂,在运行过程中可能会意外受到高浓度氨氮废水急性冲击负荷的影响,造成生物硝化反应受到抑制,出水不能稳定达标.为了指导实际污水处理厂应对游离氨(FA)急性冲击负荷造成的出水不达标问题,本文探究高浓度氨氮废水对污水生物硝化系统的影响机制.本文利用序批式活性污泥反应器(SBR)处理模拟高氨氮废水,通过监测氨氮最大比降解速率、硝酸盐氮最大比生成速率、亚硝化和硝化比耗氧速率,硝化菌丰度等指标,研究高浓度氨氮废水中FA对硝化菌活性的影响规律.结果表明,FA在低浓度范围内,增加FA急性负荷能够促进硝化活性,而当FA急性冲击负荷大于一定值时,会对硝化作用造成抑制;FA浓度越大,受到抑制的硝化生物活性所需要的恢复周期越长.利用荧光原位杂交分析技术,发现当进水FA浓度(以N计)从3.6 mg·L~(-1)升高到8.1 mg·L~(-1)时,氨氧化菌(AOB)和亚硝酸盐氧化菌(NOB)菌群数量都略微升高,而当FA浓度大于8.1 mg·L~(-1)时,AOB和NOB菌群数量明显下降.FA对AOB和NOB菌群的临界抑制浓度分别为8.1 mg·L~(-1)和6.6 mg·L~(-1),NOB相对于AOB菌群更敏感.