西藏米拉山高寒草甸土壤微生物DNA提取及宏基因组Fosmid文库构建

青藏高原土壤中富含特殊的微生物资源,因大多数未能得到培养而无法利用.提取微生物总DNA及构建宏基因组文库的方法是研究未培养微生物的重要方法(免培养法).两藏米拉山高寒草甸土壤中腐植酸、有机质含量非常高,DNA提取非常困难,本研究表明卣接法提取该样品的DNA片段小,杂质含量高,不能满足构建大插入片段文库的要求;结合低速离心和Nycodenz密度梯度离心先分离出微生物细胞的间接法虽然DNA产率降低,但是纯度高,片段长,多样性丰富,更适合于构建大插入片段文库.在间接法提取高质量西藏高寒草甸土壤微生物DNA的基础上,成功构建了一个包含30 624个克隆、库容量超过1 Gb、稳定性好的宏基因组Fosmid文库,为从西藏高原土壤中挖掘和利用新的功能基因研究奠定了基础.图7表3参27     

大熊猫基因组微卫生DNA的分离与序列分析

以pBS^ 为克隆载体,构建圈养大熊猫基因组DNA的小插入文库,分别用生物素标记的（CAC）5和γ-^32P-dATP标记的（CA）15寡核苷酸为探针,对重组质粒进行斑点杂交,获得15个阳性克隆,并测定了插入片段的DNA序列,其中有一部分序列已被分析,本文对剩余的8个DNA序列进行分析,发现它们大小不一,从259bp-881bp,有6个序列含有不同重复单位的一、二、四核苷酸的完整串联重复,斑点杂交和Southern杂交证明,这些序列均来自大熊猫基因组,上述结果为利用PCR技术研究大熊猫遗传多样性和了解大熊猫基因组结构积累资料。     

一种经济、简单的微生物基因组DNA的提取方法

获得一定浓度和纯度的DNA是进行分子生物学研究的基础。破解细胞壁与细胞膜是获得基因组DNA的前提，而蛋白质和核酸物质的分离是获得高质量DNA产物的关键。目前，主要采用的破壁方法有：冷冻研磨法、溶菌酶法、EDTA测等，这些方法一般采用复杂的裂解液体系，并借助蛋白酶K和RNA酶的帮助来获得高质量的抽提产物。由于细胞裂解体系不仅配制十分麻烦，而日部分药品有毒操作危险性大，此外部分药品及相关酶试剂价格昂贵。本文充分利用DNA在不同温度下自身可变性与复性的特性和在高盐与高温条件下蛋白质能够变性并沉淀。以无菌的SDS（c／c=20％）和NaCl（c/c=8％）的混合液作裂解体系，在沸水浴中破壁膜并使得部分的蛋白质变性和DNA变性并得到初步分离；随后在60℃和72℃水浴中使变性的DNA复性和重新凝聚，同时让RNA、蛋白质和细胞壁碎片等杂质降解或沉淀，从而获得高质量的DNA产物。     

Al13形态分离纯化方法的初步研究

对ＳＯ＾２－４／Ｂａ＾２＋法分离提纯Ａｌ１３形态的影响因素进行了研究,实验结果表明,聚合铝浓度、ＳＯ４／Ａｌ比、Ｂａ／ＳＯ４摩尔比、以及超声反应时间对分离效果上具有较大的影响。较高浓度的聚合铝利于沉淀的形成与分离。同时选用１：１的ＳＯ４／Ａｌ与Ｂａ＾２＋的共存对形态分析不产生影响,形态鉴定结果表明,经过上述分离条件所得产物形态为Ａｌ１３。     

鲤鱼肝胰脏线粒体DNA的分离,纯化方法

取活鲤鱼肝胰脏，经冲洗后，立即投入液氮中，然后制成匀浆，先在４℃下６００ｇ离心，保留上层液，再９００ｇ离心，保留沉淀物并用不同游泳重复悬浮洗涤离心，可得互比较纯的线粒体。将上述粒体在含１％ＳＤＳ的Ｓａｌｉｎｅ－Ｎａ２ＥＤＴＡ溶液中悬浮，于３７℃反应１５ｍｉｎ，然后在室温用混合溶剂萃到，先后用乙醇洗涤７００ｇ，１２００ｇ离心，待用电泳检查ＲＮＡ除净后，加少量蛋白醇－Ｋ除去其余蛋白质，最终获得比较的Ｄ     

