实时荧光定量PCR技术对氨氧化细菌的研究

传统的PCR技术只能实现对核酸的定性检测而无法对其进行定量研究。随着分子生物学技术的发展,在传统PCR技术的基础上发展起来的实时荧光定量PCR技术实现了对核酸的定量研究。该技术是向常规PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,通过监测PCR反应过程中荧光信号的变化来实现对核酸的定量。实时荧光定量PCR技术具有应用范围广、灵敏度高、操作简单、工作量低等特点,在医学和微生物学领域已广泛地应用于疾病诊断、病毒定量检测、微生物群落结构分析及演替规律的研究。文章综述了该项技术的原理、特点及其在环境氨氧化细菌研究中的应用,同时也指出了该技术存在的问题及其发展应用前景。     

腺病毒气溶胶的实时荧光定量PCR检测和绿色荧光蛋白活细胞检测

将带有绿色荧光蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,作为模拟病毒建立一种检测病毒侵袭力的方法.在钢化玻璃箱中通过TK-3型微生物气溶胶发生器将腺病毒形成气溶胶,用FA-1型多级撞击式空气微生物采样器进行气溶胶采样,对采样样品分别进行实时荧光定量PCR检测和表达了绿色荧光蛋白的PK15活细胞定时检测.实时荧光定量PCR检测可测定病毒在大气中存在的相对基因拷贝数,通过在荧光显微镜下计数带绿色荧光的PK15细胞数可直观检测病毒的感染力及活力.结果表明,重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器第五级,腺病毒气溶胶与病毒粒子相比较大.     

水中轮状病毒实时定量PCR外标准品的构建

采用细胞培养和T-A克隆技术,在轮状病毒主要结构蛋白VP7基因序列上设计合成引物,经PCR扩增后将特异性产物连接入pGEM-T-easy载体中,经过酶切鉴定和测序分析获得轮状病毒cDNA标准品.利用常规PCR和实时定量PCR方法对所获得的cDNA标准品进行特异性、稳定性和重复性指标的检验.结果表明,利用此标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系(斜率为-3.353,R2=0.995);实时定量PCR熔解曲线分析表明,温度在81℃±0.5℃的PCR产物是轮状病毒VP7序列上的特异性产物,表明此标准品是轮状病毒特异性的;同时,所制备的标准品在实时定量PCR检测中具有较大的线性范围(9×100～9×1011 copies/μL,每个反应最低可以检测到9个拷贝数的轮状病毒cDNA,表明利用该标准品进行实时定量PCR分析时具有较高的检测灵敏性;此外,该标准品具有较高的稳定性和重复性(3次独立实验CV值在0.2%～0.9%之间),可长期稳定保存.构建的标准品可用作检测水环境中轮状病毒的实时荧光定量PCR的外标准品.     

荧光定量PCR技术在环境监测中的应用研究

实时荧光定量PCR是在PCR基础上发展起来的一种核酸定量技术,此技术灵敏度高,特异性强。目前也已被国内外应用在环境监测方面。如可以用此方法来监测环境中微生物在河流中随季节的变化情况,评价菌的富集情况,快速检测微生物等。随着此技术的不断发展,此方法在环境监测方面将会有广阔的应用前景。     

产毒微囊藻mcyA基因荧光定量PCR方法的建立

针对微囊藻毒素合成酶基因mcyA探索一种适用于自然水样中微囊藻毒素产毒潜能检测的TaqMan实时荧光定量PCR方法.该方法从铜绿微囊藻FACHB-1279中的mcyA基因中扩增出目的基因片段,用TA克隆方法将基因片段插入Allel TA vector (ABP-CETAVEC020)中来制备质粒标准晶.通过不同连续稀释...     

3类金属离子对活性污泥吸附水体腐殖酸的影响

研究了3类金属离子对活性污泥吸附水体腐殖酸效果的影响.结果表明,盐类金属离子(Na )、硬度金属离子(Ca2 、Mg2 )和水解金属离子(Al3 、Fe3 )均能在一定程度上提高吸附效率.作为活性污泥助凝剂,以大于10-2mol/L硬度离子的促进效果为好.加入10-2mol/L Ca2 、Mg2 48 h后溶液中的腐殖酸浓度分别为(0.64±0.17)mg/L和(2.32±0.40)mg/L,其去除率分别为98.4%和94.2%;当加入10-1mol/L Ca2 、Mg2 48 h后,其去除率均接近100%,而且Ca2 离子促进作用要优于Mg2 .盐类金属离子、硬度金属离子、水解金属离子提高活性污泥吸附腐殖酸的主要作用机理可能分别是压缩双电层、架桥作用、吸附共沉淀.同时,投加金属离子也可能使活性污泥上的吸附位性质改变或失效,对腐殖酸的吸附有一定的负面影响.     