大杯伞凝集素的分离纯化及其性质

大杯伞子实体经生理盐水抽提、硫酸铵分步沉淀、DEAE -Sepharose和SephadexG - 10 0柱层析纯化得到大杯伞凝集素 (Clitocybemaximalectin ,CML) .CML经PAGE显示单一条带 ,SDS -PAGE测得其亚基相对分子质量为4 9× 10 3 ,SephadexG - 10 0凝胶过滤测得相对分子质量为 4 9× 10 3 ,CML不含糖 ,等电点为 4 .82 .该凝集素对小鼠脾脏淋巴细胞、小鼠S180 肉瘤细胞和人的A、B、O和AB型血细胞具有凝集作用 ,对兔红细胞的凝集作用可被半乳糖 (galac tose)所抑制 .氨基酸组成分析表明 ,CML含有 16种氨基酸 ,其中天冬氨酸 (asparticacid)、谷氨酸 (glutamicacid)和亮氨酸 (leucine)含量较高 .CML对热、酸碱具有一定的稳定性 ,经 6 0℃处理 10min ,仍有较高的活性 ,在pH 5～ 8范围内较稳定 ,其凝血活性受Mg2 、Ca2 、Zn2 和Mn2 二价阳离子的影响 .CML对小鼠腹腔注射的半致死量为 2 5 .70mg/kg.图 4表 7参 14     

重金属污染土壤的微生物生态效应及其修复研究进展

污染土壤微生物生物修复技术是一项非常有应用前景的环保新技术。本文综述了近年来重金属对土壤微生物生物量、种群及生化过程的影响以及微生物对重金属污染土壤的修复机理和修复研究进展,较全面的分析了重金属对土壤微生物的生态效应。     

冰川环境耐冷菌的冷适蛋白酶分离纯化及酶学性质

采用离交和凝胶层析对“中国冰川1号”耐冷菌BacilluscereusSYPA23所产的蛋白酶进行分离纯化,并进行酶学性质研究.与中温酶相比,该蛋白酶具有较高的低温催化活力,其最适催化温度为42℃,适宜pH为7.0～8.5,SDSPAGE测定的分子量(Mr)为34.2×103.金属离子Mn2 、Ca2 对该酶有激活作用,Cu2 、Hg2 、Pb2 、Co2 对其活性有一定抑制作用.该酶属金属蛋白酶,其活性受EDTA强烈抑制,不受PMSF抑制.该蛋白酶具有低温酶典型的热不稳定性,0℃下半衰期24h,但Ca2 和一些低分子醇类物质能提高其稳定性.动力学数据分析表明,该蛋白酶在低温下对底物亲和能力高,在较宽温度范围内(25～45℃)均保持着较高的催化效能.图7表3参17     

生孢噬纤维菌荚膜多糖的分离纯化及其性质

生孢噬纤维菌(Sporocytophaga)是能降解纤维素的滑动细菌,它可将滤纸和棉花纤维素完全降解.本文对生孢噬纤维菌产生的荚膜多糖的分离纯化以及性质进行了研究.以滤纸平板法培养生孢噬纤维菌,加入1%苯酚后,荚膜多糖溶解在水相中,再经氯化十六烷基吡啶(CPC)沉淀,分离出荚膜多糖提取物.利用Sephadex G-75柱层析法、胰蛋白酶和Sevag法对荚膜多糖提取物进行纯化;并利用比旋光度检查、红外光谱、液相色谱以及气相色谱等分析手段对精制后的荚膜多糖进行分析.结果表明,分离纯化得到了纯度较高的生孢噬纤维菌荚膜多糖.Sephadex G-75柱层析分析表明,荚膜多糖提取物中含有结合蛋白,除去结合蛋白后,多糖分子量约为6.5×103;气相色谱分析表明,该荚膜多糖主要由Gal、Glc、GlcA以及Man等单糖组成,其比值约为3.513.33.61;同时该荚膜多糖的红外光谱显示,该多糖所含的甲基、亚甲基等基团的量比正常多糖多;红外光谱图中881cm-1处的峰位显示,该多糖含有不典型β糖苷键特征吸收峰.图5参8     

高位池养虾对土壤微生物脂肪酸和土壤酶活及其表征的土壤质量的影响

为评价高位池养虾对土壤质量的影响,通过脂肪酸分析和土壤酶活测定比较海南岛白马井镇高位池土壤与原始土壤微生物群落结构与活性的变化.结果显示,高位池土壤的pH值和盐分含量显著升高,有机质和总N显著下降(P<0.05).脂肪酸分析表明,高位池土壤中细菌、真菌、放线菌和微生物总量都显著下降(P<0.05),尤其真菌急剧下降(P<0.05),放线菌未检测到.土壤脱氢酶、脲酶和酸性磷酸酶活性在高位池土壤中也显著下降(P<0.05).总之,微生物群落结构显著变化,微生物生物量和活性在高位池土壤中都显著下降,表明长期的高位池养虾导致了土壤质量的下降.     

从顽拗植物荔枝中提取基因组DNA技术的研究

针对荔枝体内含有大量影响ＤＮＡ提取质量的多酚等次生代谢物质的特点,在常规ＳＤＳ和ＣＴＡＢ提取方法的基础上做了技术改进,即在核裂解之间先破碎细胞,将存在于细胞质中次生物质除去后再裂解细胞核,同时加入活性炭以吸咐杂质反复清洗几次后加入核型解液释放基因组ＤＮＡ,纯化之后经外观和电泳检测,以及Ｄ２６０ｎｍ和Ｄ２８０ｎｍ比值的测定,限制性内切酶反应,ＰＣＲ扩增的结果表明,用改进方法提取的ＤＮＡ无论在纯度上还     

真菌核酸的一种快速提取方法

在总结多种真菌DNA和RNA提取方法的基础上，发展了一种提取真菌核酸新方法，与其它方法相比，该方法具有快速、操作简便等特点，而且提取DNA和RNA步骤基本一致，用该方法提取的DNA完整、纯度高，可用于PR、限制性内切酶酶切和Southern杂交等分子生物学操作；提取RNA产量高，RNA无降解，纯度高，适用Northern和cDNA合成等分子生物学操作。     

植物根瘤内痕量Frankia DNA的提取及鉴定

建立了一种简捷、快速植物根瘤内痕量Frankia DNA的提取方法,即采集自然态下根瘤,剥离瘤瓣,取瘤瓣尖经液氮研主民粉末,以20g/L CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）消化胞壁,然后以d=5-10μm的石英粉吸附DNA,再以无菌去离子蒸馏水释放DNA,所获DNA产率及纯度较酚／氯仿法好。经对辽宁沙棘、色赤杨根瘤的瘤内痕量Frankia DNA及体外培养的9种Frankia菌株DNA分纯,并用于酶切及PCR,获满意结果。图3参12     

经DNA改组的植酸酶纯化和酶学性质

经DNA改组的重组植酸酶通过有机膜超滤、DEAE -SepharoseF .F离子交换层析两步纯化 ,其纯度可达90 %左右 .SDS -PAGE分析表明 ,重组植酸酶的分子量Mr 约为 85 0 0 0 .酶学实验结果表明 :该酶反应最适pH为 4 .5 ,最适温度为 4 0℃ ,Km为 0 .11mmolL-1,Vmax为 96 4mmolL-1min-1,植酸酶活性不依赖任何金属离子的存在 .向酶液中分别添加MgSO4、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、蔗糖及葡萄糖 (10 0 g/L)后 ,植酸酶在 90℃处理 10min的活性比对照增加了 1～ 3倍 ,说明这些物质为酶保护剂 ;在 37℃下以植酸钠为底物的SDS对酶活性具有强烈的抑制作用 ;金属离子如Cu2 ,Zn2 ,K 以及EDTA对酶活性具有较弱抑制作用 ;金属离子如Mn2 ,Mg2 、Fe2 、Ba2 、Ca2 、Co2 低浓度时对酶活性有促进作用 ,当Mg2 浓度增加到 10mmolL-1时 ,则对酶活性起抑制效应 .图 4表 4参 19     