天蓝苜蓿锌胁迫下实时定量PCR内参基因筛选

选取8个管家基因(h2a、act、18s、tub、ubi、ef1、cyp、gapdh)作为候选内参基因,以不同浓度Zn2+处理下接菌第30d的天蓝苜蓿(Medicago Lupulina L.)接种根为实验材料,筛选用于目的基因实时荧光定量PCR分析的最佳内参基因.研究表明:候选内参基因平均表达稳定性由高到低排序为:ef1>ubi>act>h2a>gapdh>cyp>18s>tub;在不同Zn2+浓度胁迫下,最适内参基因组合各不相同:Zn2+=100mg/kg时,最佳内参基因组合为tub (1.97)和ef1 (2.06); Zn2+=200mg/kg时,最佳内参基因组合为ef1 (1.41)和ubi (2.51); Zn2+=300mg/kg时,最佳内参基因组合为ef1 (1.41)和h2a (2.78); Zn2+=400mg/kg时,最佳内参基因组合为ef1 (2.45)和act (2.55).该研究可为重金属污染地天蓝苜蓿抗性基因和共生基因的表达分析提供理论依据.     

荧光定量PCR检测生物强化SBR系统中苯胺降解菌的数量变化

生物强化SBR系统中苯胺降解菌Pseudomonas otitidis strain JY9在降解苯胺废水过程中发挥重要作用.本研究根据该菌株的邻苯二酚1,2双加氧酶(C12O)的基因序列,设计特异引物,扩增特异片段并克隆到PGM-T载体中,以此重组质粒为参照,系统活性污泥中提取的总DNA为模板,应用实时荧光定量PCR方法定量检测该菌在苯胺废水生物强化SBR系统中的丰度变化.同时应用高效液相色谱法检测系统中苯胺的残留.结果表明,苯胺初始浓度在200~500 mg·L-1范围内,苯胺降解率均达到96%以上.并且SBR反应系统活性污泥中每单位(mg)MLVSS的C12O基因拷贝数随苯胺浓度的升高而显著上升,最高拷贝数达到2.7×109个,表明该菌的数量随苯胺浓度的升高而显著上升.结果显示,在苯胺去除过程中Pseudomonas otitidis strain JY9的投加能够稳定活性污泥中的MLVSS,当含有高浓度苯胺废水系统运行稳定时,该降解菌逐渐成为活性污泥当中的优势菌.     

活性污泥法对水溶性腐殖酸的去除效能与机制研究

采用人工配水的方式,研究了单级活性污泥法和两级活性污泥法对水溶性腐殖酸的去除效能,并通过测试污泥中腐殖酸的相对含量、污泥的元素组成、污泥的活性和进出水腐殖酸的分子量分布.对去除机制作了初步探讨.结果表明,在单级活性污泥处理系统中,不同浓度的腐殖酸均未对可生物降解有机物的去除构成影响,并且腐殖酸的去除率维持在67%-84%.随进水中腐殖酸浓度的增加去除率有所下降;通过两级活性污泥法试验.发现第l级活性污泥系统对腐殖酸的去除效果优于第2级.分别为71.3%和60.1%.且活性污泥系统对大分子量腐殖酸的去除效果优于小分子量腐殖酸.机制分析表明,腐殖酸难以作为微生物生长所需的碳源.主要依靠污泥吸附的方式,使水相中的腐殖酸进入泥相,再通过剩余污泥排放的方式去除.     