粘粒和阳离子交换量对土壤中钍形态分布的影响

利用连续萃取程序和加入外源化合物进行培养的方法,考察了土壤阳离子交换量(CEC)和土壤粘粒矿物含量的变化对土壤中钍形态分布的影响,随着CEC的增加,土壤中非残留态钍增加,而稳定态钍降低.随着土壤粘粒矿物含量的增加,土壤中残留态钍的含量明显增加,非残留态钍含量降低.     

气相抽提去除红壤中挥发性有机污染物的去污机理探讨

通过探讨土壤气相抽提去除红壤中挥发性有机污染物的去污机理,建立了一维稳态条件下污染物在土壤多孔介质中传质的总微分方程,分别求出了平衡模型和动力学模型的解析解和数值解,并用实验结果对平衡模型和动力学模型进行了模拟和验证.实验结果和模型模拟结果表明理论模型与实验结果吻合良好,平衡模型和动力学模型在描述污染物在土柱通风过程中的传质时,分别适用于不同的阶段.在通风初期平衡模型能够很好地描述实验结果,而随着时间的推移,平衡模型的预测曲线逐渐偏离数据点,到了通风中后期,只有动力学模型才能够较好地描述和预测实验结果.     

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶的分离纯化及酶学性质

以苏云金芽胞杆菌为材料 ,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE - 32离子交换柱层析初步纯化 ,获得比活力为15 0 .5Umg-1的酶制剂 .研究酶催化胶体几丁质水解的反应时间和酶量对酶活力的关系 ,探讨酶催化胶体几丁质的最适条件 .温度和 pH对酶活力的影响和酶的热稳定性及酸碱稳定性的结果表明 :酶催化胶体几丁质水解的的最适pH为 5 .6、最适温度为 5 8℃ .该酶在pH 4 .5～ 6 .5区域稳定 ,而在pH >8能很快失活 ;在 5 5℃以下处理 30min ,酶活力保持不变 ;高于 5 5℃ ,酶快速失活 .图 5参 11     

川牛膝多糖的分离、纯化及单糖组成

采用水提醇沉法提取川牛膝多糖粗品CPC，经685弱碱阴离子交换柱层析和Bio—Gel P2凝胶柱层析进一步纯化，得到川牛膝多糖RCP(xefined Cyathula officinalis Kuan polysaccharide)．紫外扫描、高效液相色谱、聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳证明RCP为均一组分．质谱图显示RCP的分子量(从)主要分布在1000-2200．薄层正交试验确定了RCP完全水解的最优条件．薄层层析及高效液相色谱—蒸发光散射检测(HPLC—ELSD)技术揭示，RCP单糖组成为D-果糖和D-葡萄糖．图11表2参18     

大鼠类Alu重复序列的克隆及其在染色体DNA突变分析中的应用

从大鼠低Ｃｏｔ值ＤＮＡ文库分离到一种类Ａｌｕ的重复序列,命名为ＲＡＬＲＳ－１。对ＲＡＬＲＳ－１克隆并进行了测序,长度为２８３ｂｐ,发现其中含有单一的微卫星（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）序列ＡＧ,ＡＧＧ和ＡＧＧＧ。ＲＡＬＲＳ－１ＤＮＡ序列在大鼠单倍体基因组中的拷贝数为１５００００～３３００００。依ＲＡＬＲＳ－１中的一段序列合成了一２８寡核苷酸探针（ＡＧＧＧ）７,对大鼠正常组织和肿瘤组织ＤＮＡ指数谱