城市污水中病原性大肠埃希氏菌毒力基因eaeA和rfbE的实时荧光定量PCR检测

针对病原性大肠埃希氏菌EHEC和EPEC的毒力基因eaeA和rfbE,选用特异性引物,建立了实时荧光定量PCR检测方法. 利用从污水中分离出的目的核酸片段构建重组质粒,通过测序和BLAST比对分析,确定了PCR扩增的特异性. 将重组质粒作为模板,分别测定标准曲线,在eaeA基因模板量8.77～8.77×105 copy,rfbE基因模板量4.98～4.98×105copy的范围内,Ct(循环阈值)与模板量的对数值具有良好的线性关系〔R2为0.997(eaeA)和1.000(rfbE)〕. 结合膜吸附洗脱浓缩方法,对于实际水样,eaeA和rfbE基因的检测限分别为1.75×102和9.96×101copy/100 mL. 利用该方法对城市污水处理厂进、出水进行检测的结果显示,污水二级处理工艺对这2种毒力基因的去除效果明显.      

金属离子屏蔽腐殖酸对污泥厌氧消化抑制作用实验研究

以实验室培养、几乎不含腐殖质和金属离子的剩余污泥为研究对象,选择与市政污泥中腐殖酸特征相近的市售腐殖酸作为外加填充腐殖质,通过投加外源金属离子实验研究屏蔽腐殖质对污泥厌氧消化过程的抑制作用.结果表明,单独投加Ca2+与Al3+可分别获得65.4%和65.7%的屏蔽抑制率;Ca2++Al3+组合投加效果更佳,可获得高达80.1%的屏蔽抑制率,具有"1+12"的屏蔽抑制效果.然而,过高的金属离子含量(或组合含量)不仅无助于进一步提高屏蔽抑制效果,反而会因抑制微生物活性而导致屏蔽抑制率下降.Ca2+通过阳离子交换产生屏蔽抑制作用,而Al3+主要靠静电作用和网捕卷扫作用产生屏蔽效果.在屏蔽腐殖酸抑制方面,三价金属离子好于二价金属离子的原因是两者的静电作用力大小、作用方式、环境效果不尽相同.     

腐殖酸和产甲烷抑制剂对厌氧污泥发酵产氢效能的影响

为提高厌氧污泥的发酵产氢能力,采用间歇培养方式考察了不同产甲烷抑制剂与腐殖酸联合作用对厌氧污泥发酵葡萄糖产氢效能的影响,并通过Illumina MiSeq测序揭示了微生物群落结构的变化规律.结果表明,在葡萄糖初始浓度为500 mg·L-1条件下,经过120 h的连续培养后,对照的累计产氢量为1.2 mL,存在明显的耗氢...     

Intercross real-time control strategy in alternating activated sludge process for short-cut biological nitrogen removal treating domestic wastewater

To develop technically feasible and economically favorable dynamic process control(DPC)strategies for an alternating activated sludge(AAS)system,a bench-scale continuous-flow alternating aerobic and anoxic reactor,performing short-cut nitrogen removal from real domestic wastewater was operated under different control strategies for more than five months.A fixed-time control(FTC) study showed that bending-points on pH and oxidation-reduction potential(ORP)profiles accurately coincided with the major biolo...     

腐殖酸影响剩余污泥厌氧消化过程实验研究

以实验室培养、几乎不含腐殖质和金属离子的剩余污泥作为研究对象,选择与市政污泥中腐殖酸特征相近的市售腐殖酸为外加填充物,实验研究污泥中所含腐殖质对污泥厌氧消化过程的抑制作用.通过设置腐殖酸不同投加比例(0、5%、10%、15%和20%,以VSS计),探究腐殖酸对厌氧消化不同过程的影响.实验结果表明,腐殖酸抑制厌氧消化生物气产气量.填加15%腐殖酸时对厌氧消化产气量抑制作用最为明显,较未添加腐殖酸对照组产气量下降了35%;但并未对生物气中CH_4体积比产生太大影响,说明抑制影响是对生物气整体性的.腐殖酸亦可抑制厌氧水解过程,投加20%腐殖酸实验组实验结束时残留于上清液中的溶解性多糖、蛋白质浓度分别是对照组的2.2和1.6倍.然而,腐殖酸作为外源电子受体,可以在一定程度上促进酸化过程,其程度在填加20%腐殖酸实验组表现最高,较对照组VFAs提高了11.3%.腐殖酸投加未对系统pH产生明显影响,各实验组pH值均在7.09~7.54间变化.     

接种外源微生物生活垃圾堆肥中的胡敏酸荧光特性

利用城市生活垃圾接种外源微生物,采用工厂化工艺进行堆肥,对堆肥前后胡敏酸荧光光谱进行了分析．结果表明,胡敏酸发射光谱相对简单,在440nm附近形成1个较宽的谱带,而激发光谱与同步扫描光谱则由几个特征峰及肩峰组成．对不同荧光光谱特征峰的分析表明,堆肥结束后,胡敏酸的腐殖化程度明显增加．CK、MS、ZJ、MS＋ZJ各处理的荧光光谱形状基本相似,但主要特征峰的相对荧光强度有明显区别．其中接种外源微生物可明显增加堆肥胡敏酸分子的缩合度,中加酵素菌（ZJ）处理优于美商复合菌（MS）处理,而2种外源菌混合接种具有协同促进作用．通过与土壤中胡敏酸荧光特性比较证实,堆肥后的胡敏酸具有土壤富里酸的特征,活性较高．     

活性炭负载纳米TiO2对腐殖酸光催化降解动力学

采用溶胶-凝胶法制备了以颗粒活性炭(GAC)为载体的纳米TiO2/AC复合催化剂,并将其用于腐殖酸的光催化降解.动力学研究表明,TiO2/AC光催化降解腐殖酸过程可用Langmuir-Hinshelwood(L-H)动力学模式表示.L-H表观反应速率常数KLH=0.1124mg·L-·1min-1,吸附平衡常数K*=0.3402L·mg-1.活性炭负载TiO2对腐殖酸的光催化降解过程,体现了活性炭与TiO2的协同作用,活性炭的吸附作用提高了光催化反应速率.     

次氯酸钙预处理对污泥厌氧发酵合成中链脂肪酸的影响研究

探究了次氯酸钙(Ca(ClO)₂)预处理对活性污泥厌氧发酵合成中链脂肪酸(MCFAs)的影响,结果表明Ca(ClO)₂能显著提高污泥的降解性能,且发酵液中可溶性有机物增量与Ca(ClO)₂浓度梯度呈正相关.当预处理浓度为80 mg·g^-1时,产出MCFAs浓度达到峰值(5691.9 mg·L^-1),是空白组的2.6倍.然而,更高Ca(ClO)₂(240 mg·g^-1)预处理浓度下其对污泥中的微生物过程(水解、酸化过程)的抑制作用导致MCFAs产出浓度有所降低.本研究为拓展污泥高值化处理技术提供了新思路.     

颤蚓对活性污泥沉降性能的影响

系统考察了低、中、高3种不同污泥浓度下(TSS≈4 g·L-1、6 g·L-1和8 g·L-1),一定的颤蚓投加比例对活性污泥沉降性能的影响,并同时考察了颤蚓对污泥特性的影响.研究结果表明,投加颤蚓后60min内,活性污泥沉降速率明显加快,60min时的污泥容积相对于未投加颤蚓前可减少8%～42%;而且.这种效应对污泥浓度高的活性污泥更为显著和有效.然而.通过对污泥特性的分析表明,颤蚓在短时间内(1～3h)对污泥平均粒径、Zeta 电位并无多少影响;此时污泥容积指数(SVI)和胞外聚合物含量(EPS)却反而略有增加.     

ToxTell生物传感器在Cu2+、Zn2+冲击活性污泥系统分析中的应用

探讨了不同浓度Cu2+及Cu2+和Zn2+联合对活性污泥系统CODCr去除的影响,并采用ToxTell生物传感器,以活性污泥为指示微生物,分析了上述金属离子的毒性抑制作用.结果表明,Cu2+浓度为5mg·L-1时,其对活性污泥工艺CODCr去除存在一定的促进作用,随着Cu2+浓度的增加,其对CODCr的去除的抑制作用逐渐增强;Cu2+及Cu2+和Zn2+对活性污泥系统在抑制时间为1.5h时达到最大抑制状态,但随着曝气时间的延长,CODCr去除率呈逐渐上升趋势.ToxTell生物传感器对Cu2+和Zn2+的混合毒性具有良好的分析性能,其毒性分析结果与活性污泥工艺中CODCr的去除抑制率具有良好的一致性,初步证实该生物传感器能很好地用于活性污泥处理系统受Cu2+和Zn2+冲击的预警监测